转座子相关蛋白复合物在内质网膜转运过程中的底物特异性功能

TRAP复合物TrAF的纯化和鉴定

用盐梯度洗脱与Q-sepharose结合的蛋白质，然后用ConA分馏，始终只导致五种主要蛋白质的大量富集(图2A） ●●●●。这些蛋白质可以通过免疫印迹、各自的大小和丰度被鉴定为calnexin（CNX）和TRAP复合物的α到δ亚基（未发表的数据；图2B） ●●●●。然后用去Q提取物将每个组分核心构成蛋白质脂质体，并通过免疫印迹法进行分析(图2B） 和易位活性(图2C） ●●●●。然而，每个蛋白脂质体中的Prl易位是可比较的，^秒PrP易位因Q-缺失而减少，不同组分在不同程度上补充(图2C） ●●●●。我们始终注意到^秒PrP易位与含有TRAP的组分相对应，在较小程度上与CNX易位相对应(图2，比较B和C）。

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图2。

TrAF的纯化和TRAP复合物的鉴定。（A） 图中所示为考马斯蓝染色凝胶，由离子交换和ConA色谱分离膜蛋白的部分组成。显示了TRAP复合物的CNX和α到δ亚基的位置。（B） 针对使用A组分制备的蛋白质脂质体中各种蛋白质的免疫印迹。Lanes 1和Lanes 2分别含有从总洗涤剂提取物和去Q洗涤剂提取物中重建的蛋白质脂质。通道3-12包含以去Q洗涤剂提取物和通道3-12中的各个组分为核心的蛋白脂质体。（C）使用B组蛋白脂质体对PrP和Prl进行转运分析。还显示了缺乏膜或含有RM的对照反应，以进行比较。只显示了用PK消化翻译反应后残留的移位物质。的效率^秒PrP和Prl易位，相对于通道1中未分离的蛋白质脂质体，显示在放射自显影下面。（D） 从RAMP部分纯化TRAP复合物。图中所示为考马斯蓝染色凝胶，含有纯化的最终部分。（E） 用不同浓度的RAMP纯化的TRAP或总Q洗脱液补充去Q洗涤剂提取物，并将其重组为蛋白质脂质体。作为对照，一种未分解的洗涤剂提取物也被平行重组。顶部显示的是针对不同蛋白质脂质体的TRAPα的免疫印迹。TRAP的含量，即未分离蛋白脂质体中TRAP含量的百分比，显示在印迹上。底部面板显示了PrP转位到这些蛋白脂质体的分析。仅显示蛋白酶消化后残留的移位产物。（F） 范围^秒对E组分析中的PrP易位进行量化，并绘制条形图。用总Q洗脱液部分补充的Q贫化蛋白脂质体中的易位量被定义为100%。

两个观察结果使我们关注TRAP，而不是CNX，作为这些组分中可能的活性成分。首先，与TrAF活性和TRAP相比，CNX不是一种糖蛋白，并且通常被ConA（未发表的数据）消耗得相当少。因此，它与刀豆蛋白a的结合似乎是由一种糖蛋白间接介导的，而与该糖蛋白的结合是可变的和弱的。与这一观点一致的是，CNX在一些研究中被证明与TRAP有关，但在其他研究中没有(Wada等人，1991年；哈特曼等人，1993年)或许可以解释其在含有TRAP的馏分中的不同污染程度。其次，含有CNX但不含TRAP的组分（例如Q-结合非糖蛋白）在刺激中不活跃^秒PrP易位（未公布数据）。总之，这些观察结果表明TrAF活性可能归因于TRAP复合物。

测试四聚体TRAP复合物本身是否是刺激^秒PrP易位，我们利用了它与核糖体紧密结合的优势(Gorlich等人，1992年b；马特拉克和沃尔特，1995年)以将其与任何污染的CNX分离。核糖体相关膜蛋白（RAMP）组分的阴离子交换色谱(Gorlich和Rapoport，1993年)导致TRAP准备(图2D） 免疫印迹法检测不到CNX（未发表数据）。这种RAMP纯化的TRAP的滴定表明，它可以恢复^秒PrP移位至与用总Q洗脱液补充去Q提取物时所见水平相当的水平(图2、E和F). 这些数据表明，TRAP不仅能够刺激^秒PrP易位，而且它很可能是Q-sepharose耗尽的主要活性成分（如果不仅仅是）。因此，通过两种独立的纯化方法，富含TRAP的组分在刺激PrP易位方面是活跃的。因此，我们得出结论，TrAF活性最初是由其对PrP易位和拓扑学的底物特异性要求定义的，而不是Prl易位(Hegde等人，1998年b)，是四聚体TRAP复合物。

转位对TRAP的依赖性受信号序列的影响

接下来，我们试图确定TRAP功能的底物特异性的基础，该功能允许Prl而不是PrP完全独立于TRAP进行移位。因为Prl和PrP之间最明显的区别是后者（而不是前者）是以多种拓扑形式合成的，所以我们分析了消除这种特性的PrP突变体的行为。PrP（G123P）破坏PrP中潜在的跨膜结构域，仅在^秒PrP表单(Hegde等人，1998年a)因此在拓扑上等价于Prl。当分析缺乏和含有TRAP的蛋白脂质体时，我们发现PrP（G123P）的易位受TRAP的影响，其方式类似于^秒野生型PrP的PrP形式(图3B） ●●●●。PrP的其他突变体也观察到了类似的结果，这些突变体消除或减少了其拓扑异质性（未发表的数据），认为PrP的拓扑异质性不太可能是其对TRAP需求的基础。

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图3。

转位对TRAP的依赖性受信号序列的影响。（A） 针对蛋白质脂质体的各种蛋白质的免疫印迹，该蛋白质脂质体由未分解的去垢提取物（Total）、去Q去垢提取物和补充RAMP纯化TRAP的去Q提取物制成，其水平与未分解提取物相当。（B） Prl、PrP和PrP（G123P）从A组转移到蛋白脂质体中，或缺乏蛋白脂质体的对照反应。显示了用PK消化之前（顶部）和之后（底部）的翻译反应等分。（C） 对Prl–G123P（包含融合到PrP[G123P]成熟结构域的Prl信号序列）和PrP–Prl（包含融合至Prl成熟结构域PrP信号）的TRAP依赖性进行分析，如B中所示。

为了研究这两种底物的不同易位行为是否可归因于其信号序列的差异，我们制备了嵌合分子，其中Prl信号融合到PrP的成熟结构域（G123P）（称为Prl–G123P，PrP信号融合到成熟结构域Prl（称为P rP–Prl）值得注意的是，简单交换这两种底物的信号序列就足以使TRAP非依赖性易位为PrP（G123P），TRAP依赖性易变为Pr1(图3C） ●●●●。因此，底物转运期间对TRAP的需求受用于指导其转运的信号序列的影响。

TRAP依赖性与靶后信号序列函数的相关性

PrP和Prl信号序列在许多物理和功能特征上存在差异，包括长度、疏水性、电荷、氨基酸组成以及对底物移位的影响(Rutkowski等人，2001年；Kim等人，2002年). 为了深入了解这些特征是否影响对TRAP易位依赖性，我们利用了一系列结构，对融合到PrP成熟域的八个哺乳动物信号序列中的每一个进行编码(Kim等人，2002年). 对这些自然信号序列的比较分析表明，含有Prl、生长激素（GH）和骨桥蛋白（Ost）信号的结构物的移位受TRAP存在或不存在的影响程度小于PrP(图4A） ●●●●。相比之下，其他四个信号分析显示更多依赖TRAP来指导PrP成熟结构域的易位。

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图4。

不同基底的信号序列对TRAP的依赖性不同。（A） 包含与PrP融合的各种哺乳动物蛋白质信号序列的结构(Kim等人，2002年)检测其转位到缺乏或含有RAMP纯化TRAP的Q缺失蛋白脂质体（如图3A） ●●●●。为了便于直接比较，使用同一批蛋白质脂质体平行分析所有构建物。绘制了与缺乏TRAP的膜相比，向含有TRAP的蛋白质脂质体整体移位的百分比增加。每个底物（占总合成翻译产物的百分比）向含有TRAP的蛋白质脂质体的最大总转运效率如下图所示。本实验中使用的信号序列和特性如所示图5（B）分析融合到牛Prl成熟结构域的指示信号序列对TRAP易位的依赖程度，如A。

当与Prl成熟结构域融合时，Ost和leptin信号显示出性质相似的特性：leptin而非Ost信号序列需要TRAP来指导底物的最大移位(图4B） ●●●●。此外，应该注意的是，对于融合到PrP和Prl的相同信号，在TRAP依赖性方面观察到一些差异(图4; 可能表明成熟域的特征也可能在一定程度上影响TRAP依赖性。尽管这仍有待调查，但结果如下图4证明了TRAP依赖性的一个重要决定因素是信号序列，它在这个特征中从基底到基底的范围很广。

通过几个标准对TRAP依赖性分析的八个信号的序列进行比较，以阐明物理性质（如果有的话）可能是一个重要的决定因素(图5). 然而，信号序列的单一特征与它们各自对TRAP的功能依赖性无关。这包括总长度、最大疏水性、疏水结构域的长度、n结构域的电荷（信号疏水核心之前的非疏水结构域；冯·海因（von Heijne），1985年)或疏水域上的电荷差。对信号的水病特征的定性评估也没有揭示出简单的相关性。最后，在信号疏水核心的氨基酸组成中没有观察到系统性差异（区分亮氨酸/异亮氨酸/缬氨酸与丙氨酸/苯丙氨酸/色氨酸）。总之，这些观察结果表明，TRAP依赖性是由信号序列的多个物理特征的组合或未在此分析的特征决定的。

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图5。

不同TRAP依赖性的信号序列的物理特性。显示了八个信号序列（人类Prl、猪GH、大鼠Ost、仓鼠PrP、猪瘦素[Lep]、人血管紧张素原[Ang]、猪心房自然肽[ANP]和猪干扰素-γ[Ifn-γ]）的几个参数。通过以下方法确定水病基特和杜立德（1982）使用一个包含七个残留物的窗口。在计算n区域（疏水核心之前的区域）的净电荷或疏水区域两侧的电荷差时，氨基末端、赖氨酸和精氨酸各自贡献净+1电荷，而天冬氨酸和谷氨酸则贡献净-1电荷。所有的亲水性图都以相同的比例显示，以便进行直接比较。

因此，我们询问不同底物的信号序列的功能特征是否与它对TRAP易位的依赖性相关。信号序列至少有两个主要功能：信号识别粒子介导的靶向易位子新生链(沃尔特和约翰逊，1994年)以及一个决定性的靶向后易位“门控”步骤，使底物启动其NH的易位₂终点(Jungnile和Rapoport，1995年). 在最近的一项研究中Kim等人（2002）下游跨膜结构域与NH的信号介导启动竞争的能力₂末端易位被用来证明不同哺乳动物信号序列的相对门控效率有很大差异。当我们将八个信号序列的相对选通效率与其TRAP依赖性进行比较时，我们注意到显著的负相关(图6). 因此，含有信号序列的基板具有较弱的选通活性（通过Kim等人，2002年)与门控活性更强的人相比，他们在易位过程中对TRAP的需求更大。

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图6。

信号的TRAP相关性和靶后选通功能的相关性。来自的八个信号序列图5图中显示了它们对TRAP在x轴易位的相对依赖性以及在y轴上的靶后门控活性。每个信号序列的选通活动都取自先前发表的工作中报告的数据(Kim等人，2002年). 在这项研究中，门控被定义为一种信号在转座子处启动底物移位的能力，并根据一项使用PrP拓扑结构作为NH效率报告者的分析进行测量₂-末端易位(Kim等人，2002年)。

分馏和重组

如前所述，制备提取的皂苷、EDTA和高盐洗涤的RM(Hegde等人，1998年b)并以1 eq/μl的速度重新悬浮（参见沃尔特和布洛贝尔，1983年EB（350 mM KAc，50 mM Hepes，pH 7.4，5 mM MgCl₂、15%甘油、5 mM 2-巯基乙醇和蛋白酶抑制剂混合物（不含EDTA的完全抑制剂；罗氏应用科学公司）。将DBC从10%wt/vol储备溶液中添加至0.8%，并在TL100超离心机（Beckman Instruments）中通过离心去除大于～30s的颗粒，以获得RMs的DBC提取物。通过培养制备去糖蛋白提取物，轻轻混合，DBC提取物与ConA sepharose（在EB中平衡）在4°C下分批放置8–12 h，ConA填充珠与1000当量DBC提取物的比率为150μl。每1000当量DBC提取物使用150μl Q-sepharose Fast Flow（在EB中平衡）制备去Q提取物，在4°C下分批培养4–12 h。在洗脱之前，用含有0.5%DBC的EB将树脂洗涤四次，每次洗涤6-10体积。通过在500 mM KAc、50 mM Hepes、pH 7.4、10 mM EDTA、0.25 Mα-甲基甘露糖糖苷、15%甘油、5 mM 2-巯基乙醇、0.5%DBC中在25°C下孵育90分钟，从ConA中洗脱糖蛋白。如图图例所示，在含有0.5%DBC和适当KAc浓度的EB中从Q-琼脂糖中洗脱蛋白质。将提取物重组为蛋白质脂质体通常在200μl体积中进行，其中100μl按1当量/μl的DBC提取物、去糖蛋白提取物或去Q提取物。剩余的体积用于添加粗蛋白质组分和/或纯化蛋白质，并含有300至1000 mM KAc、50 mM Hepes、pH 7.4、15%甘油和0.5%DBC。ConA的洗脱液还含有高达10mM的EDTA和0.25M的α-甲基甘露糖糖苷。根据需要，使用含有0.5%DBC的EB使最终体积达到200μl，然后添加100μg脂质（来自20 mg/ml储备溶液），并将整个混合物添加到如上所述制备的150 mg Biobeads SM2中。在4°C下孵育并混合12–18 h后，将流体从珠中分离出来，并用冰水稀释至1 ml，然后将蛋白质脂质体以70000 rpm的速度沉淀在带有微型离心管适配器的TL100.3转子中15 min。根据实验结果，将颗粒重新悬浮在50 mM Hepes、pH 7.4、100 mM KAc、2 mM MgCl中，最终体积在20至40μl之间₂，250 mM蔗糖，1 mM DTT，在液氮中冷冻，并在−80°C下储存，直到用于移位反应。通常，每10μl翻译反应使用0.5–1μl这些蛋白脂质体。

TRAP的纯化

如前所述，用约30000当量的猪胰腺微粒体制备透析RAMP部分(Gorlich和Rapoport，1993年). 这与在20 mM Hepes、pH 7.6、5 mM MgAc中平衡的6 ml Q-sepharose快速流动色谱柱结合₂，1%洋地黄，5 mM 2-巯基乙醇，用20 ml平衡缓冲液洗涤，并用10 ml 1000 mM KAc，50 mM Hepes，pH 7.6，2.5%洋地黄、10%甘油和5 mM 2-巯基乙醇分步洗脱。将该粗TRAP级分的峰级分（~3.5 ml）合并并冷冻在液氮中的等分试样中，并在−80°C下储存，直到需要重构。在将其用于再造之前，用等体积的50 mM Hepes（pH 7.4，5 mM MgCl）稀释500μl粗TRAP₂，15%甘油，分批结合（4°C下60分钟，混合）至50–70μl Q-sepharose Fast Flow，并用每1ml含有0.5 M KAc和0.5%DBC的EB洗涤两次，以交换洗涤剂并去除污染物。随后，用含有600、700、800、900和950 mM KAc和0.5%DBC的EB连续250μl步骤洗脱纯TRAP。如上所述，将峰分数合并并用于重组。这些最终纯化-洗涤剂交换步骤的蛋白质剖面如所示图2D.该RAMP纯化的TRAP用于补充在图3,​,4,4,​,6,6、和​和88。

无细胞易位分析

之前已经描述过用SP6或T7 RNA聚合酶进行体外转录、在兔网织红细胞裂解物中进行翻译以及用狗胰腺RM进行移位(Hegde等人，1998年b以及其中的参考）。如前所述，通过蛋白酶保护对RMs和重组蛋白脂质体中PrP和Prl的易位和拓扑结构进行分析(Hegde等人，1998年b). 缺失终止密码子的截短转录本是通过两种方法之一制备的。对于中的串行截断图7A、 分别用5′和3′寡核苷酸退火SP6启动子和截断位点，在转录前PCR扩增质粒的适当片段（使用Pfu聚合酶；Stratagene）。或者，在图7（B和D）分别使用Pvu2-消化质粒（在成熟Prl的密码子56处裂解）和EcoO109-消化质粒（切割成熟PrP的密码子101处）。通过在26°C下5分钟后添加aurin三羧酸来同步编码截短产物的翻译反应，然后在26°C下再进行20分钟的翻译。通过在翻译反应中加入RMs（0.1 eq/μl）进行移位(图7A） 或在核糖体-新生链合成后添加它们（0.3 eq/μl），并在26°C下再培养15分钟。通过用20体积的50 mM Hepes、pH 7.4、500 mM KAc、5 mM MgCl稀释翻译反应（通常为5μl），在4°C下进行耐盐结合的沉淀分析₂在含有0.5 M蔗糖的同一缓冲液的100μl缓冲液上分层，并在4°C的Beckman TL100.3转子中以70000 rpm的转速离心5分钟，带有微型离心管适配器。在随后对颗粒进行分析之前，通过抽吸去除上清液。如前所述，将0.5 mg/ml蛋白酶K（PK）放在冰上60分钟，对截断的新生链进行蛋白酶保护(Hegde等人，1998年b). 用嘌呤霉素和高盐释放新生链，方法是在26°C培养15分钟之前，将翻译反应调整为0.5 M KAc和1 mM嘌呤霉菌素，易位产物与针对翻译产物的适当抗体进行免疫沉淀，因为许多截短的产物和^Ntm公司PrP和^Ctm公司PrP片段迁移到网织红细胞裂解物中高度丰富的内源性珠蛋白附近，这通常会扭曲凝胶的该区域。

我们感谢Soo Jung Kim、Erik Snapp、Tom Rapport、Sandy Simon及其实验室成员Harris Bernstein和Doug Lowy的宝贵讨论；Soo Jung Kim、Jeff Salerno和Devarati Mitra帮助准备本研究中使用的一些结构；以及T.Rapoport、K.Kellaris、R.Gilmore和S.Prusiner的抗体试剂。此外，我们感谢国家癌症研究所细胞肿瘤学实验室，该实验室开展了大量工作。

这项工作得到了美国国立卫生研究院院内研究计划的支持。