糖基化可影响膜蛋白的局部发生并揭示转座子内新生多肽的动态重新定向

摘要

我n个高级真核细胞、大多数膜蛋白和分泌蛋白在信号识别颗粒（SRP）的共翻译过程中被疏水信号序列靶向内质网膜¹和SRP受体（有关审查，请参见沃尔特·约翰逊1994;High and Laird 1997年). 多肽的膜插入和移位由Sec61复合物介导，后者形成门控孔(哥里奇和拉波波特1993;Hanein等人，1996年;Hamman等人，1997年)并专门识别信号序列(Mothes等人，1998年). 有助于插入和移位过程的其他成分是核糖体，核糖体与移位孔结合，并在很大程度上将其封向胞浆TRAM（易位链相关膜蛋白）(哥里奇和拉波波特1993;Voigt等人，1996年;Hegde等人，1998年)和BiP，一种伴侣蛋白，与膜腔侧未折叠的多肽结合，并驱动亲水序列通过膜快速转移(Brodsky等人，1995年;Matlack等人，1999年). 信号肽酶复合物和低聚糖基转移酶复合物也与易位密切相关，因为它们能够对易位多肽进行共翻译修饰(Habener等人，1976年;罗斯曼和洛迪什1977;Maurer和McKean 1978). 这些成分在多大程度上影响插入过程和地形形成，以及如何影响，目前基本上尚不清楚。

信号序列可以插入转座子，然后插入膜，其NH也可以插入₂或其COOH末端朝向胞浆(间谍1995). II型膜蛋白的分离信号和信号锚定序列假定N_细胞周期/C类_{外显（exo）}方向，而III型膜蛋白的反向信号抑制剂插入N_{外显（exo）}/C类_{细胞色素氧化酶}方向。几个特征决定了信号的哪一端跨膜转运。最确定的特征是信号疏水核两侧带电残基的分布。在天然蛋白质中，正电荷在细胞溶质剩余的一侧统计上富集（冯·海因1989; 和“费用差异规则”Hartmann等人，1989年). 突变表明侧翼电荷对信号序列的定向很重要；然而，突变蛋白并没有严格遵循电荷规则，并且常常以混合拓扑插入(Beltzer等人，1991年;Parks and Lamb 1991年;Andrews等人，1992年)，表示其他功能共同决定插入过程。这些特征包括信号序列的长度和疏水性。长而疏水的序列有利于NH的易位₂终点(Sakaguchi等人，1992年;Wahlberg和Spiess 1997;尤西比奥等人，1998年;Harley等人，1998年). 此外，NH的快速折叠₂-非极性信号序列之前的末端亲水性片段已被证明抑制NH₂-末端易位(Denzer等人，1995年)。

多跨膜蛋白被认为是通过其第一个疏水信号靶向内质网膜，该疏水信号是一个裂解的信号肽或蛋白质的第一个跨膜段。随后的跨膜结构域以交替方向插入。根据最简单的模型，初始信号定义其自身的方向以及所有后续跨膜节段的方向。后者不需要任何额外信息，只需遵循第一个信号的引导。此“线性插入模型”的证据（最初由布洛贝尔1980)利用嵌合蛋白进行的体外研究提供了这些信息，嵌合蛋白具有两到四个跨膜片段，这些跨膜片段之间由～50–200个残基分隔开(Wessels and Spiess 1988年;Lipp等人1989). 结果表明，信号锚作为停止转移序列插入，仅取决于它们相对于前面疏水片段的位置。

然而，统计数据表明，天然多跨膜蛋白的内部跨膜结构域也遵循电荷规则，尽管比大多数NH的结构域更严格₂-终端信号(冯·海因1989). 这表明随后的跨膜片段也具有拓扑信息。为了支持这一点，将正电荷簇插入模型蛋白的短外质环中，导致单个疏水结构域根本没有跨越膜（“受挫”拓扑；Gravelin等人，1997年). 类似地，葡萄糖转运蛋白Glut1的第一个信号的电荷差的反转不会影响分子其余部分的拓扑结构，但阻止了第一个信号的插入(Sato等人，1998年). 这些研究表明，带电残基也可能影响内部位置的插入过程，并表明多跨蛋白质在其整个序列中包含拓扑学信息。

有趣的是，分离天然蛋白质跨膜片段的亲水序列通常比支持线性插入模型的研究中使用的序列短得多。在这里，我们系统地分析了内部疏水序列相对于其与NH距离的拓扑学贡献₂-终端信号序列。根据所用信号的特征，只有<80个残基的间隔序列才能观察到非线性插入。拓扑发生被发现受到糖基化的影响，揭示了在转座子内定向过程中多肽惊人的构象动力学。

材料和方法

DNA构建

所有构建物均采用PCR和Vent聚合酶（新英格兰生物实验室）进行定点突变。体内表达的最终构建物被亚克隆到载体pECE中(Ellis等人，1986年)并通过测序进行验证。为了构建具有冲突信号的嵌合蛋白，98NH的编码序列₂-流感血凝素的末端残基（株A/Jap/305/57[H2N2]）(Gething和Sambrook 1981年)通过无唾液酸糖蛋白（ASGP）受体亚单位H1 cDNA第4密码子前的连接子序列（Gly-Ser）融合(Spiess等人，1985年). 将位于95位的蛋氨酸密码子突变为异亮氨酸密码子，以消除潜在的内部翻译起始。由此产生的序列编码了一个嵌合蛋白，其中两个ER靶向信号由128个残基的间隔物隔开。以该序列为模板，通过PCR，制备了5′截短片段，包括5′Bgl II位点、间隔序列的COOH末端100、80、60、40或20个残基，以及H1的信号和COOH端剩余物。在这些序列之前，血凝素（H）、人前血管加压素-神经生理学II（V）、牛前催乳素（P）和ASGP受体H1（具有野生型亲水序列A或具有30个残基缺失ΔA）信号序列的cDNA(Beltzer等人，1991年)，如所示图1C、 用BamH I/Bgl II（Gly-Ser）连接产生五系列质粒。结构（如图所示图1A） 命名为指示第一个信号的起源、亲水间隔序列的长度和第二个信号的来源（例如V40A）。没有第二个信号（H20−等）的序列是通过PCR从含有两个冲突信号（H20A等）的预制结构中删除H1信号的整个编码区域而生成的。

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图1

嵌合蛋白及其潜在的插入模式。（A） 由NH组成的融合蛋白的示意图₂-末端信号序列（开放框）、20-100个残基的间隔区序列、内部信号锚（填充框）和具有两个电位的ASGP受体H1的整个COOH末端结构域N个-糖基化位点（开环）。血凝素和ASGP受体的序列分别显示为开放线和填充线。（B） 内质网膜嵌合体的可能拓扑结构。线性插入模型预测劈开NH₂-末端信号，一个易位间隔区，和一个胞质的未糖基化COOH末端（左）。或者，COOH末端易位并糖基化，间隔物保持细胞溶质，NH₂-末端信号是未分离的，要么是整合的，要么就是细胞溶质的（右）。胞浆侧的cyt；外生的，外质的。（C） 不同NH的序列₂-使用的终端信号。H、 血凝素；P、 预激肽；五、 前血管加压素-神经生长素II；A和ΔA，ASGP受体H1及其完整的和截短的亲水性细胞质域。信号分裂位点用点表示。

产生潜力N个-间隔序列中的糖基化位点、IleThrLeu（ITL）、MTM或GS的密码子被插入到信号之间间隔序列H1序列的Asn-13密码子之后的间隔序列中。为了破坏糖基化位点NITL，将Thr的密码子突变为Asn的密码子。为了测试具有天然糖基化位点（NFT）的不同间隔序列，V40A的26–59个残基被H1的61–100个残基取代，从而产生V45（NTF）a。V45（QTF）a中的糖基化位置突变为QTF。

为了生成截断的结构体H55、H75、H95和H115，编码血凝素信号的结构体H 40（NIT）A、H 60（NIT，被抗H1C抗体识别。相应地构造了V55、V75、V95和V115。

结果

具有冲突信号的多肽的插入

为了表征膜蛋白的体内拓扑发生并测试线性插入模型，我们构建了一系列含有NH的嵌合多肽₂-终端分裂信号序列和内部II型信号锚定序列。一名NH₂-将流感病毒血凝素的末端部分及其可裂解信号序列与NH融合₂ASGP受体H1亚单位的末端，这是一种II型膜蛋白。通过连续截短分离两个疏水信号的亲水序列，创建了一系列带有～20、40、60、80和100个残基间隔的结构（H20A、H40A等）(图1A） ●●●●。在野生型环境中，这两个信号中的每一个都有效地引导其COOH末端跨膜移位。根据线性插入模型，NH₂-末端血凝素信号将多肽靶向内质网膜并诱导间隔序列移位。然后，内部H1信号将作为一个停止转移序列进入转座子，并阻止进一步的移位，留下多肽的COOH末端，包括仅有的两个可能的位点N个-糖基化，在细胞质中(图1B、 左）。相反，如果内部信号的拓扑学信息占主导地位，则H1的COOH末端部分将移位和糖基化，而NH末端部分则发生糖基化₂-终端信号将被强制插入相反的N_{外显（exo）}/C类_细胞周期方向或根本无法插入(图1B、 右侧）。

这些结构在COS-1细胞中瞬时表达，并用[³⁵S] 免疫沉淀的蛋氨酸，并通过SDS-gel电泳和荧光分析(图2A） ●●●●。与线性插入模型一致，结构体H100A和H80A产生的单一产物没有被糖基化，这可以从其对内切H脱糖基化的抗性中看出。然而，信号H60A、H40A和H20A之间间隔较短的结构体，产生了越来越多的低电泳迁移率的额外物种。如内切H消化所示，迁移率的变化是由于糖基化引起的。糖化产物和未糖化产物均稳定地整合到ER膜中，因为它们在碱性萃取后在膜芯中回收(图2B） ●●●●。在相同条件下，一种缺乏膜锚（H20-）的控制蛋白被完全提取到可溶性部分中。结果表明，当从NH中分离出<80个残基时，内部信号₂-末端信号，并不总是起到停止转移序列的作用，但能够引导其COOH末端在膜上易位，并将蛋白质锚定在N_细胞周期/C类_{外显（exo）}方向。

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图2

含NH嵌合蛋白的ER插入₂-血凝素的末端信号和ASGP受体H1的内部信号。（A） 转染的COS细胞被标记为[³⁵S] 蛋氨酸作用30分钟。用内切H（+）或不经处理（-）脱糖基后，免疫沉淀嵌合蛋白，并通过SDS-凝胶电泳和荧光分析。（B） 通过碱萃取测试膜集成。将转染的COS细胞进行代谢标记和刮除。其中一半进行了碱提取。然后对所得上清液（S）和沉淀级分（P）以及另一半（总量，T）进行免疫沉淀，并通过凝胶电泳和荧光描记法进行分析。作为可溶对照物，分析了H20−，它缺乏第二个内部信号并分泌到内质网腔中。（C） 在没有第二个信号序列的情况下血凝素信号的转运效率。从结构体H#A中，编码ASGP受体H1内部信号的片段被删除。产生的H#−结构物在COS细胞中表达，代谢标记，并通过免疫沉淀、凝胶电泳和荧光成像进行分析。指出了35和40 kD分子量标记的位置。

虽然内部H1信号的序列背景在所有结构中都是相同的，但血凝素信号的序列环境总是不同的。因此，已知会影响信号序列拓扑偏好的侧翼电荷不是恒定的。15 COOH端子和15 NH之间的电荷差₂-终端侧翼残留物Δ（C–N），定义如下Hartmann等人，1989年血凝素信号在野生型背景下为-0.5。Δ（C–N）在H40A（−1.5）、H60A（−1）和H80A（-1）中更为负值。因此，观察到的插入模式不能简单地用侧面电荷对NH取向的影响来解释₂-终端信号。只有在H20A中，两个信号的侧翼片段大部分重叠的间隔最短的结构体对血凝素信号（+2）的Δ（C–N）阳性，可能有利于NH的易位₂终点站。为了实验性地测试血凝素信号在不同嵌合体中的插入行为，而不受第二个信号的潜在干扰，制作了一系列缺少内部信号疏水部分（H20−、H40−等）的构建物。在所有病例中，COOH末端序列都完全移位和糖基化(图2C） 表明不同的侧翼序列并不影响血凝素信号作为分泌信号的功能。它需要第二个信号的竞争来引起H20A、H40A和H60A与COOH末端易位的插入。

拓扑比取决于第一个信号的特性

确定NH的贡献₂-拓扑学的末端信号，H#A结构中的血凝素信号被来自前催乳素（P#A）或血管加压素前体蛋白（V#A）的可切割信号或ASGP受体H1的信号锚定序列所取代，无论是带有（A#A）还是没有完整的40-残基NH₂-末端亲水域（ΔA#A）(图1C） ●●●●。构建物在COS细胞中表达，并通过凝胶电泳和荧光分析(图3). 定量了与COOH末端易位拓扑结构相对应的糖基化产物的比例(图4). 与具有血凝素信号的构建体相比，具有前催乳素信号的构建体产生更少的COOH末端易位蛋白：P20A的最大值为35%，P60A的最大值为零。由于预激肽的前序列相对较长，因此P20A可以观察到信号分裂。未糖基化的裂解产物显示出略高于糖基化未裂解产物的电泳迁移率（用星号表示图3，图P）在endo-H消化后，与它们预期的拓扑结构一致(图1B） ●●●●。

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图3

不同NH嵌合蛋白的插入₂-终端信号。包含NH的嵌合蛋白P#A、V#A、A#A和ΔA#A₂-分别在COS细胞中表达前催乳素、前加压素-神经生理学II和全尺寸或截短的ASGP受体H1的末端信号，并按照图2A.星号表示P20A的未分离种群。指出了35和40 kD分子量标记的位置。

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图4

跨膜拓扑定量。如中所示的多次实验图2A和图3使用荧光成像仪进行量化。绘制了具有糖基化因而移位的COOH末端的多肽的分数与分隔两个信号的间隔物的长度的关系。曲线标有第一个信号序列的缩写：H，血凝素（实心圆圈）；P、 预激肽（填充三角形）；五、 前血管加压素-神经生理学II（填充方块）；A、 ASGP受体H1包括NH₂-末端亲水序列（开方块）；ΔA，截短NH的ASGP受体H1₂-终端域（开放圆）。显示了三到六次测定的平均值和标准偏差。

与其他系列相比，具有加压素信号的结构物产生了更多的糖基化产物：V20A为～90%，间隔物为60个残基（V60A）的结构物为～50%。然而，对于80或100个残基的间隔物，没有为任何构建物生成糖基化产物。根据这些结果，不同分泌信号的强度，即支配插入过程的能力，可以排序为P>H>V。

在构建序列A#A和ΔA#A中，多肽内ASGP受体H1的内部信号锚定子的第一个拷贝似乎决定了拓扑结构，因为糖基化产物只产生最短的间隔区长度。在A20A和ΔA20A中，NH处的正侧翼电荷₂第二信号的末端也是第一信号的COOH末端侧翼区域的一部分，因此可能会削弱第一信号。删除大多数40-氨基酸亲水NH₂ΔA20A的末端将糖基化产物的比例从～55%增加到～90%。因此，NH越大₂A20A末端抑制了COOH末端易位的拓扑结构。

SRP信号竞争？

两种机制可以解释插入过程中观察到的冲突信号行为：细胞溶质中SRP募集信号之间的竞争(图5A） ，和/或竞争translocon内的首选拓扑(图5B） ●●●●。根据第一个模型，SRP与第一个信号结合的动力学足够慢，以至于第二个信号可能在SRP被募集到第一个信号之前从核糖体中出现。然后这两个信号直接竞争SRP绑定。如果第一个信号与SRP结合，它将启动间隔序列的移位。如果第二个信号发生了，它将诱导COOH末端的易位，而第一个信号将保留在胞质溶胶中，或随后插入具有N_{外显（exo）}/C类_细胞周期方向。该模型预测，与我们的结果一致，第二个信号竞争SRP的能力随着间隔物的长度而降低，并且取决于SRP的两个信号的相对亲和力。

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图5

地形竞争的两种机制。细胞溶质中SRP信号（A）或转座子中首选方向信号（B）之间的竞争。详见正文。

该模型要求，当第二个信号从核糖体中出现时，仍有多肽没有靶向内质网。为了测试这种情况，我们产生了由加压素或血凝素信号组成的构建体，随后是55、75、95或115个残基，包括诊断性糖基化位点(图6A） （V55、H55等）。由于一个新生多肽的至少35个残基隐藏在核糖体中，且SRP无法访问，当信号序列后的前20、40、60或80个残基从核糖体出现时，翻译将到达终止密码子并触发核糖体的分解。这对应于结构体V20A、V40A、V60A和V80A（或相应结构体H#a）的翻译中的一个时刻，此时第二个疏水序列刚刚开始从核糖体中出现(图6A） ●●●●。当到达终止密码子时，只有靶向ER膜的多肽才会产生糖基化产物；所有其他物质将被释放到胞浆中，并保持未糖基化状态。在翻译过程中或翻译后添加狗胰腺微粒体的网织红细胞裂解液中的体外翻译证实，这些结构不能在翻译后移位（数据未显示）。

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图6

加压素和血凝素信号对SRP募集和靶向的动力学。由血凝素或加压素的信号序列组成的多肽，后跟55、75、95或115个残基，包括糖基化位点（H55、H75等和V55、V75等；示意图如a所示），在COS细胞中表达，代谢标记40分钟，免疫沉淀，与（+）或不与内切酶H（−）孵育，SDS-凝胶电泳和荧光分析（B和C）。未糖基化部分对应于没有靶向内质网的多肽，但当核糖体到达终止密码子并被分解时。分子量标记的位置为9、14和20 kD。

如所示图6B、 即使是具有加压素信号的最短结构，V55，也有>90%的糖基化（通道1和通道2），表明SRP与加压素信号结合并靶向ER膜的速度很快。因此，只有结构体V#A的少数多肽有机会被第二个信号靶向。相反，具有血凝素信号的多肽产生了大量未糖基化产物：H55的～40%，H75的～25%，H95的～10%。因此，与加压素信号相比，SRP募集速度要慢得多。这表明H#A构造中的第二个信号可能能够竞争SRP绑定。然而，未靶向多肽的数量不能解释观察到的具有易位COOH末端的H20A、H40A和H60A的种群(图4). 最重要的是，尽管血管加压素信号的靶向作用更快，但插入COOH易位末端的V#a结构体的比例要大于H#a结构。因此，不同的拓扑结构更可能是换能器内信号之间竞争的结果(图5B） SRP结合动力学和第一信号靶向动力学。

间隔序列中的糖基化对地形形成的影响

根据第二个模型(图5B） ，所有多肽的间隔序列至少暂时暴露于内质网腔。为了探测间隔物的内腔暴露，诊断N个-介绍了糖基化位点。在构建物V40（NIT）A中，通过在间隔段的天冬酰胺13处插入三个额外的密码子，产生了一个潜在的糖基化位点NIT。如所示图7A、 由于所有多肽现在都被糖基化了一次或两次，表明它们移位了间隔序列（一个糖基化）或COOH末端结构域（两个糖基化合）。然而，与V40A相比(图7A、 巷1和巷2），二次糖基化蛋白的比例显著下降。在蛋白酶保护试验中，证实了移位的COOH末端的糖基化效率没有降低（数据未显示）。因此，添加糖基化位点有利于具有易位间隔序列的多肽，显著改变了两种拓扑结构之间的比率。COOH末端易位的产物比例从～75%降至～30%(图7B） ●●●●。60个残基的较长间隔物也有类似的效果，其中插入糖基化位点将该部分从V60A中的～50%降低到V60（NIT）A中的<20%(图7A、 9–12车道，以及图7B） 。这表明，拓扑学受糖基化的影响，糖基化是一种管腔修饰，显然是在靶向作用后发生的。

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图7

间隔区序列中的糖基化对蛋白质拓扑结构的影响。（A） 所示结构在COS细胞中表达，并通过（+）或（-）内切H消化进行分析。在将功能性糖基化位点插入间隔段后，具有易位COOH末端（两次糖基化）的蛋白质与具有易位间隔序列（未糖基化或一次糖基化合）的蛋白质的比率发生了有利于后者的变化。（B） 实验定量如A所示。绘制了三到五次测定的平均值和标准偏差，但V40（NMT）A、V60（NIT）A和H40（NIT。

为了排除突变通过改变间隔序列的构象特性而非糖基化本身发挥作用的可能性，将序列NIT突变为NIN，NIN不被寡糖基转移酶（V40[NIN]A；图7A、 车道5和6，以及图7B） ：对拓扑结构的影响已基本恢复。另一个不同的一致序列NMT也被有效地糖基化，显示出与NIT相同的带有易位间隔序列的多肽增加(图7B） ●●●●。相反，NGS序列不影响拓扑结构，但几乎不产生任何含有单个聚糖的多肽(图7A、 车道7和8，以及图7B） ●●●●。这证实一致序列N-X-S/T不足以产生拓扑学效应，但需要有效的糖基化。（有趣的是，据报道，NGS是最有效的N-X-S共识序列N个-糖基化的体外研究[Shakin-Eshleman等人，1996年]. 显然，序列上下文显著影响潜在糖基化位点的相对效率）。糖基化对拓扑结构的影响也通过45个氨基酸的完全不同的间隔序列重现，对应于具有天然糖基化位点NFT的H1外质部分的片段。QFT突变导致COOH末端易位多肽的比例从～30%（V45[NFT]A）增加到～50%（V45[CFT]A）(图7B） ●●●●。正如预期的那样，用血凝素作为NH也观察到了糖基化的拓扑学影响₂-终端信号序列（H40[NIT]A vs.H40A）(图7B） ●●●●。糖基化影响拓扑生成，因此在确定多肽拓扑之前发生，很可能是通过捕获腔侧的间隔序列，阻止其返回膜的细胞溶质侧（如图8)。

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图8

糖基化如何影响拓扑学的图解模型。有关详细信息，请参阅文本。

讨论

多跨膜蛋白的插入是一个复杂的过程，目前尚不清楚。为了测试多肽链中的连续拓扑学决定簇如何通过哺乳动物内质网的靶向和转位机制被解码，我们在COS细胞中表达了一系列包含两个相互冲突的信号序列的嵌合蛋白。只有当两个信号彼此充分分离时，结果才能用简单的线性插入过程来解释，其中NH最多₂-终端信号序列决定其自身的方向以及随后的跨膜结构域的方向。所需的间隔棒长度取决于两个信号的特性（强度）。最弱的NH₂-经检测的终末信号，即血管加压素，完全迫使ASGP受体H1的内部信号锚定器以80个或更长的间隔物进入停止转移方向，而H1信号锚定剂本身可以通过仅40个氨基酸的间隔物来实现。对于较短的间隔区，观察到混合拓扑结构，表明多肽的第二信号中的拓扑结构信息共同决定了插入过程。因此，插入并不是以严格的线性方式从NH发生的₂去COOH总站。

因此，这种情况与通过科尔曼等人，1985年使用由13或27个残基分离的前体蛋白信号的两个拷贝的蛋白质。间隔物主要与较长的间隔物易位，COOH末端与较短的间隔物易位。然而，一个点突变将第一个信号从共翻译转变为翻译后的作用模式，也导致了COOH末端与较长间隔区的易位，这表明靶向和插入现在由第二个信号指示。类似地，如果在我们的系统中SRP与NH的结合动力学₂-终端信号足够慢，SRP结合和第二个信号的靶向可能解释了我们的结果。Johnsson等人（1994年）的实验证明，在酵母中，许多信号序列靶向内质网膜的速度惊人地慢。测试的信号序列具有不同的效率，允许将约100（转化酶）和约300个残基（羧肽酶Y和Ste6）暴露于50%多肽的胞浆中。然而，大多数微弱信号，如羧肽酶Y的信号，后来被证明独立于SRP发挥作用(Ng等人，1996年)甚至转化酶分泌在SRP缺陷菌株中也只受到轻微影响(Rothe和Lehle 1998年). 哺乳动物细胞中依赖SRP的靶向动力学问题(Zimmermann等人，1990年;Kutay等人，1995年)，仍处于打开状态。

在本研究中，我们使用血凝素和加压素信号以及长度增加的报告多肽分析了COS细胞中SRP依赖性靶向的动力学。与在酵母中测试的所有示例相比，目标定位明显更快（相对于翻译）。当55个超过信号的残基被翻译时，60%的血凝素信号链和>90%的血管加压素信号链已被靶向。靶向的相对速率可能反映出，与含有547个氨基酸的血凝素相比，前加压素-神经生长素II是一种145个残基的相对较短的蛋白质，因此需要更快地靶向。从序列来看，尚不清楚是什么使加压素信号对SRP招募更有效。对于信号序列相互冲突的构建物，血凝素和血管加压素信号的靶向率不能解释观察到的拓扑结构，因为与COOH末端易位无关。虽然一些蛋白质的一部分（例如具有血凝素信号和最短间隔区的蛋白质）可能被第二个信号靶向，但第二个信息的拓扑学影响似乎在很大程度上独立于蛋白质是如何进入转座子的。

引入信号序列之间的间隔段的糖基化位点为易位中定向过程的动力学提供了令人惊讶的见解。N个-糖基化显著影响了拓扑结构的平衡，有利于带有移位间隔序列和胞质COOH末端的拓扑结构。这意味着无论有无糖基化位点，细胞溶质定位的间隔段都会暂时暴露在内质网腔中。有了糖基化位点，当间隔物出现在管腔中并被困在管腔中时，它会被低聚糖基转移酶修饰(图8). 结果表明，多肽在转座子内动态地重新定向，探索了两种信号中任何一种所支持的可能拓扑结构。在决定拓扑结构之前，跨膜结构域之间多达60个残基的亲水序列进出内质网。这种糖基化效应的一个可能机制是修饰片段返回胞质侧的空间位阻。先前在体外观察到，模型膜蛋白的糖基化片段最终暴露于胞浆中(Lipp等人，1989年). 我们没有发现任何表明腔COOH末端和糖基化间隔区的三倍糖基化产物，这表明在我们的系统中糖基化序列不能翻转回细胞溶质侧，或者如果可以的话，它们在细胞溶质中快速脱糖(铃木等人，1998年)。

对于天然多平移膜蛋白的插入过程，我们的结果表明，如果在多肽内足够接近，连续的跨膜序列将以协调的方式插入。从分析的几个例子来看，决定信号拓扑强度的因素并不明显。它并不仅仅与电荷差相关，因为间隔物为40个残基的结构体的Δ（C–N）例如为−6.5（P40A）、−1.5（H40A）和−5（V40A），按拓扑强度递减的顺序列出。其他影响单个信号方向的标准，如疏水性(Wahlberg和Spiess 1997)以及NH的规模₂-末端亲水段(图3和图4A与ΔA20A相比；Denzer等人，1995年)，也可能做出贡献。此外，更长、更疏水的信号，如H1和较小程度上的前凝集素，可能更快地离开移位孔(Martoglio等人，1995年;Mothes等人，1997年)从而可以限制第二信号的影响。

80个或更多残基的间隔段在空间上可能无法在转座子内重新定向。另一种可能限制第二拓扑序列效应的机制是管腔伴侣的结合，尤其是BiP。BiP的酵母同源物Kar2p已被证明促进翻译后易位，但可能也在共翻译运输中起作用(Brodsky等人，1995年;Panzner等人，1995年;Pilon等人，1998年;齐默尔曼1998;Matlack等人，1999年). 很可能，长度足以与管腔伴侣结合的间隔序列将被这种相互作用所锚定，从而决定拓扑结构。

总之，膜蛋白的拓扑学发生似乎是一个动态过程，在这个过程中，整个多肽中紧密间隔的信号和跨膜序列的拓扑术信息被整合在一起。与移位机制相关并作用于待插入蛋白质的酶，如寡糖转移酶和潜在信号肽酶和伴侣蛋白，可以影响该过程，从而有助于天然膜蛋白的有效和均匀插入。

致谢

脚注

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