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细胞生物学杂志。2004年2月2日；164（3）：427–439。
数字对象标识：10.1083/jcb.200306172
预防性维修识别码：PMC2172229型
PMID：14757754

MLCK和ROCK在成纤维细胞迁移过程中膜突起和局灶粘附动力学调节中的不同作用

前往Totsukawa,1 吴越,2 佐佐木康浩,三 大卫·J·哈特肖恩,2 山本义彦,1 山城Shigeko Yamashiro,1和松村富美1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

我们检测了肌球蛋白II的调节性肌球蛋白轻链（MLC）磷酸化在成纤维细胞迁移中的作用。肌球蛋白轻链激酶（MLCK）抑制阻断了细胞外围的MLC磷酸化，但不阻断细胞中心的磷酸化。MLCK抑制的细胞在边缘没有组装含酶的粘附，但在中心保持着局灶性粘附。它们在细胞周围产生膜突起，转向更频繁，迁移效率更低。相反，Rho-associated kinase（ROCK）抑制在中心阻止了MLC磷酸化，但在外围没有。ROCK抑制细胞在外围聚集含酶的黏附物，而在中心不聚集焦点黏附物。他们走得更快、更直。另一方面，抑制肌球蛋白磷酸酶增加MLC磷酸化，阻止外周膜皱褶，以及局部粘连和细胞迁移的转换。我们的结果表明，细胞外周被MLCK激活的肌球蛋白II控制膜皱褶，MLC磷酸化的空间调节在控制成纤维细胞的细胞迁移中起着关键作用。

关键词：细胞迁移；细胞极性；膜突起；MLCK；肌球蛋白磷酸化

介绍

细胞迁移对于正常和病理条件下的各种生物过程至关重要，包括细胞发育、组织修复和癌症转移。这是一个涉及多种细胞骨架成分的复杂过程(劳芬伯格和霍维茨，1996年；Mitchison和Cramer，1996年；雷德利，2001). 细胞迁移的第一步是沿运动方向产生膜突起。这个过程是由肌动蛋白聚合驱动的(Pollard等人，2000年)，也可能需要在突出部位添加新膜。第二步是在延伸膜中建立新的粘附位点。运动细胞在前缘聚集短暂粘连，称为焦复合体(Nobes and Hall，1995年). 在成纤维细胞中，局灶复合物成熟为更稳定的粘连，称为局灶粘连(Rottner等人，1999年). 最后，收缩力驱动细胞体向前运动，细胞的后部与基质分离。

肌球蛋白II被认为参与细胞迁移收缩力的产生。肌球蛋白II的活性主要由其轻链（MLC）磷酸化控制，而轻链磷酸化由两类酶调节，即MLC激酶和肌球蛋白磷酸酶(Hartshorne等人，1998年；Kamm和Stull，2001年；索姆利奥和索姆利欧，2003年). 肌球蛋白轻链激酶（MLCK）和ROCK/ROK/Rho激酶（本文称为ROCK）似乎是体内外磷酸化MLC的两种主要激酶。其他激酶，包括DAPK(Jin等人，2001年)，巴基斯坦(Chew等人，1998年)，ZIP激酶(Murata-Hori等人，1999年)和柠檬激酶(Yamashiro等人，2003年)已报道磷酸化MLC，尽管其生理意义尚未确定。肌球蛋白磷酸酶由一个PP1c-delta催化亚基、一个称为肌球蛋白磷酸靶向亚基（MYPT，也称MBS或M130）的大亚基和一个20-kD的小亚基组成(Alessi等人，1992年). MYPT是肌球蛋白磷酸酶活性的主要调节器，因为它结合PP1c和底物磷酸化肌球蛋白II，从而将底物靶向催化亚单位。MYPT被许多激酶磷酸化，包括ROCK/ROK/Rho激酶(Kimura等人，1996年)，ZIP样激酶(麦克唐纳等人，2001年)，整合素连接激酶(Kiss等人，2002年)，强直性肌营养不良蛋白激酶(Muranyi等人，2001年)和PAK(Takizawa等人，2002年)从而抑制肌球蛋白磷酸酶活性。包括PKA在内的其他激酶的参与(Ito等人，1997年)，包装(Surks等人，1999年)和一种未知的有丝分裂激酶(Totsukawa等人，1999年)在调节肌球蛋白磷酸酶活性方面也提出了建议。

人们普遍认为，肌球蛋白II在细胞迁移的最后一步中发挥作用，即通过后部收缩使细胞体向前移位(劳芬伯格和霍维茨，1996年；Mitchison和Cramer，1996年). 磷酸化肌球蛋白II在迁移细胞后部的定位支持了这一观点(Post等人，1995年；Matsumura等人，1998年). 然而，肌球蛋白II很可能在细胞迁移中发挥额外且更复杂的作用。使用一种针对磷酸化MLC的特异性抗体，我们观察到磷酸化肌球蛋白II也定位于运动成纤维细胞的前部(Matsumura等人，1998年). 虽然这一观察结果表明肌球蛋白II除了在后收缩中起作用外，在细胞外周细胞迁移中MLC磷酸化的作用尚不清楚。

使用一种新开发的MLCK抑制剂(Wu等人，2003年)和公认的ROCK抑制剂(Uehata等人，1997年)，我们已经能够分别在外周和细胞中心特异性地阻断MLC磷酸化。我们发现，MLC磷酸化的空间分化减少对细胞迁移、膜突起和自由移动的成纤维细胞的黏附动力学产生了显著相反的影响。我们的结果表明磷酸化肌球蛋白II在调节膜突起和细胞迁移中具有新的定位特异性作用。

结果

抑制MLCK可诱导多个膜突起，而抑制ROCK可将膜突起限制在一个部位

我们研究了MLCK或ROCK的抑制如何影响自由移动的成纤维细胞的细胞迁移。为了阻断MLCK，我们使用了一种新的膜透性生物素TAT抑制剂（BATI；见材料和方法）。为了阻止ROCK，我们使用了Y-27632，一种特殊的ROCK抑制剂。

用每种抑制剂处理沙土鼠纤维瘤细胞30分钟，然后用相控延时显微镜检查细胞迁移（参见视频1-4，网址：http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200306172/DC1)。图1A描绘了在0和60分钟时从延时电影中拍摄的图像（A和b用于对照；d和e用于MLCK抑制；g和h用于ROCK抑制；j和k用于MLCK和ROCK抑制的细胞）。为了显示净细胞易位，确定了0（红色）和60分钟（黑色）时每个细胞的地理中心，并通过连接两个中心以c、f、i和l显示了迁移距离。该分析表明，MLCK的抑制降低了净易位（f）。相反，抑制ROCK增加了地理中心的移位（i），尽管长尾巴（ROCK抑制引起的一种特征形态）通常与底物相连。当MLCK和ROCK均被抑制时，净移位与对照细胞相似（与c和l相比）。

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MLCK和ROCK抑制剂对细胞迁移、膜突起和细胞形态的影响。（A） 相控、延时视频显微镜。每行的左侧和中间面板分别显示0分钟和60分钟时的图像。每行的右侧面板显示净移位（有关详细信息，请参阅结果）。棒材，20μm。（B） MLCK禁止的单元格显示多个突起（箭头）。0、20、40和60分钟的延时图像对应于A（d）的矩形部分。（C） 细胞扩散和极性。测量细胞面积以及长轴和短轴的比率，以确定细胞扩散和极性，P<0.05；**，与对照组相比P<0.01，t吨测试。（D） 膜突起的Kymograph分析。A中显示的红线（1像素宽，100像素长）用于波形图分析。针对每种情况，至少进行了八次波形图分析。另请参阅视频1-4，网址为http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200306172/DC1。

MLCK和ROCK抑制剂对细胞形态以及细胞极性产生了非常不同的影响。尽管许多对照细胞(图1A、 A和b；见视频1）显示极化形态，有一个或两个膜突起，MLCK抑制细胞(图1A、 d和e；参见视频2）在细胞周围表现出多个且宽的突起，导致比对照更扩散的形态。这些突出物经常伸出和缩回，如所示图1B（箭头）。相反，ROCK抑制细胞显示出一个主要突起和极化形态(图1A、 g和h；请参阅视频3）。细胞扩散和极性的这些差异分别通过测量细胞面积和长短轴比率得到了证实(图1C） ●●●●。MLCK抑制细胞的平均面积增加了91%(n个=26）比对照细胞(n个= 64; P<0.01，t吨测试），而ROCK抑制细胞的面积(n个=23）与对照组非常相似。禁止MLCK和ROCK的区域(n个=29）细胞比对照组大30%（P<0.05，t吨测试）。细胞极性测定显示，ROCK抑制使平均比率增加38%（P<0.01，t吨而MLCK抑制使其降低了23%（P<0.05，t吨测试）。MLCK和ROCK抑制细胞的比例与对照细胞相似。

进行Kymograph分析以检查MLCK或ROCK抑制对前突膜活性的影响(图1D） ●●●●。在对照细胞中，突起膜边缘粗糙，边缘的相密度波动较大，表明膜在动态伸缩。在60分钟期间，大多数控制细胞的边缘向前移动。当MLCK被抑制时，膜的边缘是光滑的，边缘的相密度保持相对较低，这表明膜没有出现伸展和收缩的循环。边缘的运动每隔10-20分钟反转一次，导致边缘的净移位很少。相反，ROCK抑制细胞边缘的相密度高于MLCK抑制的细胞，但低于对照，表明膜皱褶的发生程度低于对照。最值得注意的是，边缘向前移动比控制细胞更一致、更快。当MLCK和ROCK均被抑制时，膜边缘向前运动的速度和一致性与对照细胞相似。然而，边缘的相密度表明膜活性介于ROCK和MLCK抑制细胞之间。

MLCK抑制的细胞在细胞迁移中诱导了更多的转折，而ROCK抑制细胞则移动更快、更直

为了详细研究这些抑制剂对细胞迁移的影响，我们追踪了对照、MLCK抑制、ROCK抑制以及MLCK和ROCK禁止细胞的迁移轨迹(图2A） ●●●●。分析清楚地表明，MLCK抑制细胞（右上角）的净易位比对照细胞（左上角）短得多。这种效应是针对MLCK抑制的，因为仅含有TAT载体序列的肽（没有MLCK的假底物序列）对细胞迁移没有影响（图S1，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200306172/DC1). 与MLCK抑制的细胞相比，ROCK抑制细胞（左下角）的移动距离远大于对照细胞。当MLCK和ROCK都被抑制时（右下角），轨迹与对照细胞相似。

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抑制MLCK和ROCK对细胞迁移路径、速率、转角和迁移距离的影响。（A） 迁移路径分析。左上角，控制单元；右上角，MLCK抑制的细胞；左下角，ROCK禁用单元格；以及右下角的MLCK和ROCK禁用单元格。（B） 显示轨迹转角分布的半圆直方图（分为0°到180°之间的20°段）。左，MLCK抑制细胞（蓝色）；中间，ROCK抑制细胞（红色）；右侧为MLCK和ROCK禁用单元格（绿色）。控制单元的柱状图（黑色）显示在每个面板的右侧，以进行比较。（C） 左，细胞迁移率；中间，60min内总迁移距离；细胞迁移的定向持续性。数据代表至少八个细胞轨迹的平均值±SD。**，与对照组相比P<0.01，t吨测试。

分析显示，MLCK抑制的细胞转弯更频繁，而ROCK抑制细胞的迁移更直。为了证实这一概念，我们测量了这些轨迹中每个分段的轨迹绝对转角，如所示图2B为半圆形直方图。为了进行比较，控制单元的角度分布显示在每个面板的右侧。该分析清楚地表明，MLCK抑制的细胞显示出均匀分布的转角，导致随机运动（左）。相反，ROCK抑制细胞表现出更多的定向迁移（中间）。当MLCK和ROCK均被抑制时（右），角分布与对照细胞相似。

图2C表示细胞迁移的速度，以及60分钟内净移位的距离和定向持续性。这些分析表明，ROCK抑制细胞的迁移率（0.44±0.09μm/min）明显高于对照细胞（0.31±0.04μm/min；P<0.01，t吨测试）。转速越高，转弯频率越低(图2B） 解释了为什么ROCK抑制细胞的移动距离（20.8±5.9μm）几乎是对照细胞（7.6±2.6μm）的三倍，并且显示出最高的方向持久性（0.83±0.14）。另一方面，MLCK抑制细胞的净移位（3.3±1.4μm）显著低于对照细胞（34%）（P<0.01，t吨试验），而迁移率与对照细胞相似（0.31±0.08μm/min）。与这些分析一致，MLCK抑制细胞的定向持久性（0.18±0.08）远低于对照细胞（0.52±0.10）。MLCK抑制对细胞迁移的抑制与以前的报道一致，即MLCK的失活导致嗜酸性粒细胞和中性粒细胞的细胞运动停止(Walker等人，1998年；Eddy等人，2000年). 当两者均被抑制时，其速率（0.34±0.06μm/min）、净易位（8.6±5.2μm）和定向持续性（0.43±0.21）似乎与对照细胞的值相似。

MLCK和ROCK在MLC磷酸化、肌动蛋白组织和粘连组装的空间调节中的不同作用

为了探讨抑制MLCK和ROCK对细胞迁移和细胞极性产生不同影响的机制，我们通过比率成像研究了这些抑制剂如何改变MLC磷酸化的空间分布(图3A） 然后分析了这些改变是如何影响焦点粘连的组装和肌动蛋白组织的(图3B） ●●●●。用于比率成像(图3A） 用抗肌球蛋白重链抗体（肌球蛋白HC；A、d、g和j）和抗磷酸化MLC抗体（P-MLC；b、e、h和k）对细胞进行双重染色。然后，使用IPLab图像分析软件（Scanalytics）生成磷酸化MLC/总肌球蛋白（c、f、i和l）的比率图像。检查局部粘连组织和肌动蛋白细胞骨架(图3B） ，用抗磷酸化MLC（a、d、g和j）和长春花蛋白（B、e、h和k）的抗体以及荧光鬼笔肽（c、f、i和l）对细胞进行三重染色。

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MLCK和/或ROCK抑制剂对MLC磷酸化的空间调节，以及对管状蛋白和F-actin的组织的影响。（A） MLC磷酸化比率图像分析。对照组（a–c）、MLCK-抑制组（d–f）、ROCK-抑制（g–i）或MLCK-和ROCK-抑制剂（j–l）细胞用抗肌球蛋白重链（肌球蛋白HC；a、d、g和j）和磷酸化MLC（P-MLC；b、e、h和k）的抗体双重染色。磷酸化MLC除以总肌球蛋白（P-MLC/HC）的比率图像如c、f、i和l所示。注意，MLCK抑制细胞的细胞边界由f中的虚线勾勒。对照组（a–c）、MLCK-抑制组（d–f）、ROCK-抑制（g–i）或MLCK-和ROCK-禁止组（j–l）细胞用磷酸化MLC（P-MLC；a、d、g和j）、vinculin（b、e、h和k）和荧光性卵磷脂（c、f、i和l）抗体进行三重染色。注意，MLCK抑制细胞的细胞边界用20μm的d.Bars中的虚线勾勒出来。

MLCK和ROCK在MLC磷酸化的空间调控中具有不同的作用(图3A） ●●●●。如前所示，对照细胞（a–c）在中心和外围（b）均显示MLC磷酸化(Matsumura等人，1998年). 比率成像（c）显示磷酸化肌球蛋白的双峰分布（箭头在前面，箭头在后面）。BATI对MLCK的抑制显著降低了MLC的磷酸化，特别是在细胞的外围，而不是在细胞的中心（f，用虚线表示的细胞边界）。相反，ROCK抑制的细胞在前部（h和i，箭头）保留MLC磷酸化，而细胞中心的磷酸化则大大减少。有趣的是，比率成像（i）揭示了尾部磷酸化肌球蛋白的富集（箭头）。当MLCK和ROCK均被阻断时，细胞在细胞中心或外围（l，箭头）均未显示出MLC磷酸化的富集，这验证了MLCK与ROCK是细胞中主要的MLC激酶的概念。比率成像显示磷酸化肌球蛋白在纤细、收缩的纤维状结构处富集（l，箭头）。

MLC磷酸化空间分布的这些改变似乎在很大程度上影响了粘附结构和肌动蛋白细胞骨架的组装(图3B） ●●●●。对照细胞在前缘和中心（b）均显示出vinculin染色，这与磷酸化MLC在这些细胞中的分布相对应（a）。MLCK抑制细胞（d–f）在细胞周围产生大的膜突起（箭头）。伴随着这些突起处MLC磷酸化的特异性丢失（d，虚线表示的细胞边界），该位置（e，箭头）的vinculin染色变得比对照弱得多。相反，细胞中心的局灶性粘连（以及应力纤维）似乎完好无损（e和f）。

岩石抑制产生了非常不同的效果（g–i）。细胞外围（h，箭头）的文丘林染色保留，而中心的文丘里染色丢失（h，星号）。虽然应力纤维被分解，但外周肌动蛋白组织似乎基本上未受影响（i，箭头）。当MLCK和ROCK均被抑制时（j–l），应激纤维和外周肌动蛋白丝消失，可能反映了整个区域MLC磷酸化的丧失。尽管在膜突起的最边缘观察到微弱的染色，使人联想到局灶性复合体，但在细胞质中也没有发现文丘林染色（k）。这表明这些结构的组装可能不依赖于MLC磷酸化。

上述分析表明，MLCK（而非ROCK）负责外围的MLC磷酸化。由于MLCK是一种仅磷酸化MLC的专用激酶，因此MLCK对MLC的磷酸化很可能控制膜突起以及膜突起边缘的强vinculin阳性结构的组装。活性MLCK的存在与FRET分析相一致，FRET分析表明活性MLCK-定位于膜皱褶(Chew等人，2002年)。

MLC磷酸化的改变，至少在部分上是ROCK抑制引起的细胞迁移和形态改变的原因

据报道，ROCK可磷酸化多种底物，包括MLC、MYPT、ERM蛋白和LIMK(Riento和Ridley，2003年). 为了确定MLC磷酸化是否参与细胞迁移中的ROCK依赖性改变，我们研究了MLC的磷酸化突变体（用天冬氨酸替换Ser19和Thr18）的表达如何调节细胞迁移，以及ROCK抑制细胞的肌动蛋白和局部粘附的组织。用磷酸化突变体（MLC-DD）或野生型MLC（MLC-WT）的GFP融合构建物转染沙土鼠纤维瘤细胞。然后用ROCK抑制剂处理转染的细胞，并通过延时相差显微镜进行分析。

我们发现，磷酸化突变体的表达抵消了ROCK抑制引起的细胞移位增加。图4A显示了用于鉴定转染细胞的GFP荧光图像（A和e），以及0（b和f）和60分钟（c和g）的相控图像，面板显示了这些时期（d和h）的迁移距离。即使在含有ROCK抑制剂的情况下，表达MLC-DD（a–d，箭头；另见视频5）的细胞也几乎没有移位，而其他未转染的细胞则表现出迁移增加。相反，转染MLC-WT（e–g，箭头）的细胞以与未转染细胞相似的方式迁移，并经常显示长尾巴，这是ROCK抑制细胞的特征（e–h，箭头；另请参阅视频6）。迁移轨迹分析(图4B） 证实了表达MLC-DD的细胞没有迁移，而表达MLC-WT的细胞迁移更为平直，并且走得更远，其模式与未转染细胞的模式没有区别（相比之下图4B带图2A） ●●●●。表达MLC-DD的细胞的迁移率（0.27±0.06μm/min）降低到转染MLC-WT细胞的55%（0.49±0.04μm/min图4B带图2C） ●●●●。MLC-DD表达细胞的迁移距离和定向持久性分别显著降低至1.01±0.65μm和0.11±0.04（MLC-WT表达细胞分别为19.5±5.83μm和0.69±0.05）。

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MLC-DD抵消了ROCK抑制引起的细胞移位增加。（A） 在ROCK抑制剂存在下，MLC-DD表达细胞（A–d，箭头）或MLC-WT表达细胞的细胞迁移（e–h，箭头）。a和e，GFP荧光图像。在0（b和f）和60分钟（c和g）时拍摄相位对照图像。d和h；在此期间的净易位。棒材，20μm。（B） 迁移轨迹（红线，MLC-WT-表达细胞；蓝线，MLC-DD-表达细胞）、迁移率、迁移距离和定向持久性。数据表示至少八个转染细胞轨迹的平均±SD。**，P<0.01，t吨测试。（C） MLC-DD表达细胞（a–C）和MLC-WT表达细胞的免疫荧光图像（d–f）。a和d，GFP荧光；b和e，vinculin；c和f，卵磷脂。棒材，20μm。另请参阅视频5和6，网址为http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200306172/DC1。

如所示图4C、 表达MLC-DD的细胞在ROCK抑制剂的存在下保留了应力纤维（C）和局部粘连（b）。此外，MLC-DD定位于应力纤维（a）。相反，表达MLC-WT的细胞与未转染的细胞相似。MLC-WT广泛存在于细胞质（d）中，未诱导局灶性粘连（e）或应力纤维（f）。这些分析表明，MLC磷酸化的变化至少在部分上负责细胞迁移和细胞形态的ROCK依赖性改变，尽管其他ROCK底物磷酸化的改变也可能参与细胞运动的改变。

ROCK抑制不诱导沙土鼠纤维瘤细胞Rac活化

据报道，ROCK抑制可激活瑞士3T3细胞中的Rac(Tsuji等人，2002年)增加HUVEC中的膜皱褶(Wojciak-Stothard和Ridley，2003年). 因此，Rac激活可能是ROCK抑制导致沙土鼠纤维瘤细胞运动增强的原因之一。然而，使用GST-PAK-PBD结构域的下拉分析显示，ROCK和MLCK抑制都没有改变我们细胞中活性Rac的水平（图S2，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200306172/DC1)。

抑制肌球蛋白磷酸酶阻止细胞迁移

MLC-DD表达对细胞运动的抑制表明，增加MLC磷酸化和/或阻止MLC磷酸化合转流抑制细胞迁移。为了验证这一想法，我们如前所述，通过微量注射MYPT功能抑制抗体（5 mg/ml）来阻断肌球蛋白磷酸酶(Totsukawa等人，2000年)，并检查其对细胞迁移、细胞形态和膜突起的影响。正如预期的那样，肌球蛋白磷酸酶的抑制大大增加了沙土鼠纤维瘤细胞的MLC磷酸化，导致更厚的应力纤维和更大的局部粘连（未发表的数据）。免疫前抗体（5 mg/ml）对MLC磷酸化或肌动蛋白细胞骨架的组织没有影响（未公布的数据）。

采用时间推移、相控显微镜分析对细胞迁移的影响。图5A显示注射标记物（A和e）的罗丹明提取物的荧光图像；注射后30分钟（b和f）和90分钟（c和g）拍摄的相控图像，以及显示60分钟期间（d和h）迁移距离的面板。注射了免疫前抗体的细胞（a–d，用箭头表示；视频7）和其他未注射的细胞一样迁移。相比之下，注射MYPT-Ab（e–h，用箭头表示；视频8）的细胞没有移动。迁移轨迹分析(图5B） 同时还发现，功能抑制抗体阻止了细胞迁移，而免疫前抗体没有显示出显著的作用（与之相比图5B带图2A、 左上角）。注射MYPT-Ab后，迁移距离和定向持久性分别显著降低至1.42±0.23μm（20%）和0.08±0.01（22%），而迁移率似乎没有变化(图5C） ●●●●。相反，注射免疫前抗体的细胞显示出迁移距离（7.00μm±3.43）和定向持久性（0.35±0.15），与未注射的细胞相似（比较图5C带图2C） ●●●●。

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抑制肌球蛋白磷酸酶阻止细胞迁移。（A） 免疫前抗体注射细胞（A–d）和MYPT-Ab注射细胞（e–h）的细胞迁移。箭头表示注入的细胞。a和e，注射标记。在微量注射后30分钟（b和f）和90分钟（c和g）时拍摄相位对照图像。d和h，净易位。棒材，20μm。（B） 迁移路径（免疫前抗体为红线，MYPT-Ab为蓝线）。（C） 迁移率、迁移距离和定向持久性。数据表示至少八个注射细胞轨迹的平均±SD。**，P<0.01，t吨测试。另请参阅视频7和8，网址为http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200306172/DC1。

MLCK而非ROCK对于前缘含酶粘附结构的动态组装至关重要

细胞迁移需要新的附着位点组装。因为MLCK和ROCK抑制剂对含vinculin结构的空间组织产生了明显的影响(图3B） 以及运动性(图1和图2)，我们分析了这些抑制剂如何影响粘附结构的动力学。为此，我们使用了表达GFP zyxin的细胞，因为zyxin是组装局灶复合物和成熟局灶粘连的良好标志物(Rottner等人，2001年). 首先用GFP-zyxin转染沙土鼠纤维瘤细胞，用抑制剂处理，然后用延时荧光显微镜观察。图6描述了从延时电影中拍摄的代表性图像。

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MLCK、ROCK和肌球蛋白磷酸酶在含酶结构动力学中的不同作用。（A） 时间荧光显微镜检查MLCK和ROCK抑制作用。（a） 对照细胞；（b） MLCK抑制细胞；（c） ROCK抑制细胞；（d） MLCK-和ROCK抑制细胞。以分钟为单位显示的时间（B）肌球蛋白磷酸酶的抑制作用。微量注射后的时间以分钟为单位。箭头表示含有GFP-zyxin的结构。棒材，20μm。另请参阅视频9–13，网址为http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200306172/DC1。

在控制细胞中，焦复合体和粘连的组装是动态的(图6A、 A；视频9）：在前缘外围新形成了含酶的结构。这些结构是高度瞬态的（a，箭头），其中一些结构成熟为局灶性粘连。如前所述(Smilenov等人，1999年)，在细胞迁移过程中，局部粘连没有改变其位置。随着细胞向前移动，焦点粘连位于细胞内并消失（大多数焦点粘连在10分钟内被分解；参见视频9）。

抑制MLCK可阻止膜突起边缘含酶结构的形成和/或成熟(图6A、 b；视频10）。虽然细胞在细胞周围产生膜突起，但这些突起显示出GFP-zyxin（b，箭头）的微弱信号。另一方面，在细胞内观察到许多局部粘连，并且相对稳定。这些观察结果表明，MLCK是在前缘组装和/或成熟含酶粘附结构所必需的，而不是在中心组装成熟的局灶性粘附。

相反，ROCK抑制细胞(图6A、 c）在前缘组装了高度动态的含酶结构（c，箭头；视频11）。然而，随着细胞向前移动，这些结构并没有成熟为局灶性粘连。相反，它们在细胞内迅速分解，表明中心的ROCK活性对于成熟为局灶性粘连至关重要。当MLCK和ROCK均被抑制时(图6A、 d；视频12），在前缘和细胞内均未形成强的酶蛋白阳性结构。相反，弱的含酶结构在整个细胞中呈短暂的小病灶。

肌球蛋白磷酸酶的抑制阻断了局灶性粘附组装的周转

最后，我们研究了MLC磷酸化的增加是如何改变黏附分子聚集的动力学的。将功能抑制抗体注射到表达GFP-zyxin的细胞中，并按照前一节所述监测局部粘附组装的动力学。

注射抗体阻止了局部粘连的分解(图6B） ●●●●。虽然注射的细胞最初表现出中度收缩，但局部粘连变得越来越长越来越大，并且在60分钟的时间窗口内没有被分解(图6B、 箭头；视频13）。相比之下，注射免疫前抗体的大多数细胞的局灶性粘连在10分钟内被分解（未公布的数据）。这些结果表明，肌球蛋白磷酸酶的阻断抑制了局部粘连的周转，从而抑制了细胞迁移。在最初的收缩过程中，注入的细胞没有表现出典型的膜突起或皱褶。注射后约20–30分钟，收缩最终停止，然后抗体注射细胞表现出非典型的膜突起（即短伪足样突起；见视频13）。这些突起迅速缩回，可能是由于肌球蛋白II的高活性收缩性，并且在突起处没有建立稳定的含有zyxin的粘附。

讨论

MLC磷酸化在细胞迁移中的定位特异性作用

我们的结果阐明了肌球蛋白II在调节膜突起以及黏附结构动力学中的定位特异性作用。

单元外围和前缘

我们认为在外周磷酸化的肌球蛋白II具有两种功能。首先，这个位置的磷酸化肌球蛋白II通过抵消肌动蛋白聚合产生的突起活性来限制膜突起。这一观点得到了以下观察结果的支持：在MLCK抑制细胞的外围，MLC磷酸化的丢失导致细胞周围出现膜突起(图1和图3). 这也得到了交互实验的支持：由于阻断肌球蛋白磷酸酶而增加的MLC磷酸化抑制了膜皱褶(图5). 肌球蛋白II的这种作用也与以前的报告一致，该报告显示粘液菌肌球蛋白II缺陷突变体向多个方向延伸膜突起(Wessels and Soll，1990年)。

其次，外围磷酸化肌球蛋白II对于运动细胞前缘含维酮和酶蛋白的粘附结构的组装和/或成熟是必要的。虽然MLCK抑制的细胞在突起的末端形成了微小的焦点接触样结构(图3B、 e；图6A、 b），这些结构没有组装或成熟成较大的粘连。此外，与对照细胞相比，MLCK抑制细胞的突起收缩更频繁(图1D、 比较视频1和视频2）。这些观察结果表明，组装和/或成熟为大的含维酮和酶的结构提供了粘附位点，从而稳定了运动细胞前部的膜突起。MLCK抑制细胞突起的不稳定性，以及它们在多个位置的出现，解释了为什么这些细胞表现出更频繁的转向和更低的细胞迁移效率。虽然磷酸化肌球蛋白可能直接影响膜突起或粘连的形成，但这种影响也可能是间接的。例如，MLC磷酸化可能调节“内-外”信号，影响整合素与ECM的相互作用，进而导致细胞突起和细胞迁移的改变。

单元格中心

中心的MLC磷酸化是外周黏附结构成熟为局灶黏附所必需的。在ROCK抑制的细胞外围组装的含有Vinculin-和zyxin的结构在进入中心时迅速消失，而没有成熟为局灶性粘连(图6A、 c）。成熟的局灶性粘连是相对稳定的结构，可能对细胞迁移机制起到“刹车”的作用。岩石禁闭细胞缺乏刹车可以解释为什么这些细胞移动更快、更直(图2)，尽管其他ROCK底物的变化可能有助于细胞迁移的改变。

MLCK和ROCK差异调节MLC磷酸化的周转率

我们认为，MLCK和ROCK可以通过调节MLC磷酸化的周转率来差异调节这两个位置的粘附结构动力学。虽然MLCK和ROCK都能磷酸化MLC，但MLCK的比活性比ROCK高一到两个数量级(Amano等人，1996年；Feng等人，1999年). MLCK和肌球蛋白磷酸酶都定位于膜皱褶(Chew等人，2002年；Smith等人，2003年; 未公布的数据），并且这种在前沿的共定位将导致MLC磷酸化的高周转率。因为在前缘的含vinculin和zyxin的粘附结构的组装依赖于MLC磷酸化，所以高周转率将允许在前缘动态组装和拆卸这些结构。另一方面，在细胞中心，ROCK可以实现MLC的较慢磷酸化，并通过MYPT的磷酸化抑制肌球蛋白磷酸酶。这将导致细胞中心MLC磷酸化的转换速度非常缓慢，这可以反映出局部粘连的相对稳定性质。

定向迁移过程中MLC前部磷酸化的调控机制

MLCK抑制细胞中多个膜突起的产生表明，如果肌球蛋白II失活，肌动蛋白聚合和由此产生的膜突起可能发生在周围任何地方，而没有外部信号。因此，当运动细胞表现出定向运动时，必须有一种机制精确地控制细胞外周的MLC磷酸化。前缘的调节可能很复杂，因为前缘对于膜突起应该具有低MLC磷酸化状态，同时对于粘附结构的组装应该具有高MLC磷酸化状态。图7描述了一个可能的模型。我们假设肌球蛋白磷酸酶在运动细胞的前缘被激活(图7，A和B). 这可能反映了Rac在前沿的激活(Kraynov等人，2000年；Gardiner等人，2002年). 活性Rac已被证明能下调Rho活性(Sander等人，1999年)可能通过p190RhoGAP的激活，p190RhosGAP是一种Rho-GTP酶激活蛋白，定位于膜皱褶(阿瑟和伯里奇，2001年；Nimnual等人，2003年). 这将导致ROCK失活，从而否定对肌球蛋白磷酸酶的抑制作用，即明显的激活。

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运动细胞前部肌球蛋白II磷酸化作用的模型。（A） 运动细胞前沿的低MLC磷酸化状态；（B） 运动细胞前沿的高MLC磷酸化状态；（C） 固定细胞外围的高MLC磷酸化状态。MLC磷酸化的周转率在A和B中较高，但在C中较低。有关详细信息，请参阅讨论。

前沿如何同时具有高和低MLC磷酸化状态？一种可能性是MLCK活性可能波动。处于低活动状态(图7A） ，MLC磷酸化减少，从而允许膜突起。处于高活动状态(图7B） ，MLC磷酸化暂时增加，在外围聚集新的和暂时的粘附。高MLC磷酸化也可能起到收缩力的作用。高肌球蛋白磷酸酶活性以及MLCK活性的变化将促进前缘MLC磷酸化的转换，导致细胞迁移的突起、粘连和回缩周期。如果肌球蛋白磷酸酶失活(图7C） MLC磷酸化在外周增加，限制膜突起。同时，磷酸化的周转减少，形成稳定的粘附并阻止细胞迁移。这种情况是通过用功能抑制抗体阻断肌球蛋白磷酸酶来实现的(图5和图6B） ●●●●。

其他上游分子可能参与细胞迁移过程中肌球蛋白磷酸酶和MLCK的调节。例如，活性Rac可能在前沿抑制MLCK，因为据报道Rac-activated protein kinase（PAK）通过磷酸化MLCK抑制了MLCK(Sanders等人，1999年). MLCK的其他可能调节机制包括PKA的抑制作用(Lamb等人，1988年)并通过MAPK激活(Klemke等人，1997年). 肌球蛋白磷酸酶可通过MYPT的磷酸化和许多激酶进行调节，包括ROCK、PAK、ZIP样激酶、强直性肌营养不良蛋白激酶和整合素连接激酶。显然，调控机制可能很复杂，MLCK和肌球蛋白磷酸酶的活性可能因细胞类型而异。这种变化可能是细胞迁移过程中对ROCK抑制剂产生细胞类型特异性反应的原因之一。例如，ROCK抑制剂Y-27632被证明可以促进或抑制细胞迁移(Itoh等人，1999年；Nobes and Hall，1999年；Wojciak-Stothard和Ridley，2003年). 最近有报道称，抑制ROCK可诱导白细胞的多个膜突起(Worethake和Burridge，2003年)这与沙土鼠纤维瘤细胞的结果相反。白细胞中的MLCK活性可能较低，ROCK抑制剂甚至可以消除前部的MLC磷酸化。如果是这样，这将导致多个突起的产生和细胞迁移效率的降低。未来的分析应着眼于阐明在特定条件下改变不同类型细胞中MLCK、ROCK和肌球蛋白磷酸酶活性的上游信号级联。关键是要确定这些改变如何导致MLC磷酸化的定位特异性变化，以及磷酸化的空间变化如何影响细胞迁移。这些分析有助于我们了解细胞运动在正常和病理条件下是如何调节的，包括胚胎发生、组织修复和癌症转移。

材料和方法

试剂、蛋白质和抗体

抗体的使用如下：抗MYPT的pAb(Totsukawa等人，2000年); 针对Ser 19-磷酸化MLC的单克隆抗体(樱田等人，1998年); 抗Ser19-磷酸化MLC的pAb(Matsumura等人，1998年); 抗血小板肌球蛋白重链抗体（马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院J.Sellers博士和R.Adelstein博士赠送）；抗光滑/非肌肉肌球蛋白重链单克隆抗体（Immunotech）；单克隆抗Rac1抗体（BD Biosciences）；和单克隆抗长春新碱抗体（Sigma-Aldrich）。

Y-27632是ROCK的一种特殊抑制剂，由吉通制药工业公司提供。由Drs J.Wehland（Gesellschaft für Biotechnologische Forschung，Braunschweig，德国）和J.V.Small（奥地利科学院，奥地利维也纳）提供EGFP-zyxin的哺乳动物表达载体（pEGFP-N1-zyxin）；pEGFP-N1-MLC-WT和pEGFP-N1-MLC-DD的哺乳动物表达载体由K.Kelly博士（马里兰州贝塞斯达国家癌症研究所；Ward等人，2002年); 由R.a.Cerione博士（纽约州伊萨卡康奈尔大学；Bagrodia等人，1998年). 罗丹明-外显子和香豆素结合的卵磷脂分别购自Molecular Probes，Inc.和Sigma-Aldrich。

基于TAT载体和光滑/非肌肉MLCK的假底物序列构建了膜透性MLCK抑制肽（BATI）(Wu等人，2003年). MLCK序列KKYMARRKWQKAGHAV(Foster等人，1990年)融合到TAT序列YGRKKRRQRRRPPQ的COOH末端(Schwarze等人，1999年); 生物素附着在NH上2检查膜渗透性的终点。对于平滑肌和骨骼肌MLCK，该抑制剂的IC50（在1 mM ATP下测量）均为0.4μM(Wu等人，2003年). BATI显示～100%的转染效率，并在15分钟内容易在细胞内转运。BATI对ROCK无抑制作用。作为对照，我们使用了不含假底物序列的TAT载体序列，该序列在1mM ATP下对MLCK活性没有抑制作用。

时间推移记录

沙土鼠纤维瘤细胞（CCL146，American Type Culture Collection）保存在含有10%FCS的DME中。为了进行延时观察，将盖玻片上的细胞转移到含有10%FCS的Hepes-buffered DME（Invitrogen）中，并覆盖矿物油以防止蒸发。然后将细胞置于温度控制培养箱（MS200D，Narishige）中，以将温度保持在37°C，并在显微镜（TE300；Nikon）下用20×Plan-Fluor相位控制物镜（NA 0.45）进行观察。时间推移图像由CCD摄像机（CoolSNAP fx；Roper Scientific）和IPLab图像分析软件（Scanalytics）拍摄。为了观察MLCK或ROCK抑制的效果，在延时记录之前，用20μM BATI和/或10μM Y27632处理细胞30分钟。在成像过程中出现了药物。为了观察局部粘附动力学，将pEGFP-N1-zyxin表达构建物微注射到细胞中。然后对表达EGFP-zyxin的细胞进行如上所述的延时观察，但使用40×Plan-Fluor相控透镜（NA 0.6）除外。使用LipofectAMINE™Plus试剂（Invitrogen）将pEGFP-MLC-WT或pEGFP/MLC-DD转染细胞。

细胞迁移分析

运动参数包括迁移率、迁移路径、距离、方向持续性和波形图都是从延时电影中获得的。由于沙土鼠纤维瘤细胞在此时间窗内很少改变方向，因此每隔2分钟记录一次图像。为了跟踪迁移路径，手动跟踪每个帧的单个单元格的轮廓，并使用IPLab图像分析软件记录地理中心。使用Microsoft Excel程序将迁移路径表示为图形。分析了每种情况下至少八个细胞的迁移轨迹。细胞迁移率通过平均约30段迁移路径来确定。迁移距离被确定为60分钟内移动的净易位。为了可视化细胞迁移的方向性，测量了轨迹的两个连续段所形成的转向角，并用半圆直方图显示了绝对转向角的分布。定向持久性（D/T比）是指60分钟内的直接距离（D）与迁移路径总长度（T）的比值。细胞扩散通过测量细胞面积来确定，并通过将对照细胞的平均面积标准化为1.0来表示为相对值。通过测量细胞的长轴和短轴的比率来确定细胞极性。使用IPLab软件对膜突起进行Kymograph分析。

免疫荧光

在盖玻片上生长的细胞在室温下用3.7%的甲醛在PBS中固定10分钟，并在−20°C下用丙酮渗透5分钟。使用的主要抗体是多克隆抗肌球蛋白重链（1/500）、单克隆抗磷酸-MLC（1/50）、多克隆抗磷酸-MLC（1/25）或抗长春花碱（1/400）。使用的二级抗体是FITC抗小鼠IgG和TRITC抗兔IgG（1/100，Jackson ImmunoResearch Laboratories）。香豆素-球蛋白用于F-actin染色。使用显微镜（TE300；尼康）、60×（Plan Apo，NA 1.4）相位控制物镜、CoolSNAP fx CCD相机和IPLab软件采集图像。使用Adobe Photoshop处理图像®6.0. 对于中的比率成像图3使用IPLab软件，将P-MLC染色（带有单克隆抗体）的灰度图像除以总肌球蛋白的相应图像（带有肌球蛋白重链的单克隆抗体染色）。基本上，使用抗肌球蛋白重链单克隆抗体和抗P-MLC单克隆抗体的比率成像得到了相同的结果。

在线补充材料

图S1显示TAT控制肽对细胞形态和迁移没有影响。图S2显示，Y27632或BATI处理不会激活Rac。活动单元格的相应QuickTime电影文件组织如下：视频1-4图1A；的视频5和6图4A；的视频7和8图5A；视频9–12图6A；和视频13图6B.在线提供补充材料http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200306172/DC1。

致谢

我们感谢J.Wehland博士和J.V.Small博士对GFP-zyxin构建的支持；J.Sellers博士和R.Adelstein博士研究非肌肌球蛋白重链抗体；K.Kelly博士负责GFP-MLC结构；R.A.Cerione博士用于GST-PBD构建；Y27632 Yoshitomi制药工业公司；请F.Deis博士批判性阅读这份手稿。

这项工作得到了国家卫生研究院拨款CA42742（给F.Matsumura）和HL23615（给D.J.Hartshorne）的支持，美国心脏协会拨款（给S.Yamashiro），以及Busch纪念基金（给F.Matsumuro）的支持。G.Totsukawa得到了白血病研究基金会和美国心脏协会（0225689T）的博士后奖学金的支持。F.Matsumura是新泽西癌症研究所的成员。

笔记

本文的在线版本包括补充材料。

本文中使用的缩写：BATI，生物素TAT抑制剂；MLC，肌球蛋白轻链；肌球蛋白轻链激酶；肌球蛋白磷酸酶靶向亚单位；ROCK，Rho激酶。

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文章来自细胞生物学杂志由以下人员提供洛克菲勒大学出版社