纤维连接蛋白EDA外显子的调控剪接对皮肤伤口的正确愈合和正常寿命至关重要

EDA外显子缺乏选择性剪接的小鼠菌株发育正常且可育

为了在EDA外显子中产生缺乏选择性剪接的FN等位基因，将FN基因中的野生型EDA外显子替换为具有图S1中所述的5′和3′优化剪接位点的“浮动”EDA外显子网址：www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200212079/DC1). 用靶向结构电穿孔129 Sv/J ES细胞后(图1A） 筛选G418抗性克隆，并进行Southern杂交分析。通过瞬时表达CRE重组酶进行第二步重组，以从EDA侧翼内含子中消除Neo-TK盒。PCR-扩增基因组EDA区域的Southern blot分析和测序证实了在一个FN等位基因中引入了优化的3′和5′剪接位点以及EDA外显子侧翼的loxP位点。此后，这个等位基因将被称为EDA⁺等位基因。杂合EDA^+/重量用ES细胞获得传递EDA的雄性嵌合体⁺生殖系的等位基因。杂合EDA^+/重量小鼠与CMV-CRE转基因小鼠交配以获得EDA-null等位基因（以下简称EDA⁻等位基因）。通过杂交杂合小鼠获得纯合小鼠，并通过Southern blot分析进行筛选(图1B） 或通过尾部DNA活检的PCR（未描述）。

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图1。

FN基因EDA外显子缺乏调控剪接的小鼠菌株的生成策略。（A） 野生型FN等位基因、靶向载体、靶向等位基因，EDA-floxed等位基因和EDA-null等位基因的部分图谱。外显子、Neo-TK和DTA分别显示为灰色、白色和虚线框。EDA外显子和“loxP”位点分别用黑色正方形和白色三角形表示。N和H分别表示NcoI和HindIII位点。用CRE重组酶表达质粒和EDA瞬时转染重组ES细胞^+/重量用杂合细胞进行囊胚显微注射。EDA公司^+/重量小鼠与表达CRE的转基因小鼠株交配以获得EDA^−/重量老鼠。星号表示NdeI站点。4.0-kb、2.7-kb和2.0-kb的DNA片段（EDA^重量、EDA⁺和EDA⁻用HindIII消化后获得的等位基因，以及用内部探针进行的Southern blot杂交。（B） 不同小鼠基因型的Southern blot筛选。EDA公司^重量、EDA⁺、和EDA⁻显示了条带。（C） EDA总RNA的RT-PCR分析^{重量/重量}、EDA^+/+和EDA^−/−从肝脏、大脑和肾脏显示。EDA公司⁺和EDA⁻显示了条带（分别为805bp和535bp）。

纯合EDA^+/+和EDA^−/−出生后的小鼠与野生型或杂合子同窝小鼠相比没有明显的发育异常；他们成年了，可以生育。此外，在纯合EDA的器官中未检测到差异^+/+和EDA^−/−通过大体组织学和病理学分析对小鼠进行研究（未发表数据）。突变的等位基因以预期的孟德尔频率分离，新生小鼠的产仔数和存活率（在断奶前测量）与EDA相似^{重量/重量}动物。无论是在胚胎的形状上，还是在定时交配产生的胚胎体节的数量上，都没有观察到任何差异。详细数据显示在在线补充材料部分。

EDA公司^+/+小鼠缺乏EDA外显子的选择性剪接

FN mRNA中包含EDA外显子受到严格的组织特异性调控。最引人注目的例子是肝脏，其中pFN被合成，EDA外显子在成人的mRNA中被完全排除(Tamkun和Hynes，1983年;Kornblihtt等人，1984年).

放射性RT-PCR用于分析所有三种基因型的大部分组织和器官（EDA^{重量/重量}、EDA^+/+和EDA^−/−). 肝、脑和肾等代表性组织中EDA剪接模式的示例如所示图1C.这些结果通过相同样品的核糖核酸酶保护分析得到证实（图S2可在网址：www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200212079/DC1). 我们发现EDA⁺EDA样本中从未出现过形式^−/−老鼠和EDA⁺EDA产品^+/+所有组织中都有小鼠。对FN mRNAs的RNase保护和RT-PCR分析表明，EDA的所有组织中都含有99–100%的EDA外显子^+/+小鼠，而属于EDA的所有组织都有100%的EDA外显子排除^−/−老鼠。这证实了基因改造的基本原理在实际体内情况下得到了成功实现。

小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）中EDA外显子缺乏调控剪接的正常FN-ECM形成

接下来，我们检测了由EDA制备的MEF中FN mRNA、蛋白质亚型和ECM形成的表达^{重量/重量}、EDA^+/+和EDA^−/−动物。RT-PCR分析证实了EDA外显子在EDA中的组成性嵌合^+/+以及它在EDA中的缺失^−/−MEF公司(图2A） ●●●●。用多克隆抗FN抗体和单克隆抗EDA抗体对蛋白质提取物进行Western blot分析，结果显示两种EDA的蛋白质水平均正常^+/+和EDA^−/−MEF公司(图2B） ●●●●。抗EDA抗体检测到EDA⁺仅EDA中的FN亚型^+/+和EDA^{重量/重量}MEF公司(图2C） ●●●●。

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图2。

EDA的调节拼接对于ECM的形成是必不可少的。（A） EDA制备MEF总RNA的RT-PCR分析^{重量/重量}、EDA^+/+和EDA^−/−胚胎（受精后13.5天）。（B和C）分别用抗FN和抗EDA抗体对上述MEF（B和C分别为20和100μg）制备的蛋白质提取物进行Western blot分析。考马斯蓝染色显示等负荷。（D） EDA编制的MEF^{重量/重量}、EDA^+/+、和EDA^−/−胚胎（13.5d p.c.）被电镀、固定，并与抗EDA抗体（左柱）或抗总FN抗体（中柱）孵育。合并后的图像显示在右列中。

共焦显微镜免疫荧光分析显示EDA中存在正常的FN-ECM^+/+和EDA^−/−MEF与EDA比较^{重量/重量}MEF公司(图2D） ●●●●。用抗EDA抗体获得的信号与用抗FN抗体观察到的信号共定位。

EDA外显子调控剪接的消融导致EDA中FN水平下降^+/+与FN mRNA和整合素水平的变化无关的小鼠

接下来，我们研究了FN天然选择性剪接模式的改变是否对其他细胞蛋白或FN本身产生了一些影响。因此，从3月龄小鼠不同基因型的不同组织中提取蛋白质，并用SDS-PAGE进行分析。至少在5–17%梯度凝胶考马斯蓝染色的敏感性水平上没有观察到明显差异（未公布的数据）。另一方面，使用抗FN多克隆抗体进行的Western blot分析显示，EDA分析的大多数组织中FN水平显著降低^+/+老鼠(图3A） ●●●●。EDA中的这种下降也很明显^+/重量和EDA^+/−小鼠，均携带一种EDA⁺等位基因。考马斯蓝染色和同一膜与抗β-微管蛋白单克隆抗体孵育证明，观察到的差异并不是由于凝胶的蛋白质负荷不同所致(图3B） ●●●●。从EDA制备的血浆和血清样本中也观察到FN含量显著下降^+/+与EDA中的动物进行比较^{重量/重量}老鼠(图3C） ●●●●。使用抗EDA抗体的Western blot证实EDA中存在含EDA的FN^+/+血浆及其在EDA中的完全缺失^−/−样品(图3C） ●●●●。

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图3。

EDA组织中FN水平的降低 ^+/+ 小鼠与整合素水平的降低无关。（A和B）所有基因型（EDA）大脑、心脏、肺和肝脏总蛋白提取物（50μg）的Western blot分析^{重量/重量}、EDA^+/+、EDA^−/−、EDA^+/−、EDA^−/重量和EDA^+/重量)使用抗FN多克隆抗体（A）和剥离膜后的抗β-微管蛋白单克隆抗体来验证蛋白质载量的微小误差（B）。请注意，EDA的迁移⁺FN比EDA稍慢⁻FN公司。相同蛋白提取物的5-17%梯度凝胶考马斯兰染色未显示其他蛋白的变化。（C） EDA血浆和血清蛋白样本^+/+、EDA^−/−和EDA^{重量/重量}对小鼠（20μg）进行考马斯蓝染色（左），用类似凝胶进行印迹，并与抗FN抗体孵育（中）。对于抗EDA抗体（右），加载100μg蛋白质提取物。α的（D和E）Western blot分析₉-和β₁-抗α抗体在不同组织（肝、脑和皮肤）中的整合素水平₉和-β₁兔多克隆抗体。使用抗β-微管蛋白单克隆抗体验证蛋白质负荷的微小误差。

分析在不同组织中观察到的FN水平差异是否与特定EDA受体α水平的变化有关是很重要的₉β₁-整合素(廖等，2002). 我们在α₉-和β₁-EDA中的整合素水平^{重量/重量}、EDA^+/+和EDA^−/−小鼠肝脏和大脑的Western blot分析(图3D） ●●●●。然而，在突变小鼠中，整合素受体的定位模式或其信号传导是否受到影响仍有待观察。

另一方面，确定EDA中观察到的FN蛋白水平是否下降^+/+小鼠与mRNA水平下降相关，我们对从3月龄雄性小鼠FN水平下降较高的组织（大脑和心脏）中分离的总RNA进行了Northern blot分析。在EDA脑和心脏的RNA样本中未观察到显著变化^+/+鼠标（图S3位于http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200212079/DC1).

胚胎和青春期前EDA^+/+小鼠FN水平正常

为了确定FN减少的机制是否受到发育调控，我们对不同年龄段小鼠的样品进行了Western blot分析。FN水平在胚胎发育期间没有下降。大多数组织在出生后开始出现，在2个月大的小鼠中达到稳定状态(图4). 在某些组织中，EDA中的FN水平^+/+小鼠为EDA中发现量的约10–20%^{重量/重量}小鼠（心脏、血液、大脑、肾脏和膈肌），而肝脏EDA中FN水平下降较小^+/+小鼠，达到EDA中含量的60-70%^{重量/重量}老鼠。

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图4。

FN在不同年龄段不同组织中的表达。（A） 从EDA中制备肝、心、肺和脑的蛋白质提取物^{重量/重量}、EDA^+/+和EDA^−/−不同年龄的小鼠（13.5 d p.c.、1、3和14个月龄），并使用抗FN抗体进行Western blot分析。（B） 直方图表示EDA中FN的相对含量^+/+小鼠相对于EDA中的小鼠^{重量/重量}每个组织和每个时间点的小鼠（视为100%）。

为了确定FN降解机制的改变，我们进行了明胶酶谱，并在血浆和其他组织（大脑和心脏）中观察到基质金属蛋白酶（MMPs）水平的变化，MMPs是已知降解FN的酶(Sternlicht和Werb，2001年). 此外，与组织提取物孵育的FN体外翻译重组片段（含或不含EDA外显子）的降解没有差异（未公布的数据）。使用多克隆抗FN抗体对组织提取物进行Western blot分析，未发现EDA存在额外的条带或任何较小的降解产物^+/+组织，不含6%或12%的SDS-PAGE凝胶（未公布数据）。此外，我们无法在体外重现培养成年小鼠（来自2、4和6月龄动物的心脏成纤维细胞）的FN水平的降低，因为EDA的细胞提取物^+/+小鼠显示出与EDA相似的FN水平^{重量/重量}成纤维细胞（未发表数据）。

这些实验表明EDA中FN蛋白水平的显著降低^+/+小鼠出生后出现。FN的减少与每个组织中的mRNA水平或可检测的EDA无关⁺-依赖性降解，表明替代机制应负责EDA中组织FN的减少^+/+动物。

EDA-null小鼠皮肤伤口愈合异常

野生型动物皮肤中的FN不含EDA外显子。然而，FN-EDA⁺form被认为积极参与再上皮化过程(Clark等人，1983年;ffrench-Constant等人，1989年). 为了探讨EDA外显子在伤口愈合过程中的作用，我们在EDA中进行了全层皮肤切除伤^{重量/重量}、EDA^−/−和EDA^+/+老鼠。在伤后1、3、5、7、10和14天分析伤口愈合过程。在再上皮化早期（第1天和第3天），全层伤口组织的苏木精-伊红染色显示再上皮化和新生血管化没有任何差异（未公布的数据）。在晚期（第5天和第7天），EDA之间的肉芽组织的再上皮化和形成无法区分^+/+和EDA^{重量/重量}老鼠(图5和​和66)然而，在EDA中观察到异常愈合过程^−/−老鼠。事实上，在第5天，新形成的表皮完全覆盖了EDA中的伤口区域^−/−但新表皮和肉芽组织之间的边界没有像对照组或EDA中那样清晰界定^+/+老鼠。此外，EDA的肉芽组织^−/−伤口显示，表皮和皮肤肉芽肿反应界面下的致密细胞较少，有水肿样区域(图5，底部）。

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图5。

全层皮肤损伤后5天观察到再上皮化。对照组全层皮肤伤口（EDA^{重量/重量},n个=6）和突变小鼠（EDA^+/+和EDA^−/−,n个分别为6和7）小鼠在受伤后第5天进行苏木精-伊红染色分析。显示了具有代表性的部分。黑色箭头表示伤口边缘。显示上皮、肉芽组织、真皮、新形成的上皮和焦痂（分别为“e”、“g”、“d”、“re”和“sc”）。顶部面板中的虚线矩形表示底部面板中显示的放大区域。实验重复了两次，结果相似。EDA中观察到水肿肉芽组织^−/−伤口。

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图6。

EDA公司 ^{− / −} 伤后第7天皮肤伤口愈合异常，BrdU阳性细胞增多。（A） 对照组全层皮肤伤口（EDA^{重量/重量},n个=8）和突变小鼠（EDA^+/+和EDA^−/−,n个分别为8和9）小鼠在受伤后第7天进行分析。显示了具有代表性的部分。黑色箭头表示伤口边缘。缩写如所述图5EDA中观察到的溃疡上皮^−/−伤口标记为“ue”。实验重复三次，结果相似。在受伤后第7天，对三个独立实验（每个实验中每个基因型八只小鼠）的伤口切片进行显微镜评分，以确定是否存在溃疡过程。EDA溃疡创面的比例^−/−小鼠与EDA小鼠的差异具有统计学意义^{重量/重量}和EDA^+/+小鼠（EDA为63%和22%^−/−和EDA^{重量/重量}分别为；EDA的P<0.0002^−/−与EDA对比^{重量/重量}Fisher精确检验和χ²测试）。EDA之间没有差异^{重量/重量}和EDA^+/+分数）。（B） BrdU标记显示EDA中复制细胞数量增加^−/−伤口。用抗BrdU单克隆抗体孵育A中相同伤口的连续切片。几个显微镜视野的计数显示，EDA中新形成的表皮下区域有至少10倍多的BrdU阳性核^−/−与EDA相比，伤口^{重量/重量}或EDA^+/+伤口。显示了一个具有代表性的字段。在EDA中观察到50多个阳性细胞核^−/−伤口（右下角），而在EDA病例中观察到少于五个阳性细胞核^{重量/重量}或EDA^+/+样本（分别位于左下角和中间）。BrdU标记的细胞核用白色三角形表示。黑色箭头表示伤口边缘。

第7天，EDA^−/−伤口与EDA的伤口明显不同^{重量/重量}和EDA^+/+老鼠(图6A、 底部）。事实上，EDA^−/−伤口在新形成的表皮区域出现溃疡，导致再上皮化延迟。通过对水肿样和溃疡性区域的显微镜分析，检测到炎症细胞（如多形核白细胞和巨噬细胞）的浸润，并且通过体内BrdU标记，在这些区域观察到较高的细胞增殖活性(图6B、 右下角）。相反，EDA和^{重量/重量}也不是EDA^+/+伤口在新形成的表皮区域下方区域出现大量BrdU阳性细胞(图6B、 左下方和中间）。EDA中基底层的状态^−/−皮肤与EDA相似^{重量/重量}如使用兔多克隆抗层粘连蛋白抗体对同一切片中的层粘连蛋白质进行Azan-Mallory染色和特异染色所示。分别通过创伤切片的TUNEL和caspase-3分析进行细胞死亡和凋亡特异性分析，结果表明不同基因型之间的阳性细胞数量没有显著差异（图S4可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200212079/DC1). 对三个独立实验（每个实验中每个基因型8只3个月大的小鼠）的皮肤愈合过程进行评分，以确定伤口是否存在溃疡，结果表明EDA^−/−小鼠的发育频率是EDA的2.9倍^{重量/重量}小鼠（EDA的63%^−/−EDA的22%^{重量/重量}经Fisher精确检验和χ检验，P<0.0002²试验）伤后第7天。

数量有限的11个月大的小鼠（5只EDA^{重量/重量}和六个EDA^−/−接受相同伤口愈合方案的小鼠在EDA中显示出更高的伤口溃疡发生率^−/−小鼠（83.3%对20%，EDA^−/−和EDA^{重量/重量}；分别是。通过Fisher精确检验和χ检验，P≤0.01²测试）。

确定整合素α₉β₁我们对未经处理的皮肤样本进行了Western blot分析，并观察到类似的整合素α水平₉β₁在所有三种基因型中(图3E） ●●●●。

EDA公司^+/+小鼠所有组织中FN水平降低

成人EDA中FN水平下降的观察^+/+小鼠，但胚胎和非常年轻的小鼠（<1个月龄）表明，FN水平的不同控制机制在青春期前后起作用。这种下降可能是由于以下解释之一或两者的组合：（1）FN mRNA水平下降；（2） FN分泌率下降；或（3）FN的细胞外降解增加。

已经进行了一系列实验，以测试哪些机制（如果有）在EDA中起作用^+/+老鼠。Northern印迹实验表明，mRNA水平与FN蛋白水平没有直接关系(图3和​和44和图S3）。蛋白酶水平与EDA相似^{重量/重量}，EDA中未发现其他FN降解产物^+/+组织提取物，我们无法看到来自EDA成人器官的体外培养细胞中FN水平的降低^+/+老鼠。未能确定低FN-EDA的确切原因⁺水平表明一种非典型机制可能正在起作用。一种可能性是，一种特定的细胞内运输机制能够调节EDA的水平⁺FN在成年动物中形成。这一机制被认为是气道上皮细胞中FN形式的极化分泌(Wang等人，1991年). 值得注意的是Schwarzbauer等人（1989）已表明IIICS-0/IIICS-0二聚体未分泌。EDA也可能存在类似的分泌机制控制⁺亚单位。

然而，在胚胎和成年动物培养的成纤维细胞以及小鼠发育的早期阶段，这些作用都不明显。事实上，FN数量的减少只有在2-3个月大的时候才明显，这是在性发育之后。或者，在成年动物中下调MMPs的特定组织抑制剂将导致特定MMPs活性增加，这是直接明胶酶谱分析无法检测到的细微变化。

EDA皮肤伤口愈合异常^−/−老鼠

最初，在受伤后3天，三种基因型（EDA）之间的愈合过程没有差异^{重量/重量}、EDA^−/−和EDA^+/+). 这似乎与受伤后第一天沉积的FN主要来自血浆的事实一致(Clark等人，1983年;ffrench-Constant等人，1989年). 结果表明，cFN的存在有助于伤口的正常愈合(ffrench-Constant等人，1989年;Sakai等人，2001年). 事实上，在缺乏pFN的小鼠中，伤口愈合正常(Sakai等人，2001年). cFN在创伤后3d原位生成(Clark等人，1983年;ffrench-Constant等人，1989年;Sakai等人，2001年)pFN-null小鼠损伤后立即在伤口表面沉积一薄层cFN(Sakai等人，2001年). 观察到表皮下伤口底部和边缘的细胞表达cFN，并且cFN的存在先于最终覆盖伤口的上皮细胞的迁移(ffrench-Constant等人，1989年). 先前的研究也表明，FN出现在迁移表皮下的临时基质中，与迁移表皮细胞上FN受体的表达相协调(克拉克等人，1982年,1983;格林奈尔，1984年). 这些数据与我们的结果完全相关，表明在这段时间后，尽管肉芽组织和新生血管形成，我们观察到EDA中异常的上皮化^−/−老鼠。EDA的肉芽组织^−/−伤口显示出溃疡形成之前出现的水肿区域。随后的表皮溃疡伴随着增殖刺激，多形核白细胞和巨噬细胞涌入，伤口愈合延迟。这些现象的可能原因可能与基底层的缺陷、整合素受体水平的变化和/或皮肤角质形成细胞、成纤维细胞或免疫系统的缺陷有关。EDA中基底层看起来相似^−/−小鼠与EDA的比较^{重量/重量}小鼠通过Azan-Mallory染色和层粘连蛋白的特异性免疫染色。然而，我们不能排除基底层中存在的另一种特殊蛋白质的微小差异。此外，α水平相似₉β₁整合素，EDA受体之一(廖等，2002)在三种基因型的皮肤中观察到。初步尝试定义EDA之间的差异^{重量/重量}和EDA^−/−免疫系统细胞的基因型（T/B淋巴细胞比率和迟发型超敏反应）和成纤维细胞的特征（体外细胞迁移、细胞粘附和复制时间）没有显示出显著差异。然而，在突变小鼠中，整合素受体的定位模式或其信号传导是否受到影响仍有待观察。

EDA中溃疡的增加^−/−伤口可能是伤口闭合期间小鼠皮肤细胞死亡率较高的结果。EDA之间阳性细胞的数量似乎并非如此^{重量/重量}、EDA^−/−和EDA^+/+TUNEL和caspase-3分析显示，无溃疡区域肉芽组织中的伤口相似。

基于这些考虑和结果中描述的数据，我们得出结论，含有EDA片段的FN在肉芽组织的组织中起着重要作用，可能在表皮细胞迁移中起着关键作用，无论是直接还是通过与其他ECM成分的相互作用。

纯合EDA突变小鼠的产生

成年小鼠和胚胎组织RNA的制备

用硫氰酸胍法从不同组织中制备总细胞RNA(Chomczynski和Sacchi，1987年)，通过在260和280 nm处测量吸光度进行定量，并通过在1%琼脂糖-甲醛凝胶上运行样品来确认RNA完整性。对于胚胎RNA样本，在立体显微镜（SMZ-10型；尼康）下解剖胚胎，并从5到6个胚胎（13.5天/年）中收集组织。根据制造商的说明，使用RNAZOL TM B（Biotecx实验室）制备RNA。

Northern印迹和放射性RT-PCR的mRNA分析

将10–20μg来自不同组织的总RNA变性并在1.2%琼脂糖-甲醛凝胶上运行，将其印在尼龙膜上（Hybond-N；Amersham Biosciences），并用亚甲基蓝溶液染色以验证转移的效率。膜在ExpressHyb中预混合^TM（TM）杂交溶液（CLONTECH Laboratories，Inc.）并与放射性标记探针杂交。使用BIOMAX MS胶片（Kodak）将其暴露过夜，并使用荧光成像仪（Canberra Packard）对放射性信号进行定量。按照在线补充材料的材料和方法部分所述分析FN cDNA。

蛋白质提取物的制备

手术切除成年小鼠组织，在裂解缓冲液中均质（150 mM NaCl、50 mM Tris-HCl、pH 8、1%wt/vol NP-40和2×完整蛋白酶抑制剂混合物[Boehringer]与聚四氟乙烯[Ultra-Turrax T8；Boehring er]），并在使用Bradford分析法（蛋白质分析试剂盒；生物实验室）。

对于胚胎，在立体显微镜的帮助下，每个基因型5到6个胚胎的组织被手术切除并合并。通过在150μl裂解缓冲液中超声处理制备蛋白质提取物。

蛋白质印迹分析

50μg蛋白质提取物在6%、12%和5-17%的SDS-PAGE凝胶梯度上进行。蛋白质被印在硝化纤维素膜上，与第一抗体和第二抗体孵育，并使用ECL系统（Amersham Biosciences）进行反应。使用了以下主要抗体：抗人FN山羊多克隆抗体（Sigma-Aldrich）、抗人EDA小鼠mAb 3E2（Sigma Aldrich₉-整合素兔多克隆（加利福尼亚州旧金山市旧金山大学D.Sheppard赠送）、抗β1-整合素兔子多克隆（圣克鲁斯生物技术公司）和抗β-微管蛋白单抗E7（衣阿华大学发育研究杂交瘤库）抗体。使用Versa-Doc分析仪（Bio-Read Laboratories）和Quantity One软件（第4版；Bio-Rad Laboratory）进行密度分析。

MEF的免疫荧光研究

来自EDA的胚胎成纤维细胞（13.5天）^{重量/重量}、EDA^+/+和EDA^−/−小鼠在盖玻片上培养24小时。细胞用4%vol/vol PFA清洗并固定在PBS中，用0.5%vol/vol-Triton X-100渗透到PBS中并封闭。细胞与抗人FN山羊多克隆抗体孵育，与山羊正常血清或mAb 3E2平行孵育；分别与荧光标记的兔抗羊IgG（DakoCytomation）或罗丹明标记的兔鼠IgG孵育。用荧光抗体直接孵育的细胞进行阴性对照。使用共焦激光扫描显微镜（Axiovert 100 M型；卡尔蔡司显微成像公司）进行免疫荧光分析。

伤口愈合

统计方法

使用2.0版GraphPad PRISM软件包进行数据分析。以平均值作为中心趋势的度量，以标准误差作为离散度的度量，对数据进行汇总。使用χ评估野生型和突变型小鼠之间的比例差异²Fisher Exact测试。p值0.05被选为统计显著性极限。使用对数秩检验统计分析来评估生存曲线。

我们感谢Pierre Chambon博士（法国斯特拉斯堡生物研究所）提供CRE转基因小鼠；G.福克纳批判性阅读手稿；Giancarlo Lunazzi和Mauro Sturnega负责动物护理。