癌症研究。作者手稿；PMC 2008年1月4日提供。
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Bcl-2过度表达提高肿瘤特异性T细胞存活率
马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所外科分所
转载请求：马里兰州贝塞斯达中心大道10号楼NIH国立癌症研究所外科分院Jehad Charo，邮编：20892。电话：301-496-9383；传真：301-496-0011；电子邮件：ed.nilleb-cdm@orahc.j 摘要
尽管基于肿瘤特异性T淋巴细胞过继转移的免疫治疗已被证明在一些患者中产生了显著的临床反应，但过继转移细胞的植入水平和持续性相对较低可能会限制许多患者的这些反应。为了制定延长过继转移T细胞存活时间的策略，我们进行了一些研究，其中从健康供体获得的T细胞以及肿瘤特异性T细胞被转导了一种表达人类Bcl-2基因的逆转录病毒。我们的结果表明，与用表达绿色荧光蛋白的逆转录病毒转导的对照T细胞相比，这些转导的T细胞过度表达Bcl-2，对死亡具有抵抗力，并且在退出白细胞介素-2后具有生存优势。肿瘤特异性T细胞过度表达Bcl-2，维持了其对靶细胞的特异性识别和反应能力。此外，我们发现，通过在黑色素瘤特异性T细胞受体转基因T细胞中过表达Bcl-2，可以显著增强已建立的B16肿瘤的过继免疫疗法。我们的数据表明，使用Bcl-2修饰的肿瘤反应性T细胞可以增强癌症患者的过继免疫治疗方法。
介绍
过继免疫治疗可以通过以肿瘤浸润性T淋巴细胞（TIL）的形式转移肿瘤特异性T细胞及其生长因子白细胞介素-2（IL-2；参考文献。1,2). 然而，过继转移的肿瘤反应性T细胞的低效率植入和持续存在似乎是限制这些反应的因素之一(2–4). 在一些接受非清髓性化疗方案预处理的患者中观察到的多发性转移病灶的几乎完全消退似乎与过继转移的肿瘤反应性T细胞的长期存在有关(4). 缺乏足够水平的T细胞生长因子（如IL-2）可能导致转移的T细胞死亡(5,6)，但高剂量IL-2的使用受到该细胞因子毒性的限制(1). 目前正在探索几种提高转移T细胞存活率的替代方法(4,7,8).
最近的研究表明，细胞因子IL-2或IL-15的退出导致的T细胞死亡伴随着低水平抗凋亡基因的表达，如Bcl-2(6,9–12). 研究还表明，由于生长因子的退出而导致的细胞死亡是通过一种内在的死亡途径实现的，这种途径在Bcl-2过度表达的细胞中被阻断(5,9,10,13–15). 因此，我们假设T细胞内抗凋亡蛋白的过度表达可以促进缺乏必要生长因子刺激的细胞存活。
在目前的研究中，我们检测了Bcl-2过度表达对肿瘤反应性T细胞的影响。结果表明，在细胞因子退出后，Bcl-2的过度表达提高了人类肿瘤反应性T细胞的存活率。此外，Bcl-2的过度表达增强了体内小鼠肿瘤反应性T细胞在模型过继免疫治疗系统中的疗效。
材料和方法
细胞系和克隆
本研究中使用的T细胞系和克隆列于TIL系在含有3000个国际单位（IU）的人IL-2/mL（完整培养基-2；IL-2由加利福尼亚州埃默里维尔市Chiron提供）的完整培养基中生长（RPMI 1640补充10%的胎牛血清、L-Glu、β-巯基乙醇和抗生素，均来自Gibco、Invitrogen、Carlsbad）。根据制造商的程序，通过Ficoll-Hypaque梯度（淋巴细胞分离培养基，Organon Teknika，北卡罗来纳州达勒姆）离心法，从健康献血者（NIH，Bethesda，MD，输血医学部）的血液中收集冷冻保存的外周血单核细胞。用10 ng/mL CD3（ORTHOCLONE OKT3，Ortho Biotech，Bridgewater，NJ）和600 IU IL-2/mL刺激外周血单个核细胞(16). 三天后，细胞被转导，如下所述。T细胞克隆在600 IU IL-2/mL的完整培养基中生长。转导前一周，使用快速扩增方案刺激和扩增T细胞克隆，如前所述，该方案是在异体饲养细胞存在下用OKT3刺激T细胞来实现的(17).
表1
本研究中使用的T细胞系和克隆的特异性、命名和转导效率
| T细胞/TIL/克隆* | 特异性† | 限制‡ | 用 | 指定的 | 转导效率（%）§ |
|---|
| PBL-T1型 | 纳|| | 纳 | 金属惰性气体（MIG） | PT1-G型 | 55 |
| | | MIG-Bcl公司 | PT1-B型 | 40 |
| PBL-T2型 | 纳 | 纳 | 金属惰性气体（MIG） | PT2-G型 | 22 |
| | | MIG-Bcl公司 | PT2-B型 | 39 |
| TIL（1931-2F4） | 3月1日(27-35) | HLA-A2型 | 金属惰性气体（MIG） | 1931-G年 | 15 |
| | | MIG-Bcl公司 | 1931-B年 | 25 |
| TIL（1749年） | 3月1日(27-35) | HLA-A2抗原 | 金属惰性气体（MIG） | 1749-G年 | 24.4 |
| | | MIG-Bcl公司 | 1749-B年 | 35 |
| Cl-2 1290（CD4） | KI-67型 | DR-16型 | 金属惰性气体（MIG） | 氯-2-G | 13 |
| | | MIG-Bcl公司 | 氯-2-B | 19.4 |
| 氯-8-1541（CD4） | 酪氨酸酶相关蛋白-2 | DR-15型 | 金属惰性气体（MIG） | 氯-8-G | 7.2 |
| | | 金属焊条惰性气体Bcl | 氯-8-B | 14.5 |
| D4F12（CD8） | GP100（209-217） | HLA-A2抗原 | 金属惰性气体（MIG） | D4-G公司 | 20 |
| | | MIG-Bcl公司 | D4-B型 | 25 |
| C22（CD8） | 目标-1 | HLA-A2抗原 | 金属惰性气体（MIG） | C22-G型 | 14.2 |
| | | MIG-Bcl公司 | C22-B型 | 28.5 |
逆转录病毒的构建及高产克隆的分离
基于改良小鼠干细胞病毒系统MIG的逆转录病毒构建(18,19)由Luk Van Parijs博士（麻省理工学院，马萨诸塞州剑桥）提供。在本研究中使用的两种结构中，重组基因表达是由小鼠干细胞病毒长末端重复序列驱动的。在第一个结构中，一个编码绿色荧光蛋白（GFP）的cDNA被插入IRES序列的下游，称为pGFP，在第二个结构中GFP cDNA之后是一个IRES，该IRES位于编码人类Bcl-2基因产物的cDNA之前，称为p Bcl。超离心浓缩50倍的高温水疱性口炎病毒G假型逆转录病毒上清液(20)用于感染PT-67细胞系（Clontech，Palo Alto，CA）。使用荧光成像仪（分子动力学，加利福尼亚州森尼维尔）评估具有高GFP表达的高病毒滴度PT-67克隆和这些克隆的上清液用于转染人类黑色素瘤细胞系888(21)提供逆转录病毒滴度的相对估计(22). 一个克隆产生了滴度为2×10的GFP表达病毒（MIG）8转导单位和一个产生GFP和Bcl-2表达病毒（MIG-Bcl）的单位，滴度为4×108选择转导单元产生用于T细胞转导的病毒。
T细胞转导
如前所述，进行了两轮T细胞转导(16). 在饲养细胞存在的情况下，用OKT3刺激T细胞使其扩增(17)1至3周后，使用FACScan（BD，San Jose，CA）基于GFP表达的荧光激活细胞分类分析来估计转导细胞的百分比。然后使用FACSvantage（BD）细胞分选仪对GFP+细胞进行分选。外周血淋巴细胞衍生T细胞和TIL的分选效率很高，在这些研究过程中检测时，80%至90%的分选细胞仍为GFP+。T细胞克隆实现了较低的分选效率，因为只有20%至40%的分选细胞是GFP+。除非另有说明，否则使用分类单元格。将T细胞保存在完整的培养基-2中，每3-4周使用快速扩增方案扩增细胞。
Bcl-2蛋白的检测
使用藻红蛋白结合的人类Bcl-2特异性单克隆抗体（克隆Bcl-2/100，Alexis，San Diego，CA）进行细胞内染色，检测Bcl-2。按照制造商的程序，使用BD的Cytofix/Cytoperm试剂盒固定和渗透细胞，并使用FACScan进行流式细胞术分析。
细胞凋亡诱导及T细胞存活率的评估
通过在1μg/mL植物血凝素（PHA）-L（PHA-L，Sigma，St.Louis，MO）存在下将细胞在完全培养基中孵育16小时来测试T细胞对有丝分裂原诱导的细胞死亡的易感性。通过在含有降低浓度IL-2的完整培养基中培养T细胞或在没有外源性添加IL-2的情况下培养T细胞，来测量T细胞对生长因子退出导致的被动细胞死亡的敏感性。根据制造商的说明，通过台盼蓝排除法和藻红蛋白结合的Annexin V（Alexis）染色评估T细胞死亡，并通过荧光激活细胞分选进行分析。所有分析重复进行两次，重复两到五次。活转导的T细胞代表在荧光激活细胞分类分析得出的GFP阳性和Annexin V阴性象限中检测到的细胞。为了计算活细胞的数量，显微镜下对台盼蓝阴性和阳性细胞进行计数，计算每个孔的细胞总数，并将该数字乘以荧光激活细胞分类分析中估计的Annexin V阴性和GFP阳性细胞的百分比。未外源性添加IL-2的培养物中活细胞的比率使用以下公式计算：比率=MIG-Bcl转导T细胞中活细胞百分比/MIG-转导的T细胞中的活细胞百分比。
干扰素-γ生产分析
黑色素瘤特异性T细胞（1–2.5×104)与靶细胞（1×10）共培养5)在200μL完整培养基中，每孔96 W平底板放置16小时（康宁公司，马萨诸塞州阿克顿）。本研究中使用的靶细胞是黑色素瘤细胞系或经EBV转化的B细胞系（EBV-B），其用10μg/mL MHC I类或50μg/mL MHC II类结合肽进行非脉冲或脉冲。根据制造商的协议，对人干扰素-γ（明尼苏达州明尼阿波利斯研发系统）进行了ELISA特异性检测。如前所述进行细胞内细胞因子检测(23). 所有分析重复进行两次，重复两到四次。
小鼠、肿瘤挑战和免疫治疗
C57BL/6 Bcl-2转基因小鼠（马萨诸塞州巴尔港Jackson实验室）与Pmel小鼠杂交(24)表达可识别H-2D中gp100+细胞的转基因T细胞受体b限制方式，导致小鼠携带双转基因T细胞（Pmel-Bcl-2）。同样，将GFP转基因小鼠（Jackson实验室）与Pmel转基因小鼠杂交，得到双转基因T细胞（Pmel-GFP），作为Pmel-Bcl-2细胞的对照。B16黑色素瘤细胞系取自美国国家癌症研究所肿瘤库。小鼠过继免疫治疗模型系统之前已经描述过(24,25). 简言之，患有14天皮下B16肿瘤的小鼠未经治疗或接受以下一种或全部治疗：500 cGy辐射，1×1061周培养的T细胞，接种2×107编码人类gp100的重组鸡痘病毒的斑块形成单位，或注射600000 IU IL-2。每组使用的动物数量为五只。这个实验又独立重复了两次，结果相似。所有实验都是随机进行的，并且是以“盲法”的方式进行的（即，进行测量的人不知道小鼠来自哪个组）。
结果
MIG和MIG-Bcl对T细胞的转导
健康献血者的外周血淋巴细胞衍生T细胞、TIL和CD4+或CD8+肿瘤特异性T细胞均通过MIG或MIG-Bcl逆转录病毒有效转导，无论其来源如何(). 使用MIG病毒获得的平均转导效率为21.4±13.7，而MIG-Bcl逆转录病毒为28.3±8.6().
T细胞转导产生的Bcl-2水平升高
然后检测转导的T细胞群中Bcl-2表达的相对水平。用MIG-Bcl逆转录病毒转导的T细胞()与MIG逆转录病毒转导的T细胞相比，Bcl-2蛋白过度表达(). MIG-Bcl转导产生的Bcl-2蛋白水平是对照GFP转导或非转导T细胞的1.5至2.7倍(和数据未显示）。值得注意的是，在MIG-Bcl转基因人群中，GFP的表达似乎与Bcl-2的表达相关().
Bcl-2的转导导致蛋白质过度表达和对有丝分裂原诱导的细胞死亡的抵抗。PT1-G型(A类和B类)和PT1-B(C类和D类)用藻红蛋白结合的抗人Bcl-2抗体染色(B类和D类)或使用同型和荧光染色匹配抗体(A类和C类). FL-2荧光[藻红蛋白]的几何平均值(体育课)]右上象限显示。PT2-G型(E类–G公司)和PT2-B电池(H（H）–J型)在存在600IU IL-2/mL的完全培养基中培养(E类和H（H）)或在缺乏外源性IL-2的情况下(F类和我)或在缺乏IL-2和1μg/mL PHA的情况下(G公司和J型). 培养16小时后检测到的转导GFP+T细胞（Annexin V阴性）的存活百分比显示在右下象限。
Bcl-2过表达保护T细胞免受有丝分裂原或细胞因子退出诱导的细胞死亡
为了检测Bcl-2过度表达对T细胞存活的影响，对照来自健康供体外周血淋巴细胞（分别为PT2-G和PT2-B）的MIG-Bcl或MIG-Bcl转导的T细胞在不含IL-2的含PHA培养基中培养16小时，并与在含或不含IL-2中培养的T细胞进行比较。PT2-G和PT2-B细胞在有无IL-2的情况下保持，但未经PHA处理，在培养开始16小时后仍保持高度存活(、和我). 用PHA处理T细胞导致大量细胞死亡，因为此时处理的PT2-G细胞只有27%是活的()，但Bcl-2过度表达似乎部分阻断了凋亡，因为68%的PHA处理的PT2-B细胞仍然存活(). 在类似条件下培养48小时后，使用佛波醇12-肉豆蔻酸13-醋酸酯获得了类似数据（数据未显示）。
然后检查Bcl-2过度表达对在缺乏外源性细胞因子的情况下培养的未刺激T细胞存活的影响。在存在300或600 IU/mL IL-2的情况下，用编码GFP的逆转录病毒构建物或编码Bcl-2的逆转录酶构建物转导的60%至75%的外周血淋巴细胞在整个随访期内仍能存活，活细胞百分比没有显著差异(和数据未显示）。在较低IL-2浓度（6-60 IU/mL IL-2）下培养MIG转导的T细胞导致PT2-G、1931-G TIL和Cl-8-G的活性明显下降(–C类和数据未显示）。除6 IU/mL浓度外，MIG-Bcl转导细胞的活性不受IL-2浓度降低的影响(–C类和数据未显示）。在没有外源性添加IL-2的情况下，MIG转导的T细胞的活性在1至2周内持续下降至接近零(–E类). 在相同条件下，MIG-Bcl转导的细胞表现出对被动细胞死亡的抵抗力，其中高达65%的细胞仍能存活(–E类). 在不添加外源性IL-2的完全培养基中培养4周后，10%至20%的MIG-Bcl转导的T细胞保持存活，而在GFP转导或未转导的群体中基本上未检测到存活细胞（数据未显示）。在接受测试的不同T细胞群中，针对黑色素瘤抗原的CD4+T细胞克隆最容易发生被动细胞死亡(和数据未显示）。根据中提供的数据计算在没有外源性添加IL-2的情况下，在CD4克隆中，MIG-Bcl转导T细胞中的活细胞与MIG-转导的T细胞中活细胞的比率最高（第3天的比率为5，第14天的比率≥40），其次是TIL（第14天比率为12），在外周血淋巴细胞衍生T细胞中最低（第7天的比率是7.5，第14天则是6.4）。
Bcl-2诱导的T细胞对被动细胞死亡的抵抗力。PT2-G和PT2-B电池(A类和B类)1931-G和1931-B(C类)、Cl-8-G和Cl-8-B(D类和E类)在0至600 IU/mL外源性添加IL-2的完整培养基中培养，如横坐标所示。3天后分析可行性(D类), 7 (A类)，或14(B类,C类、和E类)天通过Annexin V藻红蛋白染色和荧光激活细胞分选分析。增长(F类)和生存(G公司)PT2-G和PT2-B细胞在完全培养基中培养的曲线(G公司)或存在300 IU IL-2/mL(F类).
在大多数临床环境中，转导的T细胞只占总T细胞数量的一小部分。因此，当MIG-Bcl转导的T细胞约占总T细胞的10%时，我们接下来比较了MIG-和MIG-Bcl转导细胞在存在或不存在外源性添加的生长因子的情况下生存的能力。根据GFP表达进行鉴定，按照材料和方法中的描述计算活转导细胞的数量。在这些实验中，使用了转导效率为9%至10%的PBL-T2细胞，而没有进行任何预先分类。在含有300 IU/mL IL-2的对照培养物中，PT2-G和PT2-B的数量在2周内增加了约10倍(). 在没有外源性添加IL-2的情况下，转导PT2-G细胞的数量在1周内迅速下降，并且在IL-2停药18天后基本上没有存活细胞(). 相反，约50%的转导PT2-B细胞在IL-2退出后1周仍能存活，在第18天，约20%的细胞在没有任何外源性IL-2的情况下存活(). TIL和黑色素瘤特异性CD4+和CD8+T细胞克隆也获得了类似的数据（数据未显示）。
Bcl-2表达水平与被动细胞死亡保护的相关性
根据GFP表达水平，似乎与BCL-2表达水平相关()，在IL-2存在下培养的MIG-Bcl转导的T细胞可分为两个大致相等的群体：GFP昏暗的和GFP明亮的(). 当对活的Annexin V阴性细胞进行门控时，GFP中的活细胞大量丢失昏暗的当培养物中外源性添加的IL-2数量减少或消除时(–F类). 在缺乏外源性IL-2的情况下，GFP明亮的群体代表了存活在培养基中长达4周的大多数活T细胞().
T细胞存活率与Bcl-2表达水平的相关性。PT2-B型(A–C)和1749-B(D–F型)细胞在含有300或30 IU/mL IL-2或不含外源性IL-2的完整培养基中培养。按照材料和方法中的描述，在指定的日期对细胞活力进行评估。直方图上方的数字表示每个标记区域中相对细胞数的百分比。
Bcl-2过度表达不影响黑色素瘤特异性T细胞的功能或特异性
两个主要识别免疫显性MART-1:27-35肽的CD8+TIL与用MART-1或对照gp100:209-217肽脉冲的T2靶细胞共培养。或者，将这些TIL和黑色素瘤特异性T细胞克隆与自体或同种异体黑色素瘤细胞系一起培养。当与MART-1:27-35肽一起培养时，在MIG或MIG-Bcl转导的TIL的上清液中检测到显著水平的IFN-γ，而在对照培养物的上清中未检测到明显水平的IFN-γ(). 与1931-B TIL系相比，1931-G TIL系在MART-1:27-35肽脉冲T2刺激下产生更多IFN-γ(). 相比之下，与1749-G TIL系相比，1749-B TIL系对用MART-1:27-35肽脉冲的T2细胞产生更多IFN-γ(). 同样，1749-B细胞系比1749-G细胞系在自体1749-mel刺激下产生更多IFN-γ（数据未显示）。由于该反应仅反映MHC I类限制性免疫反应，因此在MHC II类限制性T细胞克隆Cl-2 1290（Cl-2）和Cl-8-1541（Cl-8）中研究了Bcl-2过度表达的影响。Cl-2细胞识别外源性()但在HLA-DR16的背景下，与3197至3213氨基酸（SMCLRLKTKSQPAAST）相对应的Ki-67抗原表位没有内源性突变（L代表S，位置3202）。1与Cl-2G T细胞反应相比，Cl-2B产生的IFN-γ略有增加，但不显著(). 识别酪氨酸酶相关蛋白-2表位的第二个CD4+T细胞的抗原反应性(21)在MIG和MIG-Bcl转导后也进行了检测。Cl-8-G和Cl-8-B细胞都具有相同的特异性并产生类似量的IFN-γ以响应用CIITA转导以上调HLA II类表达的自体888 mel细胞，但对HLA-DR匹配但酪氨酸酶相关蛋白-2不表达的888 EBV-B细胞系无反应或用对照KI表位脉冲().
Bcl-2过度表达的T细胞保持其功能活性和特异性。1931-G和1931-B的IFN-γ释放ELISA(A类)、1749-G和1749-B(B类)、Cl-2-G和Cl-2-B(C类)或Cl-8-G和Cl-8-B(D类)效应细胞。横切面，靶点要么未脉冲化，要么用对照肽或相关肽脉冲化。E、，Bcl-2过表达肿瘤特异性T细胞效应器反应的定量测量。通过使用抗干扰素-γ抗体对渗透性细胞进行荧光细胞分析，估计1749-G和1749-B细胞识别所示靶细胞的百分比。
为了进一步量化MIG-和MIG-Bcl转导的T细胞的反应，我们使用细胞内细胞因子检测法监测了IFN-γ对靶细胞刺激的免疫反应。该试验的结果与ELISA结果相关(和数据未显示）。1749-B和1749-G TIL系对MART-1:27-35肽脉冲T2细胞刺激产生IFN-γ，但对未脉冲或用对照肽脉冲的T2细胞没有反应(). 1749-B和1749-G TIL系在自体黑色素瘤刺激和HLA-A2匹配黑色素瘤624.38刺激下也产生IFN-γ，但不产生HLA-A2缺失变体624.28，两者均来自624黑色素瘤(). 使用细胞内细胞因子检测试验获得的结果与使用细胞因子释放试验比较1931-G与1931-B或Cl-8-G与Cl-8-B细胞的反应时获得的结果相似（数据未显示）。
黑色素瘤特异性T细胞过度表达Bcl-2提高免疫治疗效果
Bcl-2表达增加对体内然后，在使用Pmel细胞的小鼠过继免疫疗法模型中，通过比较Pmel-Bcl-2与Pmel-GFP或Pmel细胞治疗已建立肿瘤的能力来检测免疫反应(). 携带14天已建立的s.c.B16黑色素瘤的小鼠未接受任何治疗或以下任何单独或联合治疗：通过照射（X射线治疗）去除淋巴组织，接受过继转移来自Pmel、Pmel-Bcl-2或Pmel-GFP小鼠的单或双转基因T细胞，接种鸡痘（F）或注射IL-2（I）。在这些不同的治疗方案中，最有效的方案是将Pmel-Bcl-2双转基因T细胞转移到淋巴衰竭的受体中，然后接种疫苗和给予IL-2，这导致转移后2周几乎完全消退。与过继转移Pmel-GFP双转基因T细胞的类似治疗导致与过继移植Pmel细胞的治疗效果相似的持久性较差的治疗效果。其他治疗方案的疗效甚至更低。当使用Wilcoxon秩和检验比较肿瘤图时，结果表明Bcl-2–过表达Pmel T细胞受体转基因细胞优于未过表达Bcl-2转基因的Pmel细胞对在所示实验和独立重复实验中均<0.05。这些数据清楚地表明Bcl-2对肿瘤特异性T细胞的治疗效果具有积极影响。
Bcl-2的过度表达增强了过继转移的肿瘤反应性T细胞的治疗效果。将B16黑色素瘤接种于C57BL/6小鼠皮下，14天后接受以下治疗的不同组合：Pmel、Pmel-GFP或Pmel-Bcl-2 T细胞转移、重组gp-100鸡痘疫苗接种（F）、IL-2给药（I）或亚致死剂量照射[X射线治疗（XRT）]。虚线，接受全身照射500 cGy的组。卡尺测量用于确定肿瘤生长。两个独立实验的代表。
综上所述，这些结果表明，肿瘤反应性T细胞系和T细胞克隆中Bcl-2的强制过表达增加了它们对有丝分裂诱导的和被动细胞死亡的抵抗力，但没有改变它们的功能特异性。此外，在小鼠模型系统中的研究结果表明，Bcl-2过表达的肿瘤反应性T细胞在介导肿瘤退行性方面比对照对应T细胞更为有效，并表明Bcl-2在人类肿瘤反应性T细胞中的过表达可能会提高这些细胞的治疗效果。
讨论
多项研究表明，来自健康供体的T细胞可以相对高效地进行逆转录(26). 然而，关于逆转录病毒转导TIL或T细胞克隆的能力，目前只有有限的数据可用(27–29). 在这项研究中，我们发现六种不同的肿瘤特异性TIL和克隆可以用单顺反子和双顺反子逆转录病毒构建体有效转导，这可能允许在没有事先选择的情况下在临床环境中利用这些转导的细胞。
淋巴细胞存活在一定程度上由Bcl-2家族中相互竞争的促凋亡和抗凋亡成员以及其他凋亡相关蛋白的结果控制(9,10,15). 在T细胞发育的不同阶段，可以检测到T细胞中中等水平的Bcl-2表达，在CD4和CD8单个阳性亚群中检测到最高水平(30,31). 记忆型CD8+T细胞表达的Bcl-2水平高于原始细胞，提示Bcl-2表达在维持T细胞存活中起着重要作用(11,12,32). 我们的数据表明，通过逆转录病毒转导激活的人类T细胞而产生的Bcl-2水平的增加可以导致T细胞存活率的提高。这一结果在不同类型的T细胞中一致，但在CD4+T细胞中更为明显。这与最近分析人类和小鼠应答的可用数据一致，表明抗原刺激后扩张的CD8+T细胞似乎比活化的CD4+T细胞维持更长的时间(6,11,12,32). 在其中一项研究中，抗原特异性CD4+记忆细胞表达的Bcl-2水平似乎明显低于抗原特异性CD8+T细胞(32).
有趣的是，对照MIG转导的T细胞的存活时间在体外在缺乏外源性IL-2的情况下，IL-2似乎反映了它们的存活率体内据最近报道，继收养转移之后。当克隆CD8+T细胞输注到患者体内时，从输注日期起1周，在受者的外周血中未检测到显著水平的细胞(三,33)这是大多数MIG转导细胞死亡的日期在体外除非Bcl-2过度表达是转导或补充IL-2的结果。
最近的一项研究结果表明，Bcl-XL（左）人类外周血淋巴细胞的转导并不能保护T细胞免于因IL-2退出而死亡，但在T细胞被添加一种激动性抗T细胞受体抗体触发的情况下，转导可以提供生存优势(34). 我们的研究表明，Bcl-2可能比Bcl-X更有效L（左）尽管这两种蛋白具有高度同源的功能，但仍能保护T细胞免受凋亡死亡。或者，这种差异可能与两项不同研究中获得的这两种抗凋亡蛋白中任一种的表达水平有关。
转导的T细胞系和克隆保持抗原特异性的能力是任何T细胞修饰方案的一个关键方面。抗凋亡和促凋亡基因通常参与其他细胞功能，如激活和增殖(35). 因此，Bcl-2转导的T细胞保持其功能亲和力和良好特异性的能力表明，这些细胞对过继免疫治疗的适用性没有受到损害。MIG-和MIG-Bcl-转导的TIL在对抗原刺激的反应中产生的IFN-γ水平存在差异；然而，这些差异可能是由于组成这些品系的不同T细胞克隆的生长速度发生变化所致。从MIG或MIG-Bcl转导的CD4和CD8克隆获得的数据支持这一点(; J.Charo，初步数据）。
我们研究中用于免疫治疗的各种方案，除了那些涉及双转基因T细胞的方案外，早先已经进行了彻底的讨论(24,25,36). Bcl-2转基因过表达显著增强已建立肿瘤过继免疫疗法疗效的能力可能是由于其促生存特性，这得到了我们的支持在体外数据。Bcl-2的这种作用可以通过多种结果表现出来，包括使效应T细胞发挥其功能和存活肿瘤细胞，抵抗不适应的肿瘤环境，以及这些T细胞独立于协同刺激或其他免疫激活机制可能提供的额外帮助的能力。不太明显的因素可能有助于Bcl-2的这种作用，例如这些细胞抵抗调节性T细胞或免疫抑制细胞因子抑制的能力。
最近一项涉及逆转录病毒转导CD34+细胞的临床试验中白血病的发展突出了这种细胞修饰方法所带来的风险之一(37). 这样一种基因的引入Bcl-2型这与淋巴瘤的发展有关，表明这实际上可能是一种风险。然而，自从15年前人类基因治疗试验问世以来，在使用成熟T细胞时没有观察到此类并发症(29). T细胞淋巴瘤的发展数据证实了这一点，T细胞淋巴瘤在造血早期很容易发生(38,39)这表明，通过逆转录病毒转导对T细胞进行修饰，然后过继转移这些细胞，不太可能导致其他癌症的发生。此外，我们的初步结果表明Bcl-2转导不会导致T细胞永生化。虽然Bcl-2与B细胞白血病的发生有关，但它似乎在T细胞白血病的发展中没有发挥重要作用(38,39). Bcl-2作为转基因的过度表达，即使在T细胞发育的早期阶段，白血病发生的可能性更大，也不会导致前T细胞的积聚，而且据报道，在Bcl-2转基因小鼠中没有出现T细胞白血病(39–41). 一些报告甚至表明，Bcl-2作为转基因的过度表达实际上可能降低T细胞淋巴瘤的发生率(42).
减少T细胞凋亡的替代方法可能是可行的，例如使用小的抑制性RNA靶向T细胞中Bcl-2家族的促凋亡基因成员(43,44). 关于bim公司敲除小鼠制造bim公司对这些研究有吸引力的候选人(45). 小抑制性RNA编码载体中使用的pol III启动子的独特特性也可能有助于防止插入突变，因为这些启动子不转录其终止信号的下游(46).
总之，我们的数据表明，用Bcl-2转导T细胞可以增强其对有丝分裂原诱导的凋亡以及细胞因子撤除诱导的凋亡的抵抗力，而不会显著改变其特异性或功能。这些观察结果还表明，通过对基因改造为Bcl-2过度表达的T细胞进行治疗，可以改善癌症患者的过继免疫治疗。
致谢
我们感谢John R.Wunderlich博士和TIL实验室；Mark E.Dudley博士为这些研究提供了T细胞和黑色素瘤细胞系；Arnold Mixon和Shawn Farid协助荧光激活细胞分选分析；以及Mona El-Gamil、Linda L.Parker、Jennifer A.Westwood和Yong F.Li提供技术援助。
脚注
注：J.Charo目前在德国柏林26号信箱罗伯特·罗斯·斯特拉斯10号麦克斯德布鲁克分子医学中心工作。电话：49-30-94062687；传真：49-30-94062453；电子邮件：ed.nilreb-cdm@orahc.j编辑.
1P.F.Robbins，未公布数据。
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