丝裂原活化蛋白激酶p38连接志贺毒素依赖性信号传导和运输

小干扰RNA（siRNA）的设计和转染

设计了两种针对p38α和p38βmRNA不同部分的不同siRNA。通过BLAST分析图谱，根据其理化特性和对靶mRNA的特异性来选择它们(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST网站/)，并尽可能符合雷诺等。(2004)p38 siRNA靶序列如下：p38α，5-GCUGUGACUGAGAACA-3和5-CUGCGGUUACUUAAACAUA-3（分别为siRNA1和-2），p38β，5-AAGGACCUGAGACACUU-3和5-AAGUGUGUAGACCACC-3（分别为siRNAb1和-b2）。从MWG Biotech（德国埃伯斯堡）订购了高效液相色谱纯化的p38 siRNA，从Eurogentec（比利时塞莱因）订购了阴性对照siRNA。根据制造商的方案，使用寡聚体胺（Invitrogen）将指示的siRNA瞬时转染细胞。

钙分析

如前所述，使用钙探针Fura-2测量细胞内钙浓度的变化(马图拉纳等。, 2002). 在含有140 mM NaCl、5 mM KCl、1.2 mM Ca的培养基中，在室温下用膜渗透剂Fura-2乙酰氧基甲酯（AM）将细胞负载20 min²⁺，1 mM氯化镁₂，10 mM葡萄糖和20 mM HEPES，pH 7.4。利用成像系统监测Fura-2荧光（激发波长340/380 nm；发射波长510 nm）。在盖玻片上镀上的负载细胞安装在IX70倒置显微镜上（日本东京奥林巴斯），除非另有说明，否则测量是在37°C（日本静冈市东海县的热板）下进行的。照片是用充电耦合设备Orca-ER相机拍摄的（日本静冈滨松）。用75-W氙灯通过10%中性密度滤光片（日本东京Omega Optical）、Lambda 10-2滤光片轮（加州诺瓦托Sutter Instrument）和60×油浸PlanApo物镜（数值孔径1.4；Olympus）照亮细胞。相机和滤光片轮快门由MetaMorph软件（Molecular Devices，Sunnyvale，CA）控制。

细胞内吞试验

按照前面描述的程序量化Stx内化(托格森等。, 2005).

硫酸化分析

转染或未转染的HeLa细胞在用0.2 mCi/ml Na孵育之前，用无硫酸盐培养基（最低基本培养基12-126；Lonza Walkersville，Walkersvelle，MD）洗涤两次₂³⁵SO公司₄在37°C的相同介质中放置3小时。按照指示添加抑制剂，然后在该培养的最后30分钟内将其存在于相同的培养基中。细胞与StxB-Sulf孵育₂45分钟或蓖麻毒素磺酸盐3小时，然后用冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次，并在裂解缓冲液（0.1 M NaCl，10 mM Na）中溶解₂高性能操作₄，pH 7.4，1 mM EDTA，1%Triton X-100和60 mMn个-辛基-β-吡喃葡萄糖糖苷，补充完全蛋白酶抑制剂；罗氏诊断公司，德国曼海姆）。用抗Stx或抗蓖麻毒素抗体免疫沉淀清除的裂解物。免疫沉淀复合物通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）分离，转移到聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，并通过放射自显影术进行研究。使用ImageQuant 5.0软件（Molecular Dynamics，Sunnyvale，CA）量化带强度。总细胞蛋白硫酸化被测量为5%三氯乙酸（TCA）沉淀的量³⁵SO公司₄²⁻在裂解液中。

内泌体的亚细胞分级

HEp2细胞在无血清培养基中饥饿1 h，然后用或不用100μM TMB-8处理30 min。然后用或不用250 ng/ml StxB在同一培养基中培养20 min。如前所述纯化内切体(安妮托等。, 1996). 简单地说，细胞在均质缓冲液（250 mM蔗糖和3 mM咪唑，pH 7.4）中均质，核后上清液（PNS）调节为40%蔗糖，3 mM咪唑，pH为7.4。然后将PNS在pH 7.4的3 mM咪唑中通过35%、25%和250 mM蔗糖溶液层进行平衡浮选。PNS/35%、35%/25%和25%/250 mM蔗糖溶液界面的可见带分别对应于“重”膜（HM）、早期内体（EE）和晚期内体（LE）部分(安尼托等。, 1996). 测定纯化组分中的蛋白质浓度，用SDS-PAGE分离等量蛋白质并用Western blotting分析。

免疫沉淀

在Stx刺激后检测磷酸化蛋白，如下所示：HeLa细胞在HEPES培养基中饥饿2 h，并用250 ng/ml StxB处理指定的时间。然后在添加了完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒的结合缓冲液（20 mM Tris-HCl、10 mM EDTA、100 mM NaCl、1%NP-40和0.2 mM原钒酸盐）中对细胞进行裂解（罗氏诊断公司）。如前所述，通过使用20μl抗磷酸酪氨酸柱浆（弗吉尼亚州夏洛茨维尔Upstate Biotechnology），在4°C下隔夜免疫沉淀酪氨酸磷酸化蛋白(瓦尔切利等。, 2004). 将洗脱液进行SDS-PAGE并转移到PVDF膜上。用所示抗体进行免疫染色。

细胞毒性试验

如图图例所示，对HeLa细胞进行预处理。用无亮氨酸培养基冲洗细胞两次，然后用增加浓度的毒素（Stx或蓖麻毒素）培养2.5小时。然后，在2μCi/ml的浓度下培养细胞30分钟[^三H] 亮氨酸，最后用5%的TCA提取两次。将沉淀物溶解在0.1 M KOH中，并测量相关放射性。

Stx内吞与p38无关

观察到的Stx向高尔基体转运的减少可能是由于抑制了内体和TGN之间的特定转运步骤，或是抑制了早期事件，如结合或内吞作用。此前已经证明SB203580对p38的长期抑制可以减少Stx与人脑内皮细胞的结合(斯特里克雷特等。, 2005). 因此，我们测试了两种p38抑制剂SB203580和{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“SKF86002”SKF86002型关于Stx在我们细胞中的结合和内吞作用。两种抑制剂均不影响毒素结合（数据未显示）。然而，在用SB203580处理的细胞中观察到Stx摄取量略有下降(图2，黑色条）。这种影响并不是由于氯氰菊酯依赖性内吞普遍受阻，因为在5分钟和20分钟后，转铁蛋白内吞均不受抑制剂的影响（数据未显示；图2，灰色条）。重要的是，靶向p38α的siRNAs并没有减少Stx的结合或内吞作用（数据未显示）。从这些数据中，我们得出结论，p38α对Stx转运的主要调节活性是在从内体到高尔基体的步骤上。

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图2。

抑制p38对内吞作用的影响。将HeLa细胞与30μM SB203580（SB）或载体（DMSO；0.1%最终浓度）在37℃孵育30分钟，然后将Stx-SS-生物素（黑条）或转铁蛋白-SS-生物素（Tfn；灰条）添加到培养基中。将培养持续20分钟。细胞经2-巯基乙烷磺酸钠处理，通过链霉亲和素包被的磁珠从细胞裂解液中捞出内化的Stx-或转铁蛋白-SS-生物素，并通过电化学发光进行测量。这个实验重复了三次，每次重复一次；误差线表示偏差*p≤0.005，由配对学生的t吨测试。

耗尽p38α保护细胞免受Stx毒性

由于p38α的敲低导致Stx从内体到高尔基体的转运强烈减少，我们想研究Stx转运到胞浆的影响。为此，我们进行了毒性试验。如所示图3a和b，p38抑制剂SB203580和针对p38α的siRNA能够将Stx的毒性降低四到五倍。这与硫酸化和免疫荧光数据一致，并进一步表明p38α是Stx正确转运所必需的。我们以前曾报道过，毒素有时能够克服贩运过程中的障碍(略伦特等。, 2003)显然是通过细胞上调的补偿性运输途径。然而，对于p38，即使经过长期抑制（siRNA治疗），细胞似乎也无法弥补贩运中p38α激酶的缺乏。为了进一步证实所观察到的效应对Stx转运是特定的，我们对蓖麻毒素进行了类似实验。与硫酸化实验的数据一致，蓖麻毒素毒性不受p38抑制剂或siRNA治疗的影响(图3，c和d）。总之，这些结果证实了p38是正确贩运Stx所必需的，而不是蓖麻毒素。

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图3。

p38抑制可对抗Stx，但对蓖麻毒素的细胞毒性无保护作用。实验开始前48小时，用30μM SB或载体（DMSO；0.1%最终浓度）处理HeLa细胞30分钟（a和c）或转染p38αsiRNA1或对照siRNA（b和d）。在此之后，将细胞与增加浓度的Stx（a和b）或蓖麻毒素（c和d）孵育2.5小时。蛋白质合成通过[^三H] 亮氨酸掺入。所有实验重复至少两次。误差线表示标准偏差。

p38被Stx激活

以前的报道表明MAP激酶p38是内胚体转运的调节器(卡瓦利等。, 2001;德尔克鲁瓦等。, 2003;弗拉蒂等。, 2003;梅斯等。, 2005;Pelkmans公司等。, 2005). 因此，我们旨在测试Stx是否能激活p38。用Stx处理不同时间的细胞裂解液通过抗磷酸酪氨酸（anti-YP）柱，用SDS-PAGE分离洗脱蛋白并转移到PVDF膜上进行免疫印迹分析。如图所示，激活的（Tyr-和Thr-磷酸化）p38（p38P）在Stx刺激细胞1分钟后就与抗YP柱结合，10–15分钟后观察到峰值(图4a、 顶部）。膜上也检测到p38α(图4a、 顶部第二个面板）。观察到该亚型与抗YP柱的结合表明，至少部分p38P带代表激活的p38α。然而，由于抗体较差，我们无法在免疫印迹中检测到p38β，因此不能排除p38P带也包含激活的p38β。与p38α相比，p38P的峰值似乎有点延迟。p38P抗体识别双磷酸化（Thr和Tyr）蛋白，而柱结合Tyr-磷酸化蛋白。p38α抗体不能区分蛋白质的不同磷酸化状态，因此这可能解释了p38P和p38α的磷酸化动力学似乎不同。作为对照，膜被抗CHC抗体重制，因为我们之前已经证明CHC在Stx结合后被磷酸化(图4a、 从顶部算起的第三个面板；罗夫拉克等。, 2006). 如图所示，CHC磷酸化的动力学也很快。作为柱上相等负载的对照，对全细胞裂解物（WCL）进行p38α探测(图4a、 底部）。我们还测试了p38反应对不同Stx浓度的敏感性。p38活化（Tyr和Thr磷酸化）在与增加浓度的Stx孵育5分钟后进行分析(图4b） ●●●●。用SDS-PAGE对全细胞裂解物进行分析，并用Western免疫印迹法进行分析。如前所述，低至10 ng/ml的Stx浓度能够刺激p38磷酸化。

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图4。

StxB能够在结合时激活p38α。（a） 将HeLa细胞在HEPES培养基中饥饿2小时，然后用250ng/ml StxB孵育指定的时间。细胞被裂解，细胞裂解物通过抗YP柱。然后用所示抗体对洗脱液进行免疫印迹分析。用SDS-PAGE和Western免疫印迹分析1%的WCL，以控制柱上的等负荷。（b） HeLa细胞在37°C下与增加浓度的StxB孵育5分钟。制备裂解液并使用所示抗体进行Western blot分析。这些实验重复了三次。

Stx修饰细胞内钙²⁺对激进分子的回应

因为胞浆钙²⁺水平影响Stx运输(桑德维格和布朗，1987年;陈等。, 2002;罗夫拉克等。, 2002)，我们分析了Stx结合对Ca的影响²⁺平衡。与B细胞研究获得的数据相反(塔加语等。, 1997)Stx本身的结合（不像添加离子霉素）没有诱导任何可观察到的Ca²⁺HeLa细胞的反应（补充图S2A）。将纯化的StxB添加到细胞中时也观察到了同样的情况（补充图S2D，左侧）。这可能是由于Stx信号的局部效应，无法用Fura-2AM等细胞溶质钙探针测量，或者也可能是负反应。测试添加Stx是否修改Ca²⁺我们研究了Stx对组胺或ATP诱导的Ca振荡的影响²⁺水平。将Stx添加到细胞中，然后在不同的时间点（20 s、4、10和15 min；图5（分别为a–d）。对胞浆钙无明显影响²⁺在最早的时间点可以观察到组胺引起的振荡(图5，a–c）。然而，15分钟后，细胞溶质Ca²⁺组胺诱导的振荡被强烈减弱，尽管细胞内钙²⁺仍观察到增加(图5d） ●●●●。ATP刺激后（补充图S2B）和StxB（补充图S2C）也观察到了同样的情况。这些结果表明，Stx必须被细胞吸收才能对胞浆Ca发挥作用²⁺水平。接下来我们研究了观察到的细胞溶质钙的衰减²⁺振荡是Stx定位到早期内体本身的结果。为此，我们在18°C的温度下进行了实验，该温度导致Stx在早期内体中积累(马拉德等。, 1998). 组胺诱导的钙²⁺在此温度下，Stx孵育20分钟不会影响振荡(图5e） 这表明Stx阳性的内体必须到达另一个隔室，并可能与之融合，以影响细胞溶质Ca²⁺组胺引起的振荡。我们还想研究Stx对钙振荡的影响²⁺水平依赖于p38。在按照所述进行实验之前，用SB203580预培养细胞30分钟。在这些实验条件下，Stx处理仍然抑制组胺诱导的Ca²⁺振荡(图5f） 如不使用抑制剂所示(图5d） ●●●●。有趣的是，细胞溶质钙的基础水平²⁺在SB203580存在时增加(图5f） ●●●●。总之，这些数据表明Stx能够作用于Ca²⁺通过影响细胞内钙的动态平衡²⁺这取决于Stx的内化，而不是p38的活性。由于全毒素和纯化的B链的作用相似，人们可以单独使用B链来进一步研究这一现象。

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图5。

Stx抑制细胞溶质钙²⁺振荡。细胞质钙²⁺在HeLa细胞中测量，加载钙探针Fura-2AM。如图所示，在钙引发后，向培养基中添加Stx（1μg/ml²⁺测量值。添加Stx后20 s（a）、4 min（b）、10 min（c）或15 min（d）添加组胺（1μM）。对于c和d，记录道分别在5到10或15分钟之间切割。左边的痕迹代表没有毒素的细胞。痕迹显示Fura-2AM荧光比率（340 nm/380 nm）。（e） 加载Fura-2AM后，在18°C下培养HeLa细胞进行测量。如图所示添加Stx。添加Stx 20分钟后添加组胺（1μM）。在5到20分钟之间切割呈现的痕迹。（f）用2μM SB203580预处理细胞30分钟。然后用Fura-2AM加载细胞。开始测量后2分钟添加Stx。添加Stx后15分钟添加组胺（1μM）。每条记录道都是具有代表性的Ca²⁺每种实验条件下18–30个单个细胞的反应。

HeLa细胞中Stx的细胞内转运对钙敏感²⁺水平：TMB-8和p38抑制的非相加效应

Ca之间的串扰²⁺信号转导和p38激活先前已经被提出(赵等。, 1992;池田等。, 2000;塔克达等。, 2004;法扎勒等。, 2005)，我们开始调查钙的需求之间是否存在联系²⁺Stx传输中的p38。首先，在钙存在的情况下进行内吞试验²⁺螯合剂。据报告陈等。(2002)，这些螯合剂似乎都没有在很大程度上影响Stx的摄取（数据未显示）。然而，我们注意到1,2-双（2-氨基苯氧基）乙烷-N个,N个,N′,N′-四乙酸（BAPTA）-AM，一种膜渗透钙²⁺螯合剂在浓度高于20μM时具有细胞毒性（数据未显示）。因此，我们测试了不同浓度对毒素硫酸化的影响。与对照组相比，20μM BAPTA-AM减少了80%以上的Stx硫酸化(图6a、 黑条），而在此浓度下，总蛋白质硫酸化减少了30%(图6a、 灰色条）。对总蛋白硫酸化的影响与陈等。(2002)这也表明顺行的ER到高尔基体的转运对钙的去除很敏感²⁺。在进一步的研究中，我们选择使用10μM BAPTA-AM，该浓度可显著降低Stx硫酸化，但仅对总蛋白硫酸化产生轻微影响(图6a） ●●●●。为了证实这些数据，我们对用10μM BAPTA-AM处理的细胞进行了Stx毒性实验。在这些条件下，我们观察到Stx的保护作用是15倍（平均±偏差14.8±2.4；n=2）(图6b） ●●●●。

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图6。

StxB向TGN的转运对钙敏感²⁺变化。（a） HeLa细胞在指定浓度或载体（DMSO；0.1%最终浓度）下与BAPTA-AM孵育30分钟，然后与StxB孵育45分钟并裂解细胞。从裂解液中免疫沉淀StxB，并通过SDS-PAGE和放射自显影术分析其硫酸化程度。计算带强度并绘制为平行线的平均值。TCA沉淀后测量细胞总蛋白硫酸化，并绘制与对照组相关的曲线。这个实验用重复进行了两次；误差条显示偏差。（b） 在添加Stx之前，用或不用10μM BAPTA-AM培养细胞30分钟。然后按照中所述进行实验图3.本实验重复进行了两次；误差条显示偏差。（c） 将细胞血清饥饿1h，然后在添加StxB之前，用或不用10μM BAPTA-AM处理细胞30min。通过SDS-PAGE分离细胞裂解物，并通过蛋白质印迹进行分析。直方图中显示了三个独立实验的量化。（d） 细胞与100μM TMB-8或载体（DMSO；0.1%最终浓度）孵育30分钟，然后与StxB-Sulf孵育₂45分钟。然后按照A（e）中的描述进行实验。在添加Stx之前，将细胞与100μM TMB-8孵育30分钟。然后按照中所述进行实验图3。这个实验重复了三次，每次重复一次。误差条显示偏差。（f） 与d中相同，但在本试验中，在添加StxB-Sulf之前，也使用或不使用30μM SB203580处理细胞₂该实验用重复品重复两次。误差条显示偏差。

我们还研究了在BAPTA-AM存在下Stx诱导的p38激活图6c、 BAPTA-AM有效抑制p38磷酸化。

为了证实BAPTA-AM处理细胞的实验结果，我们还测试了细胞内钙的抑制剂TMB-8的作用²⁺释放(本·谢里夫等。, 1995). 与对照细胞相比，该抑制剂减少了30%的Stx硫酸化，而总蛋白硫酸化未受影响(图6d） ●●●●。与此一致，我们观察到TMB-8处理的细胞对Stx的保护作用为2.5±1.1（n=3）(图6e） ●●●●。因此，这些数据表明细胞溶质钙²⁺甚至可能是Ca的局部变化²⁺浓度对Stx向高尔基体的正确转运至关重要。

接下来，我们想研究Ca与²⁺以及对有效p38的要求，以便进行适当的Stx传输。因为p38和Ca的抑制剂²⁺释放减少Stx转运，我们推断如果p38和Ca²⁺作用于同一途径，与这两种抑制剂共同处理不应导致进一步减少。如所示图6f、 与单独用SB203580处理的细胞相比，用SB20358和TMB-8处理的细胞没有观察到Stx硫酸化的加性效应。这表明p38激活和Ca水平²⁺共同调节Stx传输中的一个步骤。

我们感谢E.Rolén和A.-G.Myrann提供的专家技术援助。我们感谢R.J.Davis教授（马萨诸塞大学伍斯特分校，马萨诸塞州）提供p38、MKK3和MKK6 cDNA构建。N.Kurebayashi教授（日本东京君天道大学医学院）恳请我们使用显微镜测量钙。我们感谢K.Pattni博士和H.Raa博士对手稿的批判性阅读。本研究得到了挪威镭医院、奥斯陆大学、挪威癌症协会、挪威研究理事会和人文学科、诺和诺德基金会、Jahre基金会以及Jeanette and Sören Bothners Legacy的支持。2003年，S.W.获得了欧洲生物化学学会联合会和瑞士国家基金会博士后研究金的支持。