SecY和转运多肽之间形成的二硫桥将转运孔定位在SecY的中心

生成到SecY中特定位置的二硫键桥

将单半胱氨酸引入大肠杆菌第二，我们首先将其两个内源性半胱氨酸突变为丝氨酸（图3A，下划线）。使用的晶体结构詹纳西伊先生以及所有已知Sec61/SecY分子的序列比对作为指导，我们接下来在30个选定位置引入了单半胱氨酸取代（图3A）。然后，我们使用全长proOmpA作为底物（未发表的数据），在纯化的突变SecY复合物重组为蛋白脂质体后，测试其转位活性。其中5个突变体（I82C、I86C、I189C、S323C和F387C）与野生型SecY复合体相比活性<40%，因此被丢弃。然后在不含半胱氨酸的SecA突变体存在下，将用活性复合物产生的蛋白脂质体与pOA220:tRNA孵育。样品通过离心造粒，在氧化剂存在下重新悬浮，以促进二硫键桥的形成，并通过非还原性SDS-PAGE进行分析。

最初的实验显示了两个SecY突变体，G69C和S282C，它们为pOA220:tRNA提供了有效的交联。我们用一些对照来表征这些交联。在整个系统中可以看到预期大小的交联带(图2A、 泳道1和6，箭头），但在缺乏ATP（泳道2和7）、SecA（泳道3和8）或氧化剂（泳道5和10）的样品中缺失。含有无半胱氨酸proOmpA的样品中没有交联(图2A、 通道4和9）或无半胱氨酸SecY(图2B、 通道2），或是由缺乏信号序列的易位底物生成的(图2B、 车道10）。用纯化的抗SecY抗体在变性条件下通过免疫沉淀法证实交联产物中存在SecY(图2C） ●●●●。当样品在交联后用核糖核酸酶处理时，交联产物显示出增加的流动性，约为15 kD，正如tRNA部分丢失所预期的那样(图2A、 车道12，标记为“pOA220xSecY”）。如果在移位和交联之前用RNase处理翻译混合物，则该条带不存在（第13道），这表明完全移位的底物不会与SecY形成交联。综上所述，这些结果证实了二硫键的形成与阻滞的易位中间体可用于识别围绕新生链的SecY中的特定氨基酸。

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图2。

SecY第69和282位的半胱氨酸与pOA220:tRNA形成二硫键。（A） 纯化SecY突变体G69C和S282C，将其重组为蛋白质脂质体，与不含半胱氨酸的SecA和³⁵S-pOA220:tRNA在ATP存在下，并用100μM四硫代酸盐处理以促进二硫键的形成。“完整”包含所有组件；“−”表示省略的组件。“pOA[Gly175]”是指位置175处含有甘氨酸而非半胱氨酸的pOA220。如有指示，在交联之前或之后（X链前和X链后）用RNase处理样品。箭头指向基板的位置以及与SecY和SecA的交联。与SecY的交叉链接也用箭头高亮显示。（B） 用pOA220或缺乏信号序列的底物进行交叉链接（NH缺失₂-pOA220的21 aa号端子；无SS）。SecY突变体缺乏半胱氨酸（0Cys）或在69位（G69C）含有一个半胱氨酸。SecA要么是野生型（WT），要么缺乏三个（N95）或全部四个（0Cys）半胱氨酸。（C） 用亲和纯化的多克隆抗SecY抗体或对照抗体对交叉链接样品进行变性和免疫沉淀（IP）。（D）³⁵S-pOA：220、229或293个氨基酸的tRNA片段用不含半胱氨酸（0cys）的SecY或在76、79、131、194或282位的单个半胱氨酸转运到蛋白脂质体中。

当含有四种内源性半胱氨酸的野生型SecA被用于产生易位中间产物时，在与SecY的交联上方可以看到额外的条带(图2B、 车道1-4）。如果使用缺乏四种内源性半胱氨酸（N95）中三种的截短型SecA，则这些与SecA的交联会变得更加微弱，并且尺寸会略微减小(图2B、 车道5和6）。如果剩余的半胱氨酸发生突变，SecA交联完全消失(图2B、 车道7和8）。我们在剩下的实验中使用了这种无半胱氨酸突变体。

接下来，我们生成了不同长度的易位中间产物，将半胱氨酸保持在175位，并比较了它们在SecY的几个位置与半胱氨酸形成交联的能力。观察到S282C的交联具有211aa的链长，但没有183或200个残基的链（未发表的数据），其中Cys175预计在核糖体内。含有229个残基的链（pOA229），位置76、79、131和194与pOA220具有相似的交联，但强度较低(图2D、 1–13）。链长为293 aa时，大多数交联消失(图2D、 车道14-18）。S282C位置仍然可以检测到弱交联(图2D、 可能是因为易位底物的随机往返运动偶尔会将Cys175定位在通道内。因为pOA220提供了最有效的交联，所以它被广泛用于SecY中与新生链相互作用的位置的屏幕。

筛选SecY与转位多肽的相互作用位点

我们首先测试了SecY内部的位置，选择形成假定沙漏形通道颈部的残基，以及收缩上方和下方的残基。TM2a中的六个位置-G69、TM5中的I191、TM7中的I278和S282以及TM10中的T404和I408与SecY的交联最强(图3B） ●●●●。抗SecY抗体的免疫沉淀证实了这些交联的特性(图3C） ●●●●。还发现其他几个位置的交联较弱，尤其是Q93、I187、H264、K268和F286(图3B） ●●●●。正如预期的那样，缺乏半胱氨酸的SecY复合物（0Cys）未能产生交联。接下来，我们测试了分子外部的位置，选择预计位于膜中部附近的残基，面向SecY复合物的外部并环绕周边（G28、V126、V162、A193、A229和V413）。这些位置都没有产生显著的交联(图3D） ●●●●。同样，野生型SecY（WT）也没有观察到交联，其329和385位含有半胱氨酸(图3D） ●●●●。这些位置位于SecY的外部，靠近膜的中间，但不直接指向外部。总之，这些结果表明，易位孔位于SecY复合体的内部。

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图3。

识别SecY中与转位多肽接触的氨基酸。（A） 漫画显示了SecY的拓扑结构以及半胱氨酸取代内源性残基的位置。强调了两种内源性半胱氨酸。方框中的数字表示预测朝向分子外部的位置。TM螺旋TM2a（洋红色）、TM2b（蓝色）和TM7（黄色）突出显示。（B） 在预测的朝向分子内部的位置带有单半胱氨酸取代的纯化SecY复合物在ATP存在下与pOA220:tRNA形成二硫键的能力，如在图2; 0Cys，SecY缺乏半胱氨酸。箭头表示基板及其与SecY的交联。箭头突出显示最强的交叉链接（>30%的pOA220:tRNA链接到SecY）。所示凝胶代表至少三个独立实验。（C） 用亲和纯化的多克隆抗SecY（Y）或对照（−）抗体对交联样品进行变性和沉淀。（D） 筛选外部位置具有单半胱氨酸取代的SecY分子，以了解其与pOA220形成二硫键的能力。S282C作为交联的阳性对照。0Cys，SecY缺乏半胱氨酸；WT，野生型SecY（氨基酸329和385的半胱氨酸）。箭头突出显示SecY S282C的交联。所示凝胶代表至少三个独立实验。

我们使用核糖体作为一个庞大的物体来阻止多肽的翻译后易位，因为它最大限度地减少了底物的聚集。然而，在使用纯化的proOmpA片段（227 aa）的实验中获得了类似的交联结果，该片段在其COOH末端含有一个13氨基酸长的二硫键环，用于阻止移位(Tani等人，1990年)和175位的游离半胱氨酸（图S1，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200412019/DC1).

蛋白质脂质体的制备、交联实验和易位分析

如前所述，将16.8μl TNG缓冲液中纯化的SecY突变体（16.8μg）重组为磷脂囊泡(Collinson等人，2001年).

用合适的引物通过PCR产生编码proOmpA（pOA）的短DNA模板，该模板在氨基酸175处由甘氨酸替换为半胱氨酸，并且缺少终止密码子，并用SP6聚合酶通过体外转录制备mRNA。截短的pOA片段（pOA#：tRNA，其中#代表截短蛋白中存在的最后一个氨基酸）在[³⁵S] 在30°C下，通过体外翻译蛋氨酸（兔网织红细胞裂解物；Promega）20分钟。如有指示，翻译混合物通过与20mM葡萄糖和0.2U/μl己糖激酶孵育（在30°C下孵育15分钟）来耗尽ATP。除用RNase处理样品外，所有缓冲液均含有1 U/μl SUPERase-In（Ambion）。当在交联前去除tRNA时，样品在30°C下用1/50体积的RNase鸡尾酒（Ambion）处理5分钟。当在交联后进行RNase消化时，样品在37°C下用添加0.01 U/μl RNase V的三分之一体积RNase鸡尾酒处理30分钟₁（Ambion）和3%Triton X-100。

为了产生一种阻滞的易位中间体，将含有SecY复合物的1.8μl蛋白质脂质体与1μl体外翻译的蛋白质脂质体混合³⁵S-pOA220:tRNA和1μg无半胱氨酸（除非另有说明）SecA(Osborne等人，2004年)在7.2μl缓冲液中。最终浓度为50mM KCl、50mM Hepes、pH 7.5、1.8%甘油、5mM MgCl₂0.5 mg/ml乙酰化BSA（B-2518；Sigma-Aldrich）和4 mM ATP。在37°C下培养15分钟后，将样品与90μl SM缓冲液（150 mM NaCl，5 mM MgCl）混合₂，10 mM Hepes，pH 7.5），含有2 mg/ml乙酰化BSA，并在4°C下以14000 rpm造粒15分钟。用100μl ST缓冲液（150 mM NaCl，5 mM MgCl）洗涤颗粒₂，10 mM Tris，pH 8），重新悬浮在含有0.1 mM四硫酸钠（Sigma-Aldrich）的10μl ST缓冲液中，并在37°C下培养10分钟。N个-将乙基马来酰亚胺（Sigma-Aldrich）添加到20 mM冰上5分钟。然后使用3μl 5×样品缓冲液（250 mM MES，pH 6.5，25%甘油，10%十二烷基硫酸钠，0.25 mg/ml溴酚蓝）在40℃下将样品溶解3 min。如前所述，使用在10μl ST缓冲液中重新悬浮的样品进行转运分析(Or等人，2002年). 使用MES运行缓冲液在NuPage 10%Bis-Tris迷你凝胶（Invitrogen）上分离样品，并通过荧光成像进行可视化和定量（Fujix BAS 2000）。使用Adobe Photoshop进行线性背景减除和图像裁剪。

交联产品分析

对于免疫沉淀，将粒剂溶解在10μl 8 M尿素和1%十二烷基硫酸钠的SM缓冲液中，加热至40°C 10分钟，在SM缓冲液中将1%Triton X-100稀释20倍，然后与针对COOH末端SecY肽或无关对照肽的珠状纯化抗体混合。在4°C下孵育1小时后，用1%Triton X-100在SM缓冲液中清洗珠子三次，并用样品缓冲液洗脱结合蛋白。

感谢Wendy Garrett博士、Tommy Kirchhausen、Andrew Osborne和Pamela Wearsch博士对手稿的批判性阅读。我们感谢Andrew Osborne（T.Rapoport实验室）提供了无半胱氨酸SecA突变体。

这项工作得到了国家卫生研究院对T.a.Rapoport的拨款支持。K.S.Cannon是白血病和淋巴瘤协会的理查德·弗里斯比三世基金会研究员。小克莱蒙斯（W.M.Clemons Jr.）拥有Damon Runyon癌症研究基金会的奖学金。T.A.Rapoport是霍华德·休斯医学研究所的研究员。