鞭毛内转运蛋白IFT88对脊椎动物感光细胞的组装和维护至关重要

小鼠睾丸和视网膜中的IFT蛋白

衣原体IFT颗粒沉积物作为17S复合体(科尔等人，1998年). 为了确定四种哺乳动物同源物是否也存在于一个大的复合体中，我们在蔗糖梯度上分离了小鼠睾丸的细胞质提取物，并通过Western blotting检测了IFT颗粒蛋白的分布(图1、a和b）。之所以选择睾丸，是因为该组织中的IFT蛋白比包括视网膜在内的任何其他组织中都要丰富得多。这四种哺乳动物IFT蛋白在17S共沉积，表明它们与藻类同源物一样，是一个大型复合物的一部分。这些数据提供了哺乳动物系统中IFT颗粒的第一个直接证据，并证明了亲和纯化抗体对IFT蛋白的效用。

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图1。

小鼠睾丸和视网膜中的IFT蛋白。（a和b）对小鼠睾丸蛋白质提取物的蔗糖密度梯度（5-20%）分析表明，IFT88、IFT57、IFT52和IFT20在～17S时结合。（a） 库马西蓝染色凝胶，分子量标记单位为kD，如右图所示。（b） 四种IFT蛋白的蛋白质印迹（标记在右侧）。附加缩写：L，上清液蛋白加载梯度；P、 从最初的蛋白质提取中提取的颗粒。（c） 视网膜提取物的Western blot显示在Tg737中IFT88（箭头）显著降低^−/−（mt）小鼠与野生型（wt）小鼠在p21的比较。（d） 免疫荧光图像显示，IFT88（绿色）位于野生型小鼠视网膜连接纤毛的末端（红色，箭头），但在Tg737突变视网膜中未发现。通过乙酰化微管蛋白抗体（红色）检测连接纤毛。棒材，20μm。

IFT蛋白在视网膜中比在睾丸中更难检测到。西方人用IFT88抗体提取的全视网膜蛋白表明，野生型视网膜含有一种～90-kD蛋白，这种蛋白在Tg737突变视网膜中显著降低(图1c） ●●●●。用该抗体检测到其他几条带。很可能这些是不相关的交叉反应蛋白，因为它们在Tg737突变小鼠中的水平没有改变。使用IFT88抗体对突变型和野生型小鼠视网膜进行染色，看看是否可以检测到差异。IFT88抗体(图1d、 绿色）强烈标记野生型视网膜的IS，但未在突变体中显著标记该片段。染色明显呈颗粒状，最亮的病灶与连接纤毛的光感受器末端有关(图1d、 红色）。突变视网膜中可以检测到连接纤毛，但绿色病灶与之无关，这表明这种染色是由于IFT88蛋白，而不是交叉反应蛋白之一。

牛视网膜中IFT蛋白在基底体和连接纤毛上的定位

视网膜中IFT蛋白的低丰度和小鼠视网膜的小尺寸使生化研究变得困难。为了避免这个问题，我们使用了牛视网膜。牛视网膜经常被用作光感受器研究的生化系统，并且有技术可用于制造清洁剂提取的光感受者细胞骨架（DEPC）部分，该部分富含连接纤毛(霍斯特等人，1987年). 此外，K26单克隆抗体特异性结合感光细胞连接纤毛，是感光细胞连接纤毛的良好标志物(霍斯特等人，1990年)，只在牛的感光细胞中起作用。

针对IFT20、IFT52、IFT57和IFT88的亲和纯化抗体无法在牛视网膜的全细胞提取物中检测到预期大小的蛋白质（未公布的数据）。然而，这些抗体在DEPC组分中分别强烈检测到～16、52、57和90 kD的单条带(图2，a和b），表明这些蛋白质与连接纤毛的光感受器有关。视网膜是由多种细胞类型组成的，很可能在整个视网膜中检测不到IFT蛋白是因为这些蛋白在非感光细胞中并不丰富。如小鼠结果所示，如果IFT蛋白集中在连接纤毛上，DEPC将大大富集这些蛋白，因为DEPC的纯化将去除非感光细胞以及感光细胞的大多数蛋白。

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图2。

IFT颗粒蛋白存在于牛的光感受器中。（a和b）蛋白质印迹显示在富含纤毛轴突的牛DEPC制剂中存在IFT颗粒蛋白。针对小鼠IFT颗粒蛋白的抗体可识别预测大小的单一条带（IFT88，90 kD；IFT57，57 kD；IFT52，52 kD；EFT20，16 kD）。左边（a）和右边（b）的数字是分子量标记。（c） 新鲜冷冻牛视网膜共聚焦免疫细胞化学图像，从左到右标记有IFT88、IFT57、IFT52和IFT20抗体。IFT颗粒蛋白主要定位于IS。染色在连接纤毛所在的IS和OS层的交界处呈点状。染色也见于外丛状层（OPL），即光感受器突触终末所在的位置，在较小程度上也见于ONL。INL表示内核层。（d–j）IFT颗粒蛋白定位于感光细胞纤毛和基底体。（d） 牛视紫红质B6-30N（绿色）单克隆抗体标记牛OS(Besharse和Wetzel，1995年)用K26（红色）单克隆抗体标记连接纤毛。（e和f）轴突用乙酰化α-微管蛋白单克隆抗体标记（绿色），连接纤毛用K26标记（红色）。箭头表示纤毛的远端。（g–j）连接纤毛用K26（红色）检测，而IFT20（g）、IFT52（h）、IFT57（i）和IFT88（j）用亲和纯化的兔抗体（绿色）检测。箭头表示纤毛的远端。（k–m）用IFT57（蓝色）抗体标记的三重标记图像叠加在连接纤毛（K26，红色）和乙酰化α-微管蛋白（绿色）的标记上。k–m中的小箭头表示标记位于连接纤毛的远端；大箭头表示靠近连接纤毛的标记。棒材：（c）20μm；（d和e）10μm；（f） 5微米；（m） 2微米；（g–j）指e；（k和l）指m。

免疫细胞化学分析证实IFT20、IFT52、IFT57和IFT88在牛感光细胞的IS中最丰富(图2c） ●●●●。IS中的信号在外观上明显呈颗粒状，尤其是在IS层和OS层之间连接纤毛的边界处。外丛状层的免疫反应较弱，其中包含感光细胞的突触终末。这和这些突触中的驱动蛋白II的存在(Muresan等人，1999年)提出IFT蛋白可能在光感受器突触终末发挥作用的可能性。

用单克隆抗体（K26）识别未知连接纤毛特异性表位的双标记免疫细胞化学(霍斯特等人，1990年)证明所有四种IFT蛋白都与纤毛和基底体原位相关(图2，d–j）。K26抗体唯一地染色了OS基底部的连接纤毛，并用杆状视蛋白抗体进行了鉴定(图2d） ●●●●。相反，乙酰化α-微管蛋白抗体标记IS和睫状轴丝的微管(图2，e和f). 连接纤毛中K26（红色）和乙酰化α-微管蛋白（绿色）抗体的重叠导致黄色至橙色，并表明轴突微管远超出连接纤毛延伸至OS。IFT20、IFT52、IFT57和IFT88抗体标记大多数感光细胞中连接纤毛的近端（IS）和远端（OS）(图2，g–j）。连接纤毛的频繁黄色到橙色表明两个标签重叠(图2、i和j; 红色，K26；绿色，抗IFT抗体）。三重标签图像显示了类似的模式(图2，k–m），其中IFT57（蓝色）与大多数光感受器中连接纤毛（红色，K26）两端的微管（绿色，乙酰化α-微管蛋白）相关。

IFT88/Tg737突变等位基因对感光细胞的影响

为了直接测试IFT在感光细胞中的作用，我们检测了纯合小鼠视网膜中Tg737基因的插入突变。Tg737等位基因是通过将DNA整合到一个外显子中而产生的，但不影响相邻外显子的编码潜力。这降低了但并没有完全消除该基因产生蛋白质的能力(Moyer等人，1994年;Taulman等人，2001年; 未发布的数据）。Tg737编码IFT88(Pazour等人，2000年)也称为“北极星”(Murcia等人，2000年). 该基因突变导致衣原体,秀丽线虫，以及小鼠肾脏和胚胎淋巴结(Murcia等人，2000年;Pazour等人，2000年;Haycraft等人，2001年;秦等，2001). 原始Tg737插入突变小鼠系是常染色体隐性遗传纯合子Pdeb公司 ^第1版在出生后第20天之前导致感光细胞快速退化的突变（p）20(Carter-Dawson等人，1978年;Bowes等人，1990年;Pittler和Baehr，1991年). 因为Pdeb公司 ^第1版突变将掩盖Tg737突变的影响，培育小鼠以消除其中一种或两种Pdeb公司 ^第1版突变等位基因。Tg737突变纯合子，为杂合型和纯合野生型Pdeb公司 ^第个在p10、p21、p45、p77和p84进行研究。

小鼠OS通常在p4左右开始发育，通过p20实现成人比例，椎间盘膜排列整齐(拉威尔，1973年). 在Tg737突变小鼠中，形成正常数量的光感受器，但OS结构在检查的所有时间点都异常。在p10，Tg737突变小鼠中的OS的大小大大减小，并且很难通过光学显微镜看到(图3，A和B). 在EM水平上，突变的OS是无组织的。在野生型动物中，大多数圆盘在堆叠阵列中排列良好(图3、C和D)，但这在Tg737突变型OS中很少见到(图3、E和F). 相反，椎间盘通常与连接纤毛平行而不是垂直形成，在某些OS中，椎间膜被分成小段(图3E） ●●●●。另一个常见的异常是OS从is侧面发展，并且OS部分侵入is(图3F） ●●●●。这种异常现象表明，正确定位基底体的机制被破坏了，因为在野生型小鼠中，OS总是从IS的顶端（远端）发育而来。

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图3。

Tg737突变小鼠p10处的杆细胞OS异常。（A） 典型的野生型视网膜在p10显示OS发展程度（箭头）。（B） 与野生型相比，p10处的Tg737突变体视网膜显示更小、密度更低的OS（箭头）。RPE表示视网膜色素上皮。（C和D）第10页野生型动物中的OS示例。在C语言中，箭头表示与正常操作系统相邻的异常操作系统。这种非典型OS仅在野生型小鼠中偶尔观察到。在D中，箭头表示在连接纤毛（CC）附近形成的圆盘。（E和F）第10页Tg737突变小鼠中异常OS的典型示例。断裂的椎间盘（E，箭头）和延伸到自身IS的OS（F，箭头）在p10的Tg737突变视网膜中广泛存在。棒材：（A和B）10μm；（C–F）1μm。

在p21，Tg737突变视网膜的外核层（ONL）感光细胞核数仍接近正常(图4，a–d）。然而，突变的OS在大小或排列上并不均匀，并且似乎不太丰富(图4，a和b）。野生型和突变型OSs均显示丰富的视蛋白免疫反应(图4、c和d). 与野生型相比，在ISs和Tg737突变光感受器的细胞体中观察到视蛋白免疫反应(图4、c和d、和图7). 在EM层面(图4，e和f)与野生型光感受器相比，突变型光感受器排列不均匀、密度较小，并且包含更宽、组织更少的圆盘。此外，突变视网膜的细胞外空间充满了囊泡物质（见下文）。

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图4。

杆状细胞OS异常，视蛋白在Tg737突变小鼠p21处定位错误。（a和b）甲苯胺蓝染色切片表明，与野生型（a）的类似切片相比，突变OSs（b）的组织结构和密度更低。（c和d）第21页野生型（c）和Tg737突变型（d）视网膜冰冻切片中视杆蛋白（红色）和IFT88（绿色）的免疫细胞化学。野生型和突变体动物都显示出杆状OS的强视蛋白染色，但在突变体的is和细胞核周围（ONL）也检测到视蛋白。IFT88存在于is（c）中，但在突变体（d）中减少。（e和f）IS层和OS层之间连接处的电子显微照片，表明突变（f）光感受器在结构和组织上不如野生型光感受者（e）均匀，并积聚细胞外囊泡（EV）。其他缩写与图2和​和3。三棒材：（a和b）20μm；（c和d）40μm；（e和f）1μm。

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图7。

Tg737突变小鼠OSs中视杆蛋白和ROM1的EM水平免疫细胞化学定位。（a和b）视蛋白在p21野生型视网膜OS中的分布。OS的免疫反应丰富，但在is质膜（ISPM）和连接纤毛（CC）中检测到非常低的水平。（c和d）视蛋白在第21页Tg737突变视网膜的OSs中的分布。Opsin在突变型OS中的含量与野生型相似，但在is质膜和连接纤毛中的含量远高于野生型。此外，视蛋白存在于野生型动物未发现的细胞外囊泡（EV）中。（e–g）ROM1在野生型（e）和Tg737（f和g）光感受器中的分布。ROM1（箭头）位于野生型动物的椎间盘边缘和切口处。在那些表现出有组织圆盘（f）的Tg737突变杆中检测到类似的模式，但ROM1在具有无组织圆盘（g）的OS中的含量似乎要少得多。棒材：（b和c）1μm；（e、f和g）0.5μm；（a） 参考c；（d） 参见b。

到p45时，与同窝对照组相比，Tg737突变小鼠的ONL厚度显著降低(图5，A和B). 突变体ONL中的致密核表明感光细胞因凋亡而死亡。光感受器的损失，通过ONL的减少来衡量，达到60-80%(n个=6视网膜），p77(图5C） ●●●●。在p84检测到的一个突变视网膜中，只能看到一层感光细胞核(图5D） ●●●●。因此，Tg737突变导致进行性光感受器变性，p77导致细胞大量损失。在小鼠中，许多遗传性视网膜变性疾病的特征是早期形成接近正常的光感受器补体，然后通过凋亡细胞死亡进行性丢失，但与p20之前的快速变性有显著不同Pdeb公司 ^第1版老鼠(Carter-Dawson等人，1978年).

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图5。

光镜图像显示Tg737突变小鼠的感光细胞逐渐丢失。（A） p77典型野生型视网膜的全厚切片。（B–D）Tg737突变小鼠p45、p77和p84的视网膜全厚视图，显示ONL的细胞核丢失，IS和OS层逐渐变薄。所有图像均来自用甲苯胺蓝染色的1μm厚塑料切片。其他缩写：G，神经节细胞层；INL，内核层；IPL，内丛状层；OPL，外丛状层。棒材，20μm。

在开发的后期阶段(图6)，一些Tg737突变型感光体严重异常，而其他感光体则表现出相对正常的形态，但即使在这里，椎间盘的直径通常也明显大于野生型感光器。尽管小鼠的视网膜以杆状为主，但少量的视锥细胞也受到破坏（未公布的数据），如果IFT88在两种感光细胞类型中都起作用，这是可以预料的。此外，在p21处取样的视网膜，以及随后在细胞间的细胞外空间积聚无定形膜泡(图6、B和D). 这些小泡可能是光感受器的泡状碎片，由于进入OS的传输中断而积聚。Tg737视网膜的退行性变化似乎与OSs和感光细胞的死亡特别相关。因此，在Tg737突变小鼠中观察到的视网膜厚度的总体减少可以解释为OS、IS和感光细胞核层的损失(图5).

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图6。

EM图像显示Tg737纯合突变体p45和p77的异常感光细胞组织。（A） 来自野生型动物的典型组织良好的OS的图像。（B–D）Tg737突变小鼠p45。丰富的细胞外囊泡（D，小箭头），在活体感光体之间有无定形内部积聚；这在野生动物中从未见过。在感光层（D，大箭头）中经常可以看到收缩、死亡的感光细胞，有时在感光细胞中可以看到巨噬细胞（B，M）。（E和F）第77页感光细胞晚期丢失。在E中，色素上皮（RPE）附近可见一个异常的OS，相对正常的椎间盘被异常大的椎间膜包围。在F中，在RPE附近可以看到单个发育不全的OS，其具有轮匝的椎间盘膜及其连接纤毛（CC）。请注意，米勒细胞体（MC）及其之间的连接复合体（F，箭头）通常通过感光层IS和OS层的全厚度与RPE分离，与F.Bars中的RPE在同一视野中可见：（A和E）1μm；（B、D和F）指A；（C） 参见E。

光受体内转运模型

我们的数据允许我们提出一个模型(图8)基于这样一种想法，即通常在IS中合成并通过连接纤毛靶向OS的一个或多个细胞骨架、膜（包括视紫红质、外周蛋白-2、Rom-1和磷脂）或细胞溶质蛋白组分（包括IFT蛋白）通过IFT运输。这些大分子都是在IS中合成的。IS微管的极性(特劳特和伯恩赛德，1988年)其负端与纤毛基底相连，表明膜泡是通过细胞质动力蛋白1转运到那里的。这种动力蛋白是一种成熟的囊泡转运蛋白，已被证明与视紫红质的细胞质尾部相互作用(Tai等人，1999年). 在IFT颗粒蛋白最集中的连接纤毛的底部，IFT颗粒与囊泡表面和纤毛轴丝成分以及OS的可溶性蛋白如转导蛋白和抑制素相结合。一旦囊泡与纤毛附近的质膜融合，复合物就会通过驱动蛋白II沿着连接纤毛移动。Kinesin-II是衣原体(Kozminski等人，1993年;科尔等人，1998年)和隐杆线虫病(Orozco等人，1999年;Signor等人，1999b). 激动素-II定位于脊椎动物的连接纤毛(Beech等人，1996年;Whitehead等人，1999年)和KIF3A激酶II亚单位存在光感受器特异性缺陷的小鼠在IS中积累视蛋白和抑制素(Marszalek等人，2000年). 在OS中，IFT颗粒与其货物脱离，膜通过涉及肌球蛋白VIIA的机制被组织成圆盘。肌球蛋白VII是吞噬细胞所必需的粘液菌(提图斯，1999)肌球蛋白VIIA基因缺陷的小鼠在连接纤毛中积累视蛋白(Liu等人，1999年). 然后，转导机制和细胞骨架的可溶性蛋白质与OS内的适当蛋白质复合物结合，到达连接纤毛远端的IFT颗粒通过细胞质动力蛋白1b/2返回纤毛的基部。这个动力蛋白是逆行IFT马达衣原体(Pazour等人，1998年,1999;波特等人，1999年)和隐杆线虫病(Signor等人，1999年a)并且已经定位于脊椎动物感光器的连接纤毛（未发表的数据）。在连接纤毛的底部，IFT颗粒重新进入由IFT颗粒蛋白组成的基底周体池，再次开始循环。IFT颗粒还可以将转导机制的组成部分从OS移动到IS。例如，据报道，转导蛋白和抑制素在光适应和暗适应期间都在片段之间快速移动(Phillp等人，1987年;惠兰和麦金尼斯，1988年)，并在KIF3A突变小鼠的IS中积累arrestin(Marszalek等人，2000年).

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图8。

感光细胞IFT模型。细胞质动力蛋白1将小泡从高尔基体堆积物运输到连接纤毛的底部。IFT颗粒与小泡相结合，小泡在连接纤毛的底部与纤毛或质膜融合。带附着货物的IFT颗粒随后通过驱动蛋白II通过连接纤毛运输。在连接纤毛的远端，IFT颗粒与其货物分离，膜组织成盘状，IFT微粒被细胞质动力蛋白1b/2拾取并返回细胞体。

抗体生产

通过将小鼠NDG5（IFT52）、IFT57和IFT20的整个开放阅读框以及Tg737（IFT88）的COOH末端459密码子克隆到pMalc表达载体（新英格兰生物实验室有限公司），通过将细菌表达的麦芽糖结合融合蛋白注射到兔子体内，产生抗体。用固定化谷胱甘肽亲和纯化血清-S公司-转移酶融合蛋白。后一种融合蛋白是通过将IFT基因的开放阅读框克隆到pGEX-6p-1（Amersham Pharmacia Biotech）表达载体中制成的。

DEPC和蛋白质印迹的制备

用SDS样品缓冲液直接溶解制备小鼠和牛视网膜的全视网膜提取物。DEPC的编制如下所述霍斯特等人（1987）简而言之，从缓冲液A（10 mM管道，pH 7.0，1 mM EDTA，5 mM MgCl₂，0.02%硝酸钠_三)通过蔗糖密度离心纯化，添加蛋白酶抑制剂鸡尾酒（1μg/ml胃蛋白酶抑制素、1μg/ml亮氨酸肽、4μg/ml抑肽酶、1 mM苯甲脒、1 mM-PMSF）。然后在含有2%Triton X-100的缓冲液A中提取OS。通过在45-60%线性蔗糖梯度上离心，从洗涤剂-可溶性物质中分离纤毛轴突。在12%变性聚丙烯酰胺凝胶上分离等分样品，并转移到Immobilon™膜上，使用SuperSignal West Femto化学发光系统（Pierce Chemical Co.）进行抗体标记和检测。用IFT88抗体对突变小鼠视网膜组织进行蛋白质印迹分析，在p21纯合突变小鼠和野生型小鼠上进行。

蔗糖梯度分析

蔗糖密度梯度分析按照科尔等人（1998）使用五个冷冻小鼠睾丸（0.5 g组织；Pel-Freez Biologicals）。将组织解冻、切块并在Dounce均质器中在0.5 ml HMDEK缓冲液中均质2 min(科尔等人，1998年)含蛋白酶抑制剂：2.5 mM 4-氨基苯甲脒、2.0 mM PMSF、1μg/ml胃蛋白酶抑制素A、1μg/ml抑肽酶、1μ/ml亮氨酸蛋白酶和50μg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂。在冰上放置10分钟后，离心匀浆（16000克)在4°C下保持10分钟，并进一步离心上清液（178000克; Beckman Airfuge）在25°C下保持5分钟。将NaCl添加到300 mM的最终浓度，并在含300 mM NaCl的HMDEK中的5–20%线性蔗糖梯度上分馏上清液。

免疫荧光和共焦成像

将新鲜的小鼠或牛视网膜组织置于tissue Freezing Medium™（Triangle Biomedical Sciences）中，并在液氮中快速冷冻，事先固定或不固定在4%多聚甲醛中。用于小鼠视网膜的免疫荧光图1石蜡包埋固定组织。去除石蜡后，将切片在10 mM柠檬酸钠（pH 6）中煮沸10分钟，并用0.1%硼氢化钠在PBS中处理30分钟图4，冷冻切片在10 mM柠檬酸钠缓冲液中煮沸15分钟。用与Cy3（Jackson ImmunoResearch Laboratories）、Texas red™、荧光素、Alexa 488、Alexa 568或Alexa 633（Molecular Probes）缀合的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG检测初级抗体。在双标记实验中，K26与IFT蛋白信号的区分分别涉及使用结合的抗鼠抗体和抗兔抗体。为了区分两种单克隆抗体（K26 vs.微管蛋白或视蛋白），我们用一种单抗和一种荧光抗鼠抗体进行标记，然后用不同的荧光团重复第二种单抗的程序。使用NIH Image 1.62或Adobe Photoshop对标记有多个荧光团的细胞图像进行假彩色处理和合并^®这些研究中使用的抗体是四种IFT抗体（如上），一种抗视紫红质单克隆抗体（B630N；Besharse和Wetzel，1995年)、单克隆抗乙酰化α-微管蛋白抗体（611β1；Sigma-Aldrich）、抗ROM1抗体（由加拿大多伦多多伦多大学罗德·麦克因斯提供）和针对连接纤毛的牛感光细胞的未知表位的单克隆抗体（K26）(霍斯特等人，1990年).

老鼠繁殖

原始TgN737Rpw小鼠系为常染色体隐性遗传纯合子Pdeb公司 ^第1版视网膜变性缺陷，排除了Tg737突变对视网膜发育影响的分析。为了生产适合分析的动物，杂合Tg737突变小鼠的FVB/N(+/TgN737R密码,Pdeb公司 ^rd1型/Pdeb公司^第1版)背景被培育成野生型C57B6/J（+/+，+/+）动物，该杂交的后代是兄弟姐妹交配产生F2动物，或回交到杂合Tg737 FVB/N亲本。Tg737突变的基因分型如下所述Pazour等人（2000年）.Pdeb公司 ^第1版使用Dde1限制性位点多态性进行基因分型(Pittler和Baehr，1991年)这是由于Pdeb公司 ^第1版突变。

相对长度单位

对于传统EM，在p10、p21、p45和p77处切除Tg737突变动物和同窝对照动物的眼睛。至少六个Tg737^−/−突变眼和Tg737^+/+每次分析对照组；在p84处检测到一个额外的突变。在角膜背面切开后，将眼睛浸泡在2.5%戊二醛和2%甲醛的磷酸盐缓冲液中1–2d，然后手术切除角膜、虹膜和晶状体，将眼镜在1%四氧化锇中固定2h，在乙醇中脱水，并嵌入Embed 812（电子显微镜科学）。埋藏时，眼睛的方向应与背腹经线平行。1μm厚切片用甲苯胺蓝染色，银金薄片用醋酸铀酰和柠檬酸铅常规染色.所有的分析都是在视网膜中央（后极）的细胞上通过中央背经线切片进行的。

埋藏后EM免疫细胞化学

对于植入后的EM免疫细胞化学，取下Tg737突变动物和第21位的同窝对照动物的眼睛，将其固定在磷酸盐缓冲液中4%的多聚甲醛中1–2天。然后，将其在乙醇中脱水，并如前所述嵌入LR White培养基（Polysciences）中(Besharse和Wetzel，1995年). 然后用针对NH的单克隆抗体（B6-30N）培养薄片₂视杆蛋白末端(Besharse和Wetzel，1995年)或使用针对ROM-1的COOH末端的亲和纯化兔抗体(Clarke等人，2000年). 用10 nm胶体金（Amersham Pharmacia Biotech）结合的抗鼠或抗兔IgG检测一级抗体。切片随后在60°C下用醋酸铀酰染色7分钟，以增强对比度。

使用安装在尼康Eclipse TE300倒置显微镜上的CoolSnap摄像机拍摄甲苯胺蓝染色切片。生成的数字图像以每英寸72像素的速度存档。放大5000至20000倍的标准EM照片被扫描转换为数字图像，并以每英寸200像素的速度存档，无需进一步处理。使用Adobe Photoshop整理合成图像^®; 图像处理仅限于亮度和对比度的调整。

作者感谢Wolfgang Baehr（犹他州盐湖城莫兰眼科中心）和Dennis Diener（康涅狄格州纽黑文耶鲁大学）的有益讨论，Rod McInnes提供ROM-1抗体，Scott Seeley和Marleen Janson提供技术支持。我们还感谢马萨诸塞大学医学院（UMMS）EM机构的Greg Hendricks、威斯康星医学院（MCW）EM设施的Greg Ning和MCW眼科机构的Anna Fekete提供的技术支持。

这项工作得到了美国国立卫生研究院的资助（GM-60992给G.J.Pazour；GM-30626给G.B.Witman；GM-14642给J.L.Rosenbaum；EY-03222给J.C.Besharse），国家眼科研究所的视力研究核心资助（EY01931给J.C.贝沙斯），UMMS的糖尿病和内分泌研究中心资助（DK 32520），以及大伍斯特社区基金会（G.B.Witman）的Robert W.Booth基金。