核层粘连组织的改变抑制RNA聚合酶II依赖性转录

摘要

介绍

RNA聚合酶II的活性可能部分受基因和转录因子与细胞核结构成分（通常统称为核支架或基质）之间关联的调节(戴维，1995年). 例如，活性转录复合物似乎与核支架结合，据报道，活性基因和转录因子在核基质制备中富集(杰克逊和库克，1985年;Stein等人，1995年). 这些发现以及基质本身的存在存在争议，部分原因是用于制备核基质/支架的提取方法多种多样(佩德森，2000). 然而，确定核结构在转录中的作用的最大障碍是未能确定参与转录的特定核结构元素。

核层粘连蛋白可以形成这样的结构元件。这些V型中间灯丝（IF）^*蛋白质存在于高等真核生物中，分为在分化细胞中表达的A型和在所有细胞中发现的B型(Moir等人，1995年). 层压板是层压板的主要成分，层压板是位于核膜内表面的蛋白质层，与染色质密切相关。层粘连蛋白为核膜提供结构支持，并参与核组装(Moir等人，1995年;格伦鲍姆等人，2000年). 在核质中也发现了层压板，这与层压板不同，在层压板中，层压板组装了许多结构，例如不同的焦点和一种称为核质膜的结构，这种结构遍及核质的非核极区域(Bridger等人，1993年;Moir等人，1994年，2000亿;Kennedy等人，2000年;刘等人，2000). GFP–层粘连蛋白的活细胞观察表明，核质层粘连组合整合到稳定结构中(Moir等人，2000b). 核层粘连蛋白和层粘连相关蛋白包含染色质结合域，这表明层粘连可能也参与染色质的组织(Moir等人，1995年;Wilson等人，2001年).

最近对吉普赛人的研究表明，核层粘连蛋白参与转录果蝇属绝缘子元件。这种元素对增强子的影响似乎取决于它与底物的结合，可能是核层粘连(Gerasimova等人，2000年;Bell等人，2001年). 另一个果蝇属研究表明，层粘连蛋白功能缺失突变体（Dm₀)导致气管系统细胞质延伸的定向生长中断，生殖系突变克隆产生的卵母细胞中mRNA未能正确定位在细胞质中(Guillemin等人，2001年). 作者认为，这些细胞质过程的失败是由于层粘连蛋白在组织细胞质中的一种新作用，或者，层粘连可能是实现这些细胞质进程所需的基因产物正确表达所必需的。发现Rb（许多细胞周期基因的转录阻遏物）与层粘连蛋白结合，也支持了层粘连蛋白质参与转录(Mancini等人，1994年). 此外，据报道，一种层粘连结合蛋白，层粘连相关蛋白2B（LAP2B）可以介导转录抑制(Nili等人，2001年). 最后，脊椎动物发育过程中层粘连蛋白等型表达模式的变化与转录和细胞分化的开始相关(Moir等人，1995年). 尽管这些研究与层粘连蛋白参与转录一致，但几乎没有直接证据支持这种可能性。

与所有IF蛋白一样，核层粘连蛋白包含保守的中央α-螺旋杆结构域和非保守的NH₂-和COOH-终端域。棒畴驱动体外组装形成螺旋线圈(Stuurman等人，1998年). 然而，NH₂-末端结构域似乎也在聚合中起作用，因为仅由杆状结构域和COOH末端结构域（ΔN）组成的层粘连片段在体外组装特性发生了改变(Moir等人，1991年). 体内，哺乳动物细胞微量注射ΔN人层粘连蛋白A（ΔNLA）会破坏A型和B型层粘连的组织。突变型和野生型层粘连蛋白被隔离在核质聚集体中，而不是典型的层粘连和核质结构（即焦点和面纱）(Span等人，1997年). 同样，转染研究表明，哺乳动物细胞中ΔN层粘连突变体的表达会破坏层粘连组织(Ùstlund等人，2001年). 最后，在爪蟾间期提取物、ΔN层粘连突变体的添加扰乱了层粘连和核质内层粘连的正常分布(Moir等人，2000a).

这些ΔN突变体已被用于研究层粘连蛋白在DNA复制中的作用。例如，ΔNLA破坏层粘连组织，并在DNA复制的起始到延伸阶段的过渡期阻断DNA复制。这种抑制伴随着复制因子复合物（RFC）和增殖细胞核抗原（PCNA）分布的改变，这是聚合酶（δ）所需的两个辅因子，负责快速过程性并入核苷酸，这是复制延长期的特征(Moir等人，2000a). 这些结果与其他表明层粘连蛋白参与DNA复制的发现一致。例如，有报道称，在S期早期，层粘连蛋白A（LA）与核苷酸结合位点共定位(Kennedy等人，2000年)在哺乳动物细胞S期中后期，层粘连蛋白B（LB）的核质病灶与PCNA在核苷酸掺入位点共定位(Moir等人，1994年). 与这些观察结果一致爪蟾卵核组装提取物导致无法合成DNA的细胞核的形成(Newport等人，1990年). 这些观察结果表明，核层粘连蛋白与复制因子复合物（RFC）、PCNA或其他相关蛋白相互作用，可能是作为复制复合物组装的支架。在本报告中，我们研究核层粘连蛋白是否在转录中发挥类似作用。

结果和讨论

之前，我们确定正常层粘连组织的破坏阻碍了DNA合成的延伸阶段。为了确定其他核功能是否也依赖于层粘连，我们在将显性阴性层粘连突变体ΔNLA微注射到细胞质后2小时内，检测了BHK 21细胞中RNA剪接因子的分布。与之前的调查结果一致(Span等人，1997年)免疫荧光显示，微量注射ΔNLA后，A型和B型层粘连蛋白的组织发生改变。这种改变被视为椎板和核质层粘连面纱中层粘连正常分布的丢失。相反，这两种类型的层粘连蛋白与突变层粘连在异常核质聚集体中被发现(图1，将A和B与C和D进行比较）。在正常条件下，使用针对U2特异性结合蛋白B′′的抗体的免疫荧光表明，剪接因子在核质内以斑点和互连材料的特征模式分布。用ΔNLA破坏层粘连组织后，这种模式显著改变，大多数斑点和互连材料被较少且明显分离的斑点所取代(图1、E和F). 微量注射ΔNLA并用Y12（一种与含有SM抗原的snRNP反应的抗体）染色后，观察到剪接因子的类似重组（未公布数据）。此外，对B′′和层粘连聚集体分布的比较表明，这些蛋白在ΔNLA处理的细胞中没有共定位。层粘连蛋白组织破坏时剪接因子分布的显著变化让人想起用RNA聚合酶II抑制剂α-鹅膏素处理细胞后观察到的变化(斯佩克特，1993年). 总之，这些观察结果提出了一种可能性，即在细胞核内，转录依赖于层粘连蛋白的正常组织。

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图1。

层粘连组织的破坏改变剪接因子的分布。用A型或B型层粘连蛋白特异性抗体的免疫荧光法检测未经处理的BHK 21细胞（A和B）和微量注射ΔNLA（C和D）的细胞中A型和B型层粘蛋白的组织。微量注射ΔNLA破坏了B型和A型层粘连蛋白（C和D）的组织。免疫荧光显示LA和B′′的分布，这是一种U2特异性结合蛋白（E–G）。在左侧的对照细胞中，剪接因子B′′以斑点和核质内互连物质的特征模式分布。在ΔNLA注入电池（右上）中，没有互连材料，B′′斑点的数量大大减少（E和F）。请注意，层粘连聚集体和B′′斑点不对齐（G）。棒材，5μm。

为了确定层粘连组织的破坏是否影响转录，将ΔNLA微量注射到BHK 21细胞的细胞质中，1–4小时后，通过原位掺入BrU到RNA中来检测转录。标记10分钟后，通过免疫荧光检测BrU掺入位点(Huang等人，1998年). 与在相邻未注射细胞的细胞核中发现的明亮的、有点点状的染色相比，注射ΔNLA的细胞显示出大大减少的BrU染色(图2，A和B). 在层粘连组织受影响最大的细胞中，BrU掺入量减少最为显著，表明存在剂量-反应关系(图2，A和B，比较大小箭头）。注射ΔNLA的小鼠3T3和人类HeLa细胞显示BrU掺入几乎相同的减少，表明转录抑制并不局限于特定的细胞类型（未发表的数据）。此外，在注射缓冲液中注射等摩尔浓度野生型LA的细胞中，BrU标记与未注射细胞没有区别（未公布的数据）。尽管微量注射ΔNLA的细胞核中BrU掺入的整体水平大大降低，但无论层粘连组织的破坏程度如何，仍有一些BrU染色簇保持明显(图2、B和E). 相位对比观察表明，这些簇与核仁相关(图2、D和E). 层粘连组织破坏后核仁区的BrU染色强度与未注射细胞的核仁区相似(图2、B和E，箭头）。核仁区BrU染色的保留表明，层粘连断裂不会阻断RNA聚合酶I的活性。此外，在经ΔNLA处理的细胞核中检测到纤维蛋白的正常核仁分布，提供了额外的证据，证明这种破坏不会阻止RNA聚合酶I的活性（未发表的数据；Ochs等人，1985年).

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图2。

层粘连组织的破坏导致BrUTP掺入减少。微量注射ΔNLA（A和B中的箭头）后，通过原位掺入BrUTP来检测细胞的转录活性。使用针对LA和BrU的抗体对细胞进行固定和免疫荧光染色。底部是一个未注入的单元格（A和B）。未注射细胞的核仁用箭头标记。微量注射ΔNLA后，另一细胞的层蛋白（C）和BrU（E）染色显示BrU掺入仅限于核仁区域（D）。棒材，10μm。

使用微注射技术，每个实验只能研究几个细胞。因此，我们开发了一种无细胞系统，用ΔNLA同时处理大量转录活性核。爪蟾当RNA聚合酶II和III变得活跃时，胚胎在中囊胚转变（受精后12、～8小时分裂）之前是转录不活跃的(纽波特和克什纳，1982年). 我们很早就发现了爪蟾原肠胚（受精后~10小时）可以通过离心裂解，在胚胎提取物中产生完整的细胞核。

胚胎细胞核有一个突出的板层和由内源性层粘连LB3组成的典型核质层粘连结构(图3，A和B). 然而，添加ΔNLA后1 h，在这些细胞核中观察到含有ΔNLA和LB3的异常核质聚集物，而不是典型的层粘连结构(图3，E–G）。BrUTP的加入表明ΔNLA处理的细胞核中的转录活性显著降低(图3，H–J），与未经处理的细胞核相比(图3，C–D）。通过添加[α³²P] 提取UTP。15分钟后，制备RNA并通过变性琼脂糖凝胶电泳进行解析。在未处理的细胞核中，³²P被纳入tRNA大小的产物和RNA的高分子量物种(图4A） ●●●●。这些提取物中未检测到新合成的rRNA大小的产物，因为RNA聚合酶I在早期原肠胚形成期间不活跃(纽波特和克什纳，1982年;Verheggen等人，2000年). 通过添加α-amanitin（10μg/ml）选择性地抑制了上分子量产物的合成，表明这些是RNA聚合酶II的产物(图4B） ●●●●。ΔNLA处理胚胎细胞核也会显著抑制大分子RNA的合成，而tRNA-size产物的合成没有检测到改变(图4、C和D). 这些结果表明，破坏层粘连组织特异性抑制RNA聚合酶II活性。

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图3。

胚胎细胞核层粘连组织的破坏抑制BrU的掺入。向胚胎提取物中添加缓冲液（A–D）或ΔNLA（E–J）。60分钟后，加入BrUTP，15分钟后，细胞固定。染色质用TOTO3（A、C、E和H）染色。使用针对BrU（D和J）、LB3（B和G）和人类LA（F和I）的抗体的免疫荧光来监测BrU的掺入和层粘连的分布。图像是穿过细胞核中心的共焦截面。棒材，5μm。

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图4。

层粘连组织的破坏抑制胚胎细胞核中mRNA大小产物的合成。通过添加[α³²P] UTP公司。15分钟后，从每个样品中制备总RNA，并通过变性凝胶电泳进行解析，干燥的凝胶用于放射自显影。添加α-amanitin（10μg/ml）会阻碍合成高分子量产品（括号，比较A和B）。或者，在添加[α³²P] UTP公司。成立[³²P] UTP进入高分子量产物受到LB3组织破坏的抑制，而tRNA大小的产物的合成（箭头）不受影响。

为了控制外源蛋白引入细胞核对转录可能产生的非特异性影响，在胚胎提取物中加入同等浓度的全长人LA。未观察到内源性层粘连蛋白的分布或BrU的掺入发生变化（未公布的数据）。为了消除转录抑制是由于IF蛋白核聚集体的非特异性效应的可能性，爪蟾荷兰统计局-波形蛋白（vimentin）是一种细胞质IF蛋白，被设计成含有核定位信号，被添加到胚胎提取物中。这种蛋白质被导入细胞核，在那里形成核质聚集体(Moir等人，2000a;Reichenzeller等人，2000年)这并没有改变LB3的分布，也没有抑制BrU的掺入（未发表的数据）。此外，ΔNLA处理的细胞核染色质分布正常(图3、E和H). 我们之前已经证明，ΔNLA对层粘连组织的破坏不会显著改变核转运特性(Moir等人，2000年a).

为了确定伴随层粘连组织破坏的聚合酶II抑制的潜在机制，我们检测了一些聚合酶Ⅱ启动子中发现的结合GC盒的基因特异性转录因子Sp1的分布。在未注射的BHK 21细胞中，在细胞核中发现了Sp1(图5B） ●●●●。同样，在注射ΔNLA和破坏层粘连组织后，Sp1仍以与未注射相邻细胞中观察到的模式无法区分的模式分布在整个细胞核中(图5B） ●●●●。因此，层粘连组织的破坏似乎不会改变基因特异性转录因子Sp1的分布。

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图5。

层粘连组织的破坏不会改变Sp1的分布。向BHK 21细胞微量注射ΔNLA。细胞用兔抗人LA（A）和单克隆抗人Sp1（B）染色。每组左侧的细胞未注射ΔNLA，显示正常的层粘连和Sp1染色。右侧细胞注射ΔNLA，尽管层粘连组织被破坏，但Sp1也呈正常分布。棒材，5μm。

我们还研究了层粘连组织的破坏对TATA结合蛋白（TBP）分布的影响，TBP是RNA聚合酶I、II和III的转录因子(埃尔南德斯，1993). TBP与许多TBP相关因子相互作用，形成TFIID复合物(奥尔布赖特和特建，2000年). 这种复合物是一种基础转录因子，被认为是在含有TATA盒的RNA聚合酶II启动子上形成预启动复合物所必需的。我们发现在BHK 21细胞中，层粘连组织的破坏改变了TBP的分布。而不是它在整个细胞核中的正常点状分布(图6，A和B)，大多数TBP与核质层粘连聚集体共定位(图6、C和D). 然而，TBP染色通常在ΔNLA处理的细胞核的核仁区域保持明显，很可能反映其参与RNA聚合酶I依赖性转录(图6D、 箭头）。在爪蟾胚胎细胞核，层粘连蛋白组织的破坏也导致TBP分布的改变，因此在核质层粘连蛋白聚集体中发现了TBP(图6，将G和H与E和F进行比较）。相反，LA并没有改变TBP在BHK 21细胞或胚胎细胞核中的分布，TBP也没有与NLS波形蛋白聚集体共定位爪蟾核（未公布的数据）。

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图6。

层粘连组织的破坏改变了TBP的分布。BHK 21细胞（A–D）和胚胎细胞核（E–H）用兔抗TBP（B、D、F和H）、大鼠抗人LA（A和C）和单克隆抗TBP染色爪蟾LB3（E和G）。图中显示了未注射的BHK 21细胞（A和B）。图中显示了经缓冲液处理的提取物中的胚胎细胞核（E和F）。两者均显示层粘连蛋白（A和E）和总蛋白（B和F）的正态分布。在BHK 21细胞（C和D）和胚胎细胞核（G和H）中，ΔNLA处理导致TBP（D和H）和层粘连蛋白（C和G）在核质聚集体中共定位。箭头指向核仁区域的位置，如相位对比所示（未公布的数据）。图像是穿过细胞核中心的共焦截面。棒材，5μm。

因此，伴随层粘连破坏的TBP分布的变化似乎不仅仅是添加形成核聚集体的外源蛋白的结果。在ΔNLA诱导的聚集物中，转录因子Sp1和剪接因子不与层粘连蛋白共定位，这一发现也支持了层粘连蛋白质与TBP相互作用的特异性(图1和​和6）。6). 剪接因子在细胞核中非常丰富，与染色质没有紧密联系(Spector，1993年). 因此，这些发现反对非特异性捕获作为解释TBP与层粘连聚集物关联的机制。基于这些结果，我们提出TBP在正常细胞核中的分布取决于正常层粘连组织的维持。然而，RNA聚合酶I和III缺乏抑制，表明层粘连蛋白可能无法直接结合TBP。相反，层粘连蛋白可能通过RNA聚合酶II特异的其他因子与TBP相互作用，例如TFIID复合物的TBP相关因子。

总之，我们的结果表明，正常层粘连组织的破坏会抑制RNA聚合酶II的活性。我们相信这些发现提供了第一个实验证据，证明特定的核结构蛋白，即层粘连蛋白参与mRNA的合成。再加上有关层粘连分布在整个核质中的报道，这些发现增加了层粘连蛋白作为支架的可能性，RNA聚合酶II转录所需的基础转录因子在其上被组织。

材料和方法

致谢

脚注

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