定义桥粒plakophilin-3相互作用

PKP3的头部和手臂结构域分别优先定位于细胞质和细胞核

为了研究全长PKP3及其片段的细胞内分布，在HCT8/E8、MCF7/AZ、COS1和PtK2细胞中转染PKP3表达结构，得到一致的数据。不同结构编码的蛋白质片段的示意图如所示图3在HCT8/E8细胞中，GFP标记的全长人PKP3显示出与单克隆抗体检测到的内源性PKP3类似的细胞内分布，即桥粒中的明确定位，细胞质中较弱，细胞核中缺失(图4a） ●●●●。外源性PKP3与桥粒内源性DP共定位(图4，b和c). 更大的放大倍数强调了这些蛋白质沿着转染细胞的细胞接触点（co）定位(图4，a′-c′）。GFP标记的PKP3ΔHR2蛋白显示出与全长PKP3非常相似的定位(图4d） ●●●●。HR2结构域是PKP头部结构域中唯一的保守序列延伸(波恩等人，1999年). 这种突变蛋白在桥粒中的大量积累与内源性DP重叠(图4，e和f). 较大的放大倍数清楚地显示了转染细胞沿细胞-细胞接触的点状（共）定位(图4，d“–f”和“d”）。相反，GFP标记的PKP3arm片段定位在细胞核中，而在细胞-细胞接触处只观察到微弱的定位(图4g） ；同一单元格字段中的DP检测如所示图4h.GFP标记的PKP3头部结构域通常在细胞质中作为离散聚集体观察到，并且仅在细胞-细胞接触中弱定位(图4i） ；同一字段中DP的控制检测如所示图4j.在MCF7/AZ细胞中，观察到GFP-PKP3头部结构域的类似分布(图4k） ；使用单克隆抗体23E3/4在同一领域检测内源性PKP3如所示图4l.在MCF7/AZ细胞中，与HCT8/E8细胞相比，细胞-细胞接触通常不太明显，有时发现内源性PKP3与GFP-PKP3头部聚集物共定位(图4、k和l). 最后，外源性PKP3headΔHR2显示出类似于PKP3heat的细胞内定位模式（未公开数据）。

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图3。

PKP3片段由真核表达和使用的双杂交结构编码。所有PKP3构建物都包含人类PKP3 cDNA或其片段。GFP和myc标签位于蛋白质的羧基末端。PKP HR2结构域（PKPHR2）是PKPs-1至-3头部结构域中唯一的保守区域。ORF，打开阅读框。

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图4。

外源性GFP标记的PKP3及其片段在HCT8/E8和MCF7/AZ细胞中的细胞内定位。在HCT8/E8细胞中，全长GFP标记的PKP3主要定位在桥粒中，在细胞质中的分布较少（a）。PKP3GFP和DP（b）在转染细胞的桥粒中重叠（c）。从图a–c中箭头所示区域的放大倍数（a′–c′）可以清楚地看到这些蛋白质沿细胞-细胞接触的点状定位。GFP标记的PKP3ΔHR2显示出与全长PKP3（d）相似的细胞内定位，并与转染细胞桥粒中的DP（e）共定位（f）。从图d–f中箭头所示区域的放大倍数（d′–f′）可以明显看出，这些蛋白质沿细胞-细胞接触的点状定位。如图d′′-f′′所示（图d′-f中箭头所示的区域），如果转染细胞接触未转染细胞，GFP-标记的PKP3仅与DP信号的一半重叠。PKP3臂GFP在细胞核内积累到较高水平，但在细胞-细胞接触时几乎没有积累（g）；在同一细胞场中控制免疫检测DP（h）。GFP标记的PKP3head蛋白除了在细胞-细胞接触处更分散的细胞质定位和较少的聚集外，还以离散的细胞质聚集体的形式聚集（i）；控制同一字段中DP的检测（j）。在MCF7/AZ细胞中观察到GFP标记的PKP3head以类似模式存在（k）；使用抗体23E3/4（l）检测内源性PKP3。箭头，PKP3headGFP聚集体中偶尔内源性PKP3定位；箭头所示，外源融合蛋白和内源性PKP3在细胞-细胞接触部位的共定位。标记区域在插图中放大。棒材：10μm（a–j）和20μm（k和l）。

因为COS细胞曾用于PKP1和PKP2蛋白特性的研究(Kowalczyk等人，1999年a;Chen等人，2002年)，在该细胞类型中重复转染实验。如所示图5，全长PKP3（a和b）、PKP3arm（c和d）和PKP3head（e和f）的细胞内定位与我们在MCF7/AZ、HCT8/E8和PtK2细胞中的观察结果一致（后一种细胞类型的未发表观察结果）。

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图5。

外源性GFP标记的PKP3片段在COS1细胞中的细胞内定位。全长PKP3定位于细胞-细胞接触部位，也观察到细胞质聚集（a）。PKP3臂和头部片段分别主要定位于细胞核（c）和细胞质（e）。显示了控制DAPI染色（b、d和f）。棒材，10μm。

外源性PKP3head片段结合DP和CK18蛋白；DP被PKP3招募到细胞边界

用编码GFP标记的PKP3或其片段的构建物转染MCF7/AZ、HCT8/E8和COS细胞，然后进行桥粒相关蛋白的免疫荧光检测。如前一段所述，位于MCF7/AZ细胞中的PKP3头部（如图6a） ●●●●。免疫检测显示DP不仅存在于MCF7/AZ细胞的细胞接触部位，而且也存在于细胞质聚集体中(图6b） ，与PKP3头共同定位(图6c） ●●●●。与HCT8/E8细胞相比，MCF7/AZ细胞的这一观察结果更为明确（与图4、i和j). DP在聚集体中没有与GFP标记的PKP3headΔHR2共定位，因为它只在桥粒细胞-细胞接触中检测到(图6，d–f）。这一观察结果表明，HR2结构域参与了PKP3与DP的结合。相反，CK18在含有GFP-标记的PKP3head（未公开数据）或GFP-标签的PKP3headΔHR2蛋白的聚集体中观察到(图6，g–i），表明PKP3的头部结构域（而非HR2结构域）参与CK18相互作用。显然，这些头部片段的过度合成导致角蛋白丝网络的干扰。在酵母双杂交实验中，DP和CK18都结合PKP3头部结构域（见下文）。其他桥粒蛋白，如Dsg2和PKP2，在PKP3head聚集体中未发现共定位（未发表数据）。在转染实验中使用COS1细胞也获得了类似的结果，例如CK18与COS1中PKP3headGFP的关联(图6，j–l）。

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图6。

桥粒相关蛋白在不同转染细胞中的定位。GFP和FLAG标记蛋白在MCF7/AZ（a–f）、HCT8/E8（g–i）、COS1（j–l）和COS7（m–o）细胞中表达。PKP3head（a和j）和PKP3heatΔHR2（d和g）很容易累积为离散的细胞质聚集体（a和g中的箭头）。内源性DP（b）定位于细胞-细胞接触（箭头）和聚集物（箭头）。在这些聚集物（c）中，与GFP标记的PKP3head有明显的共定位。插图表示箭头所示区域的放大倍数较大。相比之下，GFP标记的PKP3headΔHR2（d）和DP（e）没有协同定位（f），而GFP标记PKP3ΔHR 2（g）和CK18（h）仍然定位在聚集体（i）中，如箭头所示（也见插图，表示放大倍数较大）。对COS1细胞中的PKP3头进行了相同的观察（j–l）。抗CK18抗体（h和k）显示，PKP3headΔHR2或PKP3heat的过度合成会导致角蛋白中间丝网络的紊乱。DP的单次转染。COS7中的FLAG构建导致角蛋白网络的修饰和外源性DP沿细胞-细胞接触的点状定位。FLAG蛋白（m）。在DP中。FLAG和PKP3GFP共转染细胞，DP。沿电池触点的FLAG定位更加连续（n），且DP。FLAG和PKP3GFP在这些结构中共存（o）。棒材：20μm（a–c，m）和10μm（d–l，n–o）。

以前，在COS细胞的实验中，已经证明PKP1和PKP2都能够招募DP到细胞-细胞接触(Kowalczyk等人，1999年a;Chen等人，2002年). 在使用DP的类似实验中。FLAG和PKP3GFP编码质粒，我们也可以在细胞-细胞接触处观察到这种共定位。在单转染实验中，DP。FLAG主要出现在中间丝上，但也可以在细胞-细胞接触处的点状图案中检测到(图6m） ●●●●。在共转染实验中，DP。FLAG沿着细胞-细胞接触更连续地定位(图6n） 与PKP3GFP共定位(图6o） ●●●●。虽然这可能不是PKP3的主要功能（见讨论），但这三个PKP显然都可以招募DP到细胞间的联系人。

PKP3在酵母双杂交系统中与大多数桥粒钙粘蛋白相互作用

通过酵母双杂交分析研究了PKP3和桥粒钙粘蛋白之间的直接相互作用。使用的PKP3蛋白片段如所示图3。结果如所示图7并在中进行了总结表一全长PKP3与所有三个Dsg相互作用(图7a） ●●●●。使用删除结构，Dsg1结合位点局限于PKP3的头部结构域，而Dsg2和Dsg3的结合位点明显包含PKP3头部和手臂结构域的（部分）(表一). HR2结构域的缺失对PKP3与Dsgs的结合没有影响(表一). 此外，还观察到PKP3与Dsc1a、Dsc2a和Dsc3a的结合(图7a） ●●●●。全长PKP3与Dsc1b和Dsc2b的相互作用尚不清楚（菌落生长较慢，仅变成浅蓝色），而PKP3和Dsc3b的相互关系似乎弱于其与Dsc-a型的相互作用。然而，观察到的PKP3–Dsc3a相互作用并不完全令人信服，因为所有与Dsc3a共转化的PKP3-缺失结构都与桥粒钙粘蛋白相互作用，对此我们没有任何解释(表一). PKP3的臂和头结构域都是与Dscs相互作用所必需的，但HR2结构域的缺失并不影响与Dsc的相互作用(表一). 利用诱饵质粒pGADT7中Dsg1胞质结构域的缺失结构，我们发现了两个独立的PKP3相互作用位点。虽然细胞内锚定结构域（IA）和连环蛋白结合片段（CBS）结构域单独不与PKP3相互作用，但两者的结合确实起到了相互作用(图7b） ●●●●。另一方面，还观察到与Dsg1的Dsg结构域的相互作用，即由富含脯氨酸的连接子片段、重复单位结构域和末端结构域组成的桥粒糖蛋白特异结构域(Hatzfeld等人，2000年; 看见图11)这意味着Dsg1细胞质域中存在两个物理上可分离的PKP3相互作用位点(图7b） ●●●●。pGADT7中Dsg2的构建体也存在两个独立的相互作用位点，因为我们发现氨基酸结构域583–721和882–1069都与全长PKP3相互作用(图7b） ●●●●。作为对照，所有PKP3构建物均与多个构建物共转化，包括一个编码小鼠E-钙粘蛋白胞质尾部的构建物，而桥粒钙粘蛋白构建物与人类p120ctn亚型3AC共转化。这些共转化酵母克隆都没有生长在相互作用选择性培养基上，而E-cadherin与p120ctn相互作用(图7a；表一). 当PKP3诱饵质粒与空食饵载体共转化时，以及当空诱饵质粒和编码桥粒钙粘蛋白的食饵构建物共转化时也观察到酵母克隆生长缺失(表一).

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图7。

酵母双杂交结果使用PKP3及其片段作为诱饵。每个共转化显示两个菌落，包括阴性对照。SD-LWHA是指示蛋白质相互作用的培养基，因为它补充了Xα-gal，而SD-LW是指示诱饵和猎物质粒成功共转化的培养基。（a） 全长PKP3与Dsg1、Dsg2、Dsg 3、Dsc1a、Dsc2a和Dsc3a相互作用。与Dsc1b和Dsc2b的相互作用尚不清楚，而PKP3与Dsc3b的相互影响似乎不如与Dsc-a蛋白的相互作用强。桥粒钙粘蛋白和p120ctn之间未观察到相互作用。Pg也与PKP3相互作用，但不与原钙粘蛋白-β15（pcdβ15）相互作用。PKP3和E-cadherin（E-cad）之间未观察到相互作用，而E-cadherin和p120ctn明显相互作用。（b） 定义Dsg1（aa 519–1000）和Dsg2（aa 583–1069）细胞质域中的PKP3相互作用位点。非相互作用的Dsg1蛋白片段用虚线表示。单独的IA和CBS域与PKP3不交互，包含Dsg1的aa 593–789的构造也不交互（即CBS域加上Dsg域的一部分）。IA和CBS结构域一起与PKP3相互作用。Dsg域本身也足以与PKP3进行交互。因此，在Dsg1细胞质域中可以识别出两个独立的PKP3相互作用域。在Dsg2的情况下，同样可以检测到两个独立的PKP3相互作用位点，即aa 583–721和aa 882–1069。IA，细胞内锚；CBS，连环蛋白结合片段；桥粒糖蛋白特异性结构域；C、 羧基末端。（c） 全长PKP3和PKP3head（而非PKP3arm）与DPNTP和DPNTPmut相互作用。PKP3△HR2和PKP3head△HR2与DPNTP绑定，但与DPNTPmut不绑定。只有PKP3arm不与CK18交互。在酵母双杂交系统中，没有PKP3结构与E-cadherin相互作用。

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图11。

显示简单上皮和分层上皮选定分子组分之间相互作用的桥粒模型（修改于Nollet等人，2000年).（a） 描述了一些具有代表性的桥粒蛋白。CBS，catenin-binding片段；CK，细胞角蛋白；EC，外结构域模块；IA，细胞内锚定结构域；膜近端胞外区；N、 氨基末端结构域；PL，富含脯氨酸的连接物；PM，质膜；RUD，重复单位域；TD，终端域。在当前工作中，组合（PL-RUDs-TD）被指定为Dsg域(Hatzfeld等人，2000年). （b） 与Pg相比，PKP1、PKP2和PKP3在单纯上皮中的定位主要基于其他人的观察(Mertens等人，1996年;North等人，1999年;Schmidt等人，1999年). DP以两种剪接变异体形式出现，即DPI和较短的DPII，它们在上皮细胞中表达，但在心脏中不表达(Kowalczyk等人，1999b). 桥粒斑块分子之间相互作用的化学计量学尚不清楚。对于Pg–Dsg1相互作用，报告的比率>1:1(Bannon等人，2001年). 目前还不清楚哪些蛋白质和多少蛋白质可以同时与单个PKP蛋白结合。这里，我们已经表明，至少PKP3头部域包含两个DP相互作用位点。（c） PKP1在分层上皮中的位置和多分子相互作用是根据Kowalczyk等人（1999年a）根据免疫电子定位研究，DPI和DPII的羧基末端位于与细胞膜相同的距离处，此处未反映。在表皮中，PKP1、Dsc1和Dsg1富集于表层，而Dsg3、Dsc3和PKP2富集于基底层。PKP3表达于表皮的所有活细胞层(图2).

PKP3在酵母双杂交系统中与Pg、DP和CK18蛋白相互作用

在酵母双杂交系统中可以清楚地观察到armadillo蛋白PKP3和Pg之间的相互作用(图7a） ●●●●。像PKP1和PKP2(Kowalczyk等人，1999年a;Chen等人，2002年)，PKP3还与584 aa的DP头部结构域（结蛋白氨基末端片段，DPNTP；图7c） ●●●●。该DPNTP片段结合PKP3的头部域，删除该头部域（PKP3arm）将取消与DPNTP的相互作用。使用DPNTP的截短版本，仅编码DP头部结构域的63个氨基酸（突变的去氨普拉金氨基末端片段，DPNTPmut），我们发现PKP3的HR2结构域的缺失完全消除了与该DPNTPmut的结合，尽管与DPNTP的相互作用并非如此(图7c） ●●●●。当使用PKP3headΔHR2结构时，也进行了相同的观察。HR2结构域（P23A，R45A）的双错义突变导致与DPNTPmut的相互作用较弱，但没有完全抑制（未公布的数据）。这些结果表明，PKP3head域中至少有两个DP结合位点与DP头部域中的至少两个不同位点相互作用。最后，观察到与PKP3非正常头部结构域结合的上皮细胞CK18相互作用(图7c） ●●●●。

PKP3共免疫沉淀Dsg1至-3、Dsc3a和-b、DP和Pg

为了证实酵母双杂交系统中观察到的相互作用，在HEK293T成纤维细胞中共同转染相关表达质粒后进行了共免疫沉淀（CoIP）实验。这些细胞没有功能性桥粒，桥粒成分（如Dsg2、PKP3、DP和Pg）的内源性蛋白质水平很低或为零（未公布的数据）。我们注意到全长PKP3蛋白非特异性地粘附在蛋白G Sepharose珠上，因为更严格的洗涤并没有显著降低这种结合，所以CoIP实验只在一个方向上进行。使用单克隆抗体23E3/4免疫沉淀PKP3蛋白，而所有其他蛋白都是myc标记的。CoIP样品中有时检测到未完全降低的小鼠原代抗体(图8a、 星号）。全长PKP3蛋白沉淀桥粒钙粘蛋白Dsg1、Dsg2、Dsg 3、Dsc3b(图8a） 和Dsc3a(图8c） ●●●●。同时，仅用蛋白G Sepharose珠培养裂解产物，在这些样品中未观察到信号(图8、a和c）。使用Dsc3b缺失构建体（如图8d） ，PKP3相互作用位点局限于Dsc3b的膜近端结构域(图8c、 左）。总裂解物中蛋白质的对照检测如所示图8（b和c）。在一个类似的实验中，我们试图用全长PKP3对CoIP Dsc1a和Dsc2a进行研究。不幸的是，在适当共转染的HEK293T细胞的细胞裂解液中未观察到Dsc蛋白的可检测水平（未公布的数据）。最后，我们发现全长PKP3免疫沉淀桥粒斑块蛋白DP和Pg(图8a） ●●●●。同样，在反向控制车道上未观察到信号(图8a） ●●●●。因此，这些结果证实了我们使用酵母双杂交系统获得的数据。

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图8。

利用与感兴趣质粒共转染的HEK293T细胞裂解物进行CoIP实验。将编码全长PKP3（p1744）的质粒与编码Dsg1-myc、Dsg2-myc、Dsg3-myc、Dsc3a-myc、msc3b-myc、csc3bΔcyto1-myc，Dsc3b△cyto2-myc，DP-myc或Pg-myc融合蛋白的质粒共转染。（a） 使用抗PKP3单克隆抗体23E3/4，myc标记的Dsg1、Dsg2、Dsg 3、Dsc3b、DP和Pg蛋白（箭头）与PKP3（+通道）共免疫沉淀。Dsc3b双链蛋白的性质尚不清楚，但可能表示除成熟蛋白外，还存在未完全加工的蛋白质。在阴性对照区（在没有mAb 23E3/4的情况下用蛋白G Sepharose孵育的裂解物），未检测到信号（−区）。经常检测到不完全还原的一级抗体（星形）。每组+/-车道使用相同的暴露时间。（b） 总细胞裂解物的对照Western blot检测：左侧面板中的Dsg1（165 kD）、Dsg2（160 kD；右侧面板中的PKP3（87 kD）。显示摩尔重量标记（kD）。（c） 使用抗PKP3 mAb 23E3/4，myc标记的Dsc3b，Dsc3b和Dsc3a的两个COOH末端截短的衍生物与PKP3共免疫沉淀（左图中的+泳道）。在阴性对照区（在没有mAb 23E3/4的情况下用蛋白G Sepharose孵育的裂解物），未检测到信号（左面板中的−区）。使用抗Myc和抗PKP3抗体，通过Western blotting（右）检测每个融合蛋白的表达。（d） （C）的CoIP实验中使用的小鼠（Mm）Dsc3a、Dsc3b和Dsc3b截断突变体的细胞质域示意图。虚线表示异构体特异域。含有aa 578–696的片段由Dsc3a和Dsc3b共享。Dsc3bΔcyto1和Dsc3bΔcyto 2分别包含Dsc3a和-b的36和77个膜近端aa。

PKP3通常在单层和多层上皮中表达，与桥粒钙粘蛋白、PKP1和PKP2的限制性表达模式重叠

利用新型小鼠单克隆抗体，我们研究了PKP3在体内外的蛋白质合成模式。在使用上皮细胞系的免疫荧光检测中，在桥粒中清楚地检测到PKP3。然而，与早期用兔多克隆抗PKP3抗体记录的观察结果相比，在这些细胞系中未检测到核PKP3，尽管事实上针对与pAb相同的肽产生了单克隆抗体12B11F8(波恩等人，1999年). 在合成外源全长PKP3的细胞中也未检测到核PKP3。总之，这些数据表明，先前报道的核PKP3定位可能是异常的，甚至是人为的。

利用单克隆抗体23E3/4，在人类表皮所有活细胞层的桥粒中观察到PKP3的合成，而在角质层和真皮中未发现PKP3。此外，在单纯结肠上皮中也检测到PKP3。这些结果证实并加强了以前在各种上皮细胞和上皮细胞系中PKP3的表达数据(波恩等人，1999年;Schmidt等人，1999年). 虽然桥粒钙粘蛋白、PKP1和PKP2的表达模式反映了细胞类型和分化状态的功能紧密调控(King等人，1993年,1997;Heid等人，1994年;Mertens等人，1996年;North等人，1996年)与Pg和DP的情况一样，PKP3的表达模式似乎表明PKP3在上皮和表皮桥粒中的基本作用，但肝桥粒除外(Schmidt等人，1999年). 肝细胞中缺乏PKP3表达的功能后果目前尚不清楚，但考虑到PKP3的多种相互作用伙伴，肝脏中的细胞粘附结构与我们在下面讨论部分中提出的模型有很大不同是可行的（参见图11).

PKP3蛋白片段的细胞内定位

为了研究PKP3及其片段的功能和细胞内定位，用合适的表达质粒转染各种上皮细胞系。在桥粒细胞-细胞粘附复合物中可以清楚地观察到全长PKP3。相反，GFP标记的PKP3arm片段在细胞核中积累到较高水平。目前尚不清楚PKP3臂片段的哪些序列指导其核定位，以及这在全长蛋白中是如何抵消的。早先有报道称β-catenin的臂结构域足以指导其核定位和功能(Funayama等人，1995年;Fagotto等人，1998年). 另一方面，PKP3head结构域中可能存在尚未确定的核输出信号，因为该片段主要定位于细胞质中（聚集在细胞质中），在细胞核中没有任何定位，也没有沿着细胞-细胞接触的显著定位。用PKP3头和PKP3臂片段获得的这些结果与早期关于PKP1和PKP2的头和臂片段的细胞内定位的报道形成了明显对比，其中头结构域优先定位在桥粒和细胞核中，而相应的臂结构域分布在细胞质中(Klymkowsky，1999年;Kowalczyk等人，1999年a;Hatzfeld等人，2000年;Chen等人，2002年).

外源性PKP3head片段的聚集物显示包含桥粒相关分子，如DP和CK18，有时还包含内源性PKP3，但不包含PKP2或Dsg2。在这些聚集体中发现的内源性PKP3不太可能在桥粒中被DP-binding PKP3head结构域取代。事实上，桥粒中只检测到很少的PKP3头，而PKP3仍然可以很容易地在这些连接处检测到。假设，内源性PKP3可能是通过与PKP3头结合DP的相互作用而在这些聚集物中被强迫的。虽然在酵母双杂交实验中，在PKP3headΔHR2蛋白中观察到第二个DP相互作用位点，但在PKP3headΔHR2聚集体中仅发现CK18（而非DP）定位。这可能反映了桥粒中存在更严格的DP相互作用伙伴，也表明HR2结构域参与PKP3与DP的强结合。另一方面，我们可以证明，在COS细胞的DP和PKP3共转染中，PKP3能够将DP招募到细胞接触部位。COS细胞只含有少量非常小的桥粒。然而，在含有许多较大桥粒的细胞类型中，PKP3的功能似乎不太突出。

我们转染研究中的观察结果强调了PKP3与PKP1和PKP2的不同行为。与PKP1和PKP2相比，未检测到核PKP3(Mertens等人，1996年;Schmidt等人，1997年). PKP3头和臂片段的亚细胞分布与相应的PKP1和PKP2结构域的亚细胞分配有很大不同(Kowalczyk等人，1999年a;Chen等人，2002年). 与PKP1head和PKP2head不同，PKP3head在桥粒中不与DP共定位，尽管PKP3在COS细胞中招募DP与细胞接触。因此，PKP3的头和臂结构域对于真正的桥粒锚定来说都是必要的。根据酵母双杂交数据，与桥粒钙粘蛋白和/或Pg的相互作用对PKP3头和臂的结构域都是必需的(表一)，对于上皮细胞中PKP3的桥粒定位显然是必需的。

免疫检测分析

蛋白质通过ECL检测（Amersham Biosciences）或NBT/BCIP检测（Sigma-Aldrich）在Western blot实验中检测。用于免疫印迹的抗体稀释度为1:5000（23E3/4）和1:100（12B11F8）。

免疫荧光分析基本上如前所述进行(波恩等人，1999年). 在与初级抗体孵育之前，用0.2%Triton X-100处理甲醛固定细胞15分钟。23E3/4抗体稀释度为1:300。使用相机（MicroMAX；RS Photometrics）捕捉荧光图像结果，并使用MetaMorph进行处理^®软件（Universal Imaging Corp.）。或者，使用标准相机拍摄图像。

PKP3的免疫组织化学检测基本上如所述Mertens等人（1999）在这些实验中，根据制造商的说明（DakoCytomation）使用DAKO LSAB2系统HRP（即用型AEC）。23E3/4抗体稀释度范围为1:100至1:500。使用CoolSNAP相机和专用软件（RS Photometrics）拍摄图像。

细胞系和转染

回盲部腺癌细胞系HCT8/E8是通过亚克隆HCT8细胞获得的(Vermeulen等人，1995年). MCF7/AZ来源于MCF-7人乳腺癌细胞系(Brake等人，1991年)HaCaT是人角质形成细胞系(Boukamp等人，1988年). 用FuGENE™6（Roche）瞬时转染MCF7/AZ细胞；用LipofectAMINE™PLUS（生命技术）瞬时转染HCT8/E8细胞。转染细胞在26–30小时后固定。HEK293T细胞(西蒙斯，1990年)、COS1和COS7细胞(Gluzman，1981年)和PtK2电池(巴赛霍尔和伯尔尼，1973年)用磷酸钙法转染，48h后固定。

真核表达质粒

所有人类PKP3构建物都是通过PCR使用Pfu公司DNA聚合酶（Stratagene）和含有适当附加限制位点的引物，在引物序列中强调。引物中的沉默突变以粗体显示。所有构造(图3)完全测序以确保在PCR过程中没有发生突变。用正向引物5′-atac扩增全长人PKP3gctagc公司ccagcccggtgacct-3′（P1）和反向引物5′-atac砷化镓 一gg（希腊）一cccaggagatcctcct-3′（P2），以pGEM11中克隆的全长人PKP3 cDNA为模板DNA(波恩等人，1999年). 将得到的PCR产物NheI/EcoRI切割并克隆到pEF6/Myc-His B（Invitrogen）的SpeI/EcoRI位点中，与载体的Myc和His标签失框，得到质粒p1744。PCR产物也克隆到pEGFP-N2载体（CLONTECH Laboratories，Inc.）的NheI/EcoRI位点，产生p1910，用GFP标签编码全长人类PKP3。

PKP3head和PKP3arm表达构建如下：以pGEM11中克隆的全长人PKP3 cDNA为模板DNA进行PCR。使用正向引物P1和反向引物5′-ataa扩增PKP3head片段砷化镓全球技术指南一cccgagtcagc-3′；带有正向引物5′-ataa的PKP3arm片段gctagc公司gccatg公司吨tgccggacgtgcatggg-3′和反向引物P2。PCR产物为NheI/EcoRI-cut，并克隆到pEGFP-N2的NheI/EcoRI位点。

PKP3ΔHR2的获得如下：开发了两组引物，它们不跨越PKP3的HR2编码cDNA部分，并且在PKP3 cDNA中引入了沉默的BssHII位点。PCR产物，用引物集1（正向引物P1和反向引物5′-aata）扩增克c（c）气相色谱法克一cacacgccgctccagg-3′）和引物集2（正向引物5′-aata气相色谱法克c（c）克一ctcttgcagctg-3′和反向引物P2）分别为NheI/BssHII-和BssHII/EcoRI-cut，并同时克隆到pEF6Myc-HisA（Invitrogen）的SpeI/NheI位点，获得p1912。测序后，用全长PKP3引物再次扩增该插入物，在pEGFP-N2中克隆，得到p1911。用用于PKP3head结构域扩增的引物集扩增PKP3head-ΔHR2片段，并相应克隆。

老鼠Dsc3a和Dsc3b构造是D.Garrod博士和C.Byrne博士（英国曼彻斯特大学）赠送的礼物。表达结构（对应的细胞质域如图8d） 在pEF6Myc-HisB（Invitrogen）中通过用Dsc3a引物集1扩增cDNA插入物（序列为5′-aata的正向引物P5ggtacc公司gctgcacttgcgatgtgg-3′，反向引物5′-aata阿克塔格特gcgcttagtgcaggttttg-3′）和Dsc3b的引物组2（正向引物P5，反向引物5′-aata阿克塔格特accagtgtcctctatatg-3′）。使用引物集3（正向引物P5，反向引物5′-aata）扩增Dsc3bΔcyto1和Dsc3bΔcyto 2插入物阿克塔格特agaacacactctgtcatccc）和4（正向引物P5，反向引物5′-aata阿克塔格特caaggttggtgtcctttca）。PCR产物被KpnI/SpeI-切割并克隆到pEF6Myc-HisB载体的KpnI/SpeI位点。

编码全长myc标记人类Dsg1、Dsg2、Dsc1a和Dsc2a的表达结构如前所述(Kowalczyk等人，1994年;石井等人，2001年); 人类Dsg3构造是J.Stanley博士（宾夕法尼亚大学，费城，PA）赠送的礼物。FLAG-标记的DP和Myc-标记的Pg表达结构如前所述(Kowalczyk等人，1997年;Bornslaeger等人，2001年).

酵母双杂交质粒

所有PKP3构建物都是通过PCR使用Pfu公司DNA聚合酶（Stratagene）和含有适当附加限制位点的引物，在引物序列中强调。引物中的沉默突变以粗体显示。所有构造(图3)完全测序以确保在PCR过程中没有发生突变。使用以下引物构建pGBKT7hPKP3、pGBKT3hPKP3arm和pGBKT_7hPKP2head：正向引物5′-atac砷化镓caggacggtaacttcctg-3′（P3）和反向引物5′-atacgtcgac公司acagccacccct-3′（P4；全长PKP3）；正向引物5′-atac砷化镓 吨tgccggacgtgcatgggtt-3′和反向引物P4（PKP3arm）；正向引物P3和反向引物5′-atacgtcgac公司全球技术指南一cccgagtcagc-3′（PKP3head）。扩增的片段被EcoRI/SalI-切割并克隆到pGBKT7（CLONTECH Laboratories，Inc.）的EcoRI/SalI位点。模板DNA是在pGEM11中克隆的全长人PKP3 cDNA。pGBKT7hPKP3ΔHR2构建如下：以质粒p1912的DNA为模板，用正向引物P3和反向引物5′-atac进行PCR砷化镓 一gg（希腊）一cccaggaagtctct-3′。PCR产物为EcoRI-cut，克隆到pGBKT7的EcoRI位点，获得pGBKT_7hPKP3ΔHR2。为了获得pGBKT7hPKP3headΔHR2，用正向引物P3和反向引物5′-atac扩增p1912的插入片段gtcgac公司全球技术指南一cccgagtcaggcaggc-3′，将得到的PCR产物切割并克隆到pGBKT7的EcoRI/SalI位点中。pGAD424中的Dsg和Dsc结构以前有报道(Hatzfeld等人，2000年). 质粒为EcoRI/SalI-cut，插入物克隆在pGADT7的EcoRI/XhoI位点，pGAD424Dsc2b除外。pGAD424Dsc2b插入物是EcoRI/MamI-切割的，并克隆到pGADT7的EcoRI/SmaI位点。包含Dsg1的Dsg、CBS、IA和CBS+Dsg域的pGAD424构造已在前面描述过(Hatzfeld等人，2000年). 这些质粒被EcoRI/SalI-切割并克隆到pGADT7的EcoRI/SalI位点。来自pGADT7Dsg1的DNA被Tth111I-切割，钝化以产生移码和自编码，从而产生pGADT7 Dsgl（519–789）。或者，DNA是AvrII-cut，钝化以产生移码和自编码，这导致pGADT7Dsg1（IA+CBS）编码Dsg1aa 519–715。或者，对来自pGADT7Dsg1的DNA进行BglII切割和连接，然后用Tth111I消化、钝化和连接以生成pGADT7-Dsgl（aa 595-789）。对质粒进行测序，以确保预期的帧内结扎或帧移位正确发生。pGADT7mEcad含有小鼠E-cadherin的细胞质尾部，pGADT7 hp1203AC和pGBKT7 hp1203C含有人类p120ctn亚型3AC。使用正向引物5′-agc通过PCR扩增原钙粘蛋白-β15的细胞质结构域砷化镓ctgtgcaggaggagcagg-3′和反向引物5′-atagtcgac公司tacagataccatattctag-3′。扩增的片段是EcoRI/SalI-cut，并克隆到pGBKT7（CLONTECH Laboratories，Inc.）的EcoRI/SalI位点。pACTIIDPNTP如前所述(Kowalczyk等人，1997年). 在pACTIIDPNTPmut中，1-bp的删除会导致DPNTP编码序列中的帧移位，从而只翻译DP的前63个aa。

酵母双杂交分析

使用酵母菌株AH109（CLONTECH Laboratories，Inc.）进行酵母双杂交相互作用分析。将共转化的酵母菌落印在缺乏亮氨酸和色氨酸的合成脱落培养基（SD）上进行生长控制，将缺乏亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤的SD印在相互作用测试中。缺乏亮氨酸、色氨酸、组氨酸和腺嘌呤的SD补充X-αgal，导致诱饵和猎物融合蛋白相互作用时蓝色酵母菌落生长。

我们感谢A.Haegeman纯化抗体，感谢J.Comijn和J.van Hengel的有益讨论，感谢W.Drijvers、E.Vanden Eynde和C.Eichperger的技术援助。我们感谢J.Stanley博士的人类Dsg3表达构建体，以及D.Garrod和C.Byrne博士的小鼠Dsc3a和Dsc3b cDNA构建体

波恩大学得到了位于弗拉安德伦（IWT）的创新之门Wetenschap en Technologie研究所（Instituut voor de Aanmoediging van Innovatie door Wetenschap-en Technologie）的支持。F.van Roy得到根特大学Geconcerteerde Onderzoeksacties、科学研究基金会、Fortis Verzekeringen（比利时）和Interuniversitaire attractiepolen（比利时）的支持。M.Hatzfeld得到了德国足球协会的支持，X.Chen得到了R.H.Lurie棒球慈善癌症研究金的支持，K.J.Green获得了NIH的AR43380、AR41836和PO1 DE12328项目4的资助。