神经节苷脂诱导分化相关蛋白1是线粒体网络的调节器

GDAP1是一种线粒体蛋白

接下来我们确定了GDAP1的精确亚细胞定位。在转染了未标记的GDAP1全长表达结构的COS-7细胞中，我们发现GDAP1在表达开始时在细胞质中具有不同的管状和水泡状结构(图2A） ●●●●。这些GDAP1阳性形成物通过与线粒体标记物MitoTracker一致的共线性鉴定为线粒体(图2A、 A–d），细胞色素c（c）(图4B） ，和孔蛋白（未描述）。没有发现与其他膜室有明显重叠，包括高尔基复合体（标记giantin；图2A、 e–h）或ER（标记蛋白二硫键异构酶[PDI]；图2A、 i–l）。

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图2。

GDAP1是一种线粒体蛋白。（A） 转染COS-7细胞，转染GDAP1表达结构12小时后。GDAP1与线粒体标记物MitoTracker Red（a–d）共定位，但与高尔基复合体标记物giantin（e–h）或ER标记物PDI（i–l）在单平面共焦照片（0.4μm切片）上不共定位。以c、g和k为单位的棒材，10μm；d、h和l中的棒材，2μm。c、g和k中的方框表示d、h和l中的放大区域。（B）用差速离心法富集内源性表达GDAP1的N1E-115细胞的线粒体。每车道装载20μg离心步骤产生的蛋白质。粒剂中线粒体蛋白孔蛋白和GDAP1（而非ER蛋白PDI）的含量增加。

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图4。

GDAP1促进线粒体分裂。（A，A）未转染的COS-7细胞显示囊泡和管状线粒体，用MitoTracker Red标记。（b）线粒体EGFP融合蛋白hTOM7的瞬时转染不会改变这种外观。（c） 转染GDAP1后15小时，线粒体结构改变为部分碎片状。（d） 20小时后，大多数线粒体破碎。（e） 通过对GDAP1表达细胞线粒体外观进行分类，对形态学结果进行量化。显示了聚集、管状、混合、囊泡和碎片线粒体外观的代表性图像。棒材：（a–d）10μm，（e）5μm～对来自三个独立实验的每种条件下的500个转染细胞进行计数。所有变化都非常显著（概率>卡方>0.001，使用JMP 5进行应急分析时将所有条件与对照转染细胞进行比较[JMP Discovery]）。（B） 用GDAP1（a，B）或编码裂变因子EGFP-hFis1（c，d）的0.5μg质粒DNA瞬时转染HeLa细胞，转染后36 h固定。EGFP-Fis1的表达导致细胞色素的释放c（c）进入细胞质（c，d）。细胞色素的专属线粒体定位c（c）在表达GDAP1（a，b）的细胞中观察到。（C） 染色剂MitoTrackerH的线粒体摄取₂XRos进入HeLa细胞依赖于线粒体（a）的活性，可以被原核cccp（b；10μM，45分钟）（b）阻断。用EGFP-hFis1（0.25μg；c，d）和GDAP1（0.5μg；e，f）表达构建物转染HeLa细胞，并用MitoTrackerH标记₂Xros，转染后24小时。表达EGFP-hFis1的HeLa细胞线粒体染色较弱₂Xros（绿色虚线区域）与未转染细胞（蓝色虚线框）的比较（c，d）。在表达GDAP1的细胞和未转染的细胞之间没有发现差异（比较绿色和蓝色虚线区域）（e，f）。使用ImageJ（NIH）对来自三个独立实验（g；n，细胞数量）的15个独立共焦图像上的代表性共焦图像（a–f）上的观察结果进行量化。棒，（B和C）10μm。

为了排除过度表达导致的潜在定位伪影，我们还检测了内源性GDAP1的细胞内限制。与之前的结果一致，我们发现Neuro2a线粒体的GDAP1染色(Liu等人，1999年)培养中的N1E-115细胞、C2C12细胞（未描绘）和原代雪旺细胞（图S2）。最后，GDAP1和孔蛋白在大鼠DRG切片中共定位（图S2）。

为了进一步支持GDAP1在线粒体中的定位，我们使用了细胞分离方法。通过差速离心法富集线粒体(格雷厄姆，2004年)Western blotting分析各步骤。用转染的Cos-7细胞（未描述）和内源性表达GDAP1的N1E-115细胞进行细胞分离(图2B） ●●●●。正如预期的那样，GDAP1水平通过与孔蛋白（线粒体外膜的一种丰富的跨膜蛋白）平行的这一过程而得到了特异性增强，而与内质网蛋白（如PDI）相反。因此，GDAP1位于线粒体中。

GDAP1是线粒体外膜的完整膜蛋白

为了阐明GDAP1在线粒体内的定位，我们在转染GDAP1表达结构24小时后，从COS-7细胞中纯化线粒体。在存在或不存在洗涤剂的情况下，重悬线粒体并用过量的蛋白酶K消化(Olichon等人，2002年)Western blot分析。蛋白酶孵育后GDAP1信号丢失，而细胞色素c（c）位于膜间隙，只有在增加洋地黄素或十二烷基硫酸钠含量的情况下才能得到保护并消失(图3A） ●●●●。因为分析中使用的抗血清识别NH₂-GDAP1的近端末端（图S1），这些数据表明NH₂GDAP1的末端，以及GST结构域，暴露于细胞质中。为了支持这一解释，我们通过免疫金标记的超微结构分析（未公布的数据）在线粒体外膜中发现了GDAP1。

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图3。

GDAP1是线粒体外膜的跨膜蛋白。（A） 将转染COS-7细胞的粗线粒体提取物用蛋白酶K在洋地黄素浓度增加的情况下消化。在含有过量PMSF的冰上放置30分钟后停止消化，并通过Western blot进行分析。由于缺乏洋地黄素，GDAP1的信号丢失。细胞色素c（c）在线粒体外膜被高浓度的洋地黄素或SDS（底线）渗透之前，对消化物起保护作用。（B） 将转染COS-7细胞的线粒体颗粒重新悬浮在缓冲液（对照）、1 M NaCl、0.1 M碳酸盐（pH 11）或0.1%Triton X-100缓冲液中，并离心分离可溶性蛋白上清液和膜颗粒。GDAP1和已知的跨膜蛋白孔蛋白仅在存在洗涤剂的上清液中发现。

接下来，我们询问GDAP1是否与线粒体膜外周相关，或者它是否如所建议的那样是一种完整的膜蛋白(Marco等人，2004年). 将分离的线粒体重新悬浮在各种缓冲液中，离心后，通过Western blotting分析上清液和膜颗粒(Sogo和Yaffe，1994年;Olichon等人，2002年;Stojanovski等人，2004年) (图3B） ●●●●。用1 M氯化钠或0.1 M碳酸盐缓冲液（pH 11）处理后，GDAP1仍与线粒体颗粒相关。洗涤剂处理将GDAP1释放到上清液中，与完整的膜蛋白孔蛋白相当。这些实验共同证明GDAP1是线粒体外膜的完整膜蛋白。

GDAP1调节线粒体的结构

在各种实验中，我们观察到GDAP1转染后线粒体形态的时间依赖性变化。随着GDAP1的长时间表达，COS-7细胞中的线粒体变得更加碎片化，管状结构不那么突出(图4A、 c和d）。这种效应在模拟转染细胞中没有发现(图4A、 A）。我们推断，线粒体外膜任何蛋白质的过度表达都可能导致这种效应。然而，GFP标记的人外膜亚单位7转运体（EGFP-hTOM7）瞬时表达后，线粒体形态没有明显改变，这与先前的结果一致(Stojanovski等人，2004年) (图4A、 b）。这表明GDAP1在我们的实验设置中具有特定的效果。因此，我们量化了GDAP1过度表达引起的形态学改变。为此，我们定义了细胞内五种不同的线粒体结构（例如，见图4A、 e，底部面板）：核周聚集（“聚集”），主要是管状（“管状”）、管状和囊泡状（“混合”），以囊泡状为主，但具有一些管状结构（“囊泡状”），以及完全囊泡状或碎片状线粒体（“碎片状”）。该分析表明，与对照细胞相比，GDAP1转染15小时后，支离破碎的线粒体显著增加，而线粒体的管状结构和混合结构被破坏(图4A、 e）。正如我们之前的印象所怀疑的那样，这种向线粒体碎片的转变在转染后20小时更为明显。

GDAP1诱导的片段化与线粒体整体生理缺陷无关

细胞凋亡刺激可导致线粒体碎片化(Lee等人，2004年). 因此，我们测试了GDAP1过度表达是否会诱导细胞凋亡。对瞬时转染HeLa、Neuro2a或COS-7细胞的初步定性观察表明，没有大规模诱导凋亡。为了更准确地分析这个问题，我们用GDAP1或EGFP-hFis1转染HeLa细胞，这是一种已知可以诱导线粒体分裂和凋亡的蛋白质(James等人，2003年); 36h后固定细胞；细胞色素染色c（c）和GDAP1。正如预期的那样，EGFP-hFis1促进了细胞色素的释放c（c）（注意，弥漫细胞色素c染色仅在转染细胞中，图4B、 d），而在表达GDAP1的细胞中，细胞色素c（c）仅限于线粒体(图4B、 a和B）。

线粒体跨膜电位（ΔΨm）的丧失也会触发线粒体的断裂(Legros等人，2002年). 因此，我们询问GDAP1过表达诱导的片段化是否是对ΔΨm影响的次要因素。染料MitoTrackerH的吸收₂XRos进入线粒体依赖于线粒体活性(Chen和Cushion，1994年)，这为测试这种可能性提供了一种方法(图4C、 a和b）。用少量EGFP-hFis1表达构建的瞬时转染作为阳性对照(Yoon，2004年). 与未转染的HeLa细胞相比，GDAP1表达细胞的染料摄取没有变化，而EGFP-hFis1阳性HeLa电池的染料摄取减少到70%。此外，我们生成了稳定转染的Neuro2a细胞，可诱导过度表达GDAP1。5,5′，6,6′-四氯-1,1′，3,3′-四乙基苯并咪唑碳菁碘在流式细胞术中的应用(Cossarizza等人，1993年)，我们证实GDAP1的过度表达不会诱导这些细胞的凋亡或影响ΔΨm（未发表的数据）。

GDAP1诱导的线粒体断裂被动力相关蛋白1（K38A）共表达阻断，并被线粒体融合蛋白1和2抵消

线粒体的形状取决于融合和分裂的平衡。因此，我们测试了GDAP1对碎片的诱导是否可以被已知的诱导融合或阻断裂变的蛋白质抵消。动力相关蛋白1（Drp1）在线粒体分裂中起核心作用；显性负Drp1（K38A）形式阻断线粒体分裂(Smirnova等人，1998年). 我们在COS-7细胞中共表达了GDAP1和Drp1或Drp1（K38A），并分析了转染17 h后表达这两种蛋白的细胞的线粒体形态。Western blotting证实了转染构建物的可比表达水平（未发表的数据）。GDAP1和Drp1的共表达对GDAP1诱导的线粒体断裂没有显著影响(图5A、 A–f）。这一结果是意料之中的，因为Drp1的过度表达本身并不会改变线粒体结构；细胞内有丰富的内源性Drp1(Yoon，2004年). 相反，如果与GDAP1共表达，Drp1（K38A）部分抑制线粒体的断裂(图5A、 g–i）。与EGFP-hTOM7对照转染细胞相比，GDAP1-Drp1（K38A）双表达细胞的数量增加，线粒体仍然破碎；然而，与仅表达GDAP1的细胞相比，该数量显著减少(图5A、 j）。此外，与对照组相比，更多的细胞表现出延伸的管状线粒体形态，这是当Drp1（K38A）单独表达时观察到的最显著的表型（85%；未发表的数据）。总之，Drp1（K38A）的共表达可以部分阻断GDAP1诱导的片段化，但不能完全恢复正常模式。

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图5。

GDAP1诱导的碎片被融合促进因子的活性抵消。（A） COS-7细胞与0.25μg GDAP1表达载体和0.25μg/空载体（A–c）、编码Drp1（d–f）或显性阴性Drp1的载体（K38A）（g–i）共同转染。转染后17 h，用MitoTracker Red对细胞进行复染。用抗GDAP1和抗myc抗体对固定细胞进行检测。（B） 与Drp1（K38A）的裂变阻滞方法类似，GDAP1与融合诱导型Mfn1（a）或Mfn2（c），或活性缺陷突变体Mfn 1（K88T）或Mf 2（K109A）（B，d）共同转染。显示了来自三个独立实验的典型共焦图像（0.3-μm截面）。对结果进行量化（A，j和B，e），以显示表达这两种蛋白质并属于不同线粒体分类的转染细胞的百分比(n个>每个条件500个单元格）。棒材，10μm。

线粒体融合和线粒体形态的维持需要线粒体融合蛋白（Mfn）1和2(Chen等人，2003年;Rojo等人，2002年;桑特尔和富勒，2001年;Santel等人，2003年);. 我们发现GDAP1和Mfn1或Mfn2的共同表达导致了平衡的线粒体结构，与未转染或EGFP-hTOM7对照转染细胞中观察到的形态学相似(图5B、 a和c；与…相比图4A、 A和b）。定量分析证实GDAP1与Mfn1或Mfn2共表达可挽救GDAP1诱导的线粒体断裂(图5B、 e）。这种效应是特定的，并且取决于Mfn的活性，因为Mfn1和Mfn2的改变形式携带GTPase G1动机的突变（Mfn1[K88T]和Mfn 2[K109A]）(Chen等人，2003年)，无法阻止GDAP1诱导的碎裂(图5B、 B、d、e）。我们得出结论，GDAP1和Mfn可以抵消它们对结构线粒体动力学的相反影响。

GDAP1不降低线粒体融合

我们以前的实验表明，GDAP1的过度表达促进线粒体断裂。这种线粒体形态可能是由于线粒体分裂增加、线粒体融合减少或两者兼而有之。利用基于聚乙二醇（PEG）的细胞融合技术，我们检测了GDAP1对线粒体融合的影响(Mattenberger等人，2003年). 瞬时转染线粒体靶向DsRed（mtDs Red）的HeLa细胞与瞬时转染了线粒体靶向GFP（mtGFP；参见图7，a–c）或GDAP1（参见图7，d–f）。将细胞与PEG融合并在环己酰亚胺存在下培养。如前所述，我们在细胞融合后3-4小时，在转染mtDsRed的细胞与转染mtGFP的细胞的杂交细胞中发现线粒体融合。这一过程在细胞融合6小时后几乎完成(图6，a–c，g；Mattenberger等人，2003年). 在转染mtDsRed的细胞与转染GDAP1的细胞融合的细胞杂交体中观察到线粒体融合的时间和程度相同(图6，d–g）。因此，GDAP1过度表达不会显著干扰线粒体融合，表明GDAP1是一种裂变诱导因子。

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图6。

GDAP1的表达不会阻断线粒体融合。瞬时转染mtDsRed的HeLa细胞与瞬时转染了mtGFP（a–c）或GDAP1（d–f）的HeLa细胞共染。将细胞与PEG融合，并在环己酰亚胺存在下培养。PEG融合后3-6小时，对细胞杂种进行线粒体标记融合分析。无线粒体融合（a，d）、部分线粒体融合（b，e）和完全线粒体融合（c，f）的细胞杂种在单平面共焦照片中进行了描述。从三个独立的实验中计算细胞杂种(n个>每个时间点120辆混合车）。在所示的时间点，线粒体融合程度不同的杂种的百分比显示为（g）。棒材，10μm。

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图7。

GDAP1基因敲除导致线粒体伸长。用抗GDAP1的双链小干扰RNA转染神经母细胞瘤N1E-115细胞，加上打乱的对照，或保持未转染状态。（A，A）分离等量的细胞裂解物，并对GDAP1和β-肌动蛋白进行免疫印迹，作为负荷对照。（b） GDAP1的相对表达水平与β-肌动蛋白水平相关，表示为三个独立转染的平均值。（B） 在盲法实验中通过计数来量化GDAP1敲除对线粒体结构的影响。每个条件下至少有750个细胞是从三个独立的实验中统计出来的。GDAP1特异性小干扰RNA转染导致管状线粒体显著增加（概率>卡方>0.0001），而对照转染没有改变线粒体结构（概率>卡方<0.5）。

GDAP1敲除导致线粒体拉长

为了证实GDAP1调节线粒体形态，我们对内源性表达GDAP1的N1E-115神经母细胞瘤细胞进行了RNA干扰（RNAi）敲除实验。我们能够将GDAP1表达水平降低60%(图7A、 A和b）。免疫细胞化学在单细胞水平上无法可靠地确定这种减少。因此，我们在盲法实验中统计了每个条件下至少750个随机选择的细胞。与未转染或对照转染细胞相比，转染GDAP1特异性RNAi导致具有管状线粒体形态的细胞数量增加(图7B） ；这进一步证实了GDAP1促进线粒体分裂的结论。

疾病相关的截短GDAP1蛋白无法到达线粒体

接下来，我们询问在CMT患者中发现的GDAP1突变是否失去了线粒体靶向性和/或诱导线粒体分裂的能力。为了回答这个问题，我们生成了一组GDAP1表达结构，代表三种不同的终止突变和五种不同的点突变(图9)之前在CMT患者中发现的(Baxter等人，2002年;Cuesta等人，2002年;Nelis等人，2002年;Ammar等人，2003年;Azzedine等人，2003年;Boerkoel等人，2003年;Senderek等人，2003年;Di Maria等人，2004年). 转染COS-7细胞的分析表明，截短蛋白GDAP1 T288fs290X和GDAP1 S194X不能有效靶向线粒体，而是在整个细胞中广泛定位(图8A、 A–f）。这些突变体没有线粒体断裂诱导活性(图8A、 b、e、h）。转染后，我们的抗血清无法检测到最短结构的产物GDAP1（Q163X），尽管序列中存在表位（见图S1；图8A、 g）。我们支持GDAP1（Q163X）突变产生高度不稳定蛋白的解释，这表明相应的疾病等位基因表现为无突变。

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图8。

GDAP1的COOH末端携带线粒体靶向信号。（A） 固定前用MitoTracker Red对瞬时转染的COS-7细胞进行复染；随后进行GDAP1抗体染色。移码突变GDAP1（T288fs290X）（a–c）和终止突变GDAPl（S194X）（d–f）失去了线粒体靶向性。测试的最短截断GDAP1（Q163X）无法检测到（g–i）。（B） EGFP与NH融合₂GDAP1全长蛋白（a–c）的末端，或GDAP1编码疏水结构域（HD）（d–f）的COOH末端部分，用于第一个疏水结构区（g–i）或第二个疏水结构域仅（j–l）。在线粒体（m-o）中没有明显发现单独的EGFP。所有图像均表示单个0.3微米截面。所有钢筋，10μm。（C） 调节线粒体形态的已知哺乳动物尾部锚定蛋白的示意图。所有蛋白质都会暴露NH₂具有预测的细胞溶质催化结构域的末端（粉色框，GTPase结构域；红色框，GST-N；蓝色框，GST-C）。疏水域为黄色。对于GDAP1，疏水结构域1和COOH末端的精确定位仍未解决（虚线框）。IM，内膜；OM，外膜。

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图9。

疾病相关的GDAP1点突变在裂变活动中受损。（A） GDAP1蛋白与已知CMT相关点突变的示意图显示。检查的突变以粗体显示。（B） 转染的COS-7细胞在固定前用MitoTracker Red进行复染，并用GDAP1抗体进行染色。所有测试的点突变与线粒体共定位。显示了GDAP1（R120Q）（a–d）和GDAP 1（R310Q）（e–h）的典型共焦图片。棒材，单位：c，g，10μm；棒材，单位：d、h、2μm。（C，a）对所有点突变的线粒体结构的影响进行了量化。我们统计了每个点突变至少500个细胞，这些点突变表达GDAP1或测试的一个点突变。这些细胞被分为五类线粒体。所有变化都非常显著（概率>卡方>0.001，在权变分析中将所有条件与GDAP1[野生型]转染细胞进行比较）。在转染的COS-7细胞中，测试的GDAP1点突变的表达水平与GDAP1野生型蛋白相当（量化为姐妹板的细胞裂解物中抗GDAP1/抗β-肌动蛋白信号的比率[b]）。

GDAP1的COOH末端跨膜结构域包含线粒体靶向信息

计算机分析显示，GDAP1不携带典型的线粒体靶向信号（未公布的数据）。由于GDAP1截短的T288fsX290明显丢失了线粒体靶向信息，因此被删除的68个COOH末端氨基酸很可能含有这种信号。为了更详细地评估这个问题，我们生成了GDAP1部分与EGFP的COOH末端相连的融合蛋白。与MitoTracker共定位的全长EGFP-GDAP1融合蛋白证明，EGFP标签可以在转染COS-7细胞中有效地靶向线粒体(图8B、 a–c）。正如预期的那样，GDAP1（EGFP-GDAP1）的最后78个氨基酸_280–358)足以进行线粒体定位(图8B、 d–f），并确认信号靠近COOH终端。我们进一步的实验策略是基于这样的知识，即带有COOH末端疏水结构域的线粒体蛋白质被碱性氨基酸包围，靶向线粒体外膜(Kutay等人，1993年). Mfn2属于这类蛋白质，称为“尾锚定蛋白质”。对于Mfn1，正确的靶向性需要两个由基本氨基酸包围的跨膜结构域和卷曲结构域(Rojo等人，2002年). 对于GDAP1来说，情况似乎是相关的，但有所不同。一种EGFP融合蛋白，具有第一个疏水结构域，包括其侧翼区域（EGFP-GDAP1_280–316)，不针对线粒体(图8B、 g–i）。然而，第二个疏水结构域和侧翼区域足以指导EGFP融合蛋白（EGFP-GDAP1_308–358)线粒体(图8B、 j–l）。值得注意的是，融合蛋白特别高表达的细胞表现出额外的核周染色(图8B、 f和l），这可能是过度表达的产物。

构件

用RT-PCR从成年小鼠脑组织中扩增出GDAP1 cDNA，引物为5′-CGTACCATGGCTCGGAGGCAGGAC-3′，5′-CGCTCGACTAGAAAATATTGTCTGG-3′。利用5′-CGATCACATGGCGACCCCACAC-3′和5′-CCCACACAGCTCTAGTGT-3′克隆GDAP1-like-1 cDNA。用合适的引物对通过PCR产生点突变和截断。将所有cDNA克隆到pGEM-T载体中，并通过测序进行验证。cDNA亚克隆到pcDNA3.1（Invitrogen）或EGFP-C1（CLONTECH Laboratories，Inc.）。或者，EGFP的编码区被HA表位取代（HA-C1载体，由瑞士苏黎世瑞士联邦理工学院A.Hirschy提供）。M.Ryan（澳大利亚墨尔本拉筹伯大学）提供了EGFP-hTOM7和EGFP-hFis1表达结构。Mfn1-10xMyc、Mfn1（K88T）-10xMyc、Mpn2-16xMyc和Mfn2（K109A）-16xMyc，Drp1-6xMych和Drp（K38A）6xMyc由D.Chan（加利福尼亚州帕萨迪纳加利福尼亚理工学院）提供。MtDsRed2和mtGFP来自CLONTECH Laboratories，Inc。

细胞培养

大鼠雪旺细胞的制备基本上如下所述：Brockes等人（1979年）细胞生长在含有10%FCS、4μg/ml胶质生长因子（粗垂体提取物（Sigma-Aldrich）和4μM forskolin（Sigma-Aldrich）的雪旺细胞培养基（DME；Invitrogen）中。为了阻止生长，细胞在低血清培养基（DME/F12培养基（Invitrogen）、0.5%FCS、4μM forskolin、100μg/ml人载脂蛋白、60 ng/ml孕酮、16μg/ml腐胺、10μg/ml胰岛素、400 ng/ml L-甲状腺素、160 ng/ml硒、0.02 ng/ml三碘甲状腺原氨酸和300μg/ml BSA（Fluka）中培养3天。除非另有说明，补充剂均来自Sigma-Aldrich。将COS-7细胞、HeLa细胞和N1E-115细胞保存在含有10%FCS、100单位/ml青霉素和100μg/ml链霉素（Invitrogen）的DME中。根据制造商（罗氏）的建议，使用Fugene 6转染COS-7和HeLa细胞。用1.7μg/ml脂质体2000（Invitrogen）和55 nM隐形RNAi（Invit罗gen；GDAP1特异性：GGCCA CUCAG AUCAU UGAUU AUCUU；对照：GGCAC UCCUA GGUUA AUUAU ACCUU）对N1E-115细胞进行RNAi转染。细胞在转染开始后48小时固定或收获。

细胞分离

采用差速离心法富集线粒体格雷厄姆（2004）.蛋白酶消化按别处所述进行(Olichon等人，2002年). 随着洋地黄素或SDS浓度的增加，将蛋白酶K（50μg/ml）添加到细胞分级缓冲液中。在冰上放置30分钟后，用0.2 mM PMSF停止消化。为了测试GDAP1的膜整合，将差速离心程序中的第一个线粒体颗粒分离，并用涡流混合器在四种不同的缓冲液中全速再悬浮30 s：含有0.25 M蔗糖的均质缓冲液（对照）、对照缓冲液加上1 M氯化钠（1 M NaCl）、，控制缓冲液加0.1%Triton X-100，或在0.1 M碳酸钠（pH 11.0）（碳酸盐）中。样品在8000℃下再次离心20分钟克，4摄氏度。用Western blot分析等体积的上清液和颗粒(Olichon等人，2002年;Stojanovski等人，2004年).

细胞融合

对于细胞融合，HeLa细胞瞬时转染mtDsRed、mtGFP或GDAP1。转染开始后8小时，将细胞在盖玻片上进行共培养并过夜。第二天早上，将环己酰亚胺添加到培养基（1 mM）中。30分钟后，将细胞融合在预加热的50%w/v PEG 6000（Sigma-Aldrich）滴在PBS/葡萄糖（1 g/l）中2分钟。用PBS/糖强烈清洗细胞，并保存在培养基和环己酰亚胺中。

抗体

Pineda产生了多克隆兔抗GDAP1抗血清。使用两种不同的肽作为抗原（肽1:MARRQDEARAGVPL；肽2:FLDERTPRLMPDEGS）。抗血清以1:7500稀释度用于Western blotting，以1:1000稀释度用于免疫荧光。除非另有说明，否则使用抗肽1（血清1）和肽2（血清2）的血清，并得出相同的结果。对于石蜡切片的免疫组织化学，我们使用血清1，该血清用蒙太奇抗体纯化试剂盒（Millipore）纯化。抗β肌动蛋白（克隆AC-74）、神经丝160（克隆NN18）和S-100β亚基（克隆SH-B1）的单克隆小鼠抗体来自Sigma-Aldrich。单克隆抗细胞色素c（c）抗体（克隆7H8.2C12和克隆6H2.B4）和多克隆兔抗caspase3抗体来自BD Biosciences。单克隆大鼠抗HA（克隆3F10）购自罗氏公司。多克隆兔抗PDI抗血清由A.Helenius博士（瑞士联邦理工学院，瑞士苏黎世）提供。

免疫组织化学

在室温下用2.5%的PFA/PBS将细胞固定30分钟。用3.7%福尔马林将组织固定过夜，脱水，并将其嵌入石蜡中的组织处理器TP1010（徕卡）中。使用旋转缩微仪HM 330（微米）制备6-μm切片。对于免疫组织化学，固定细胞和复水切片用0.1%Triton X-100/PBS孵育10分钟。用PBS洗涤后，在室温下用10%山羊血清在PBS中孵育1小时，然后在室温下与10%山羊血清/PBS中的一级抗体孵育90分钟或在4°C下过夜。清洗后，将样品暴露于适当的二级抗体中。Cy3-和Cy5-结合抗体来自Jackson实验室，二级抗体带有分子探针中的Alexa-dyes。样品用DAPI（罗氏）培养并安装在Immu-Mount（ThermoShandon）中。使用蔡司Axiophot显微镜（Carl Zeiss Microimaging，Inc.）对样本进行分析。或者，我们在倒置显微镜DM IRB/E上使用共焦显微镜，该倒置显微镜配有真正的共焦扫描仪TCS SP1、PL APO 63×/1.32浸油物镜（徕卡）以及氩、氦-氖激光器。图像处理是在Silicon Graphics工作站上使用Imaris（Bitplane AG）完成的。按照制造商的建议，我们使用MitoTracker Red（分子探针）标记线粒体。MitoTracker红CM-H₂将最终浓度为0.5μM的XRos添加到培养基中30分钟。在此脉冲后，细胞在无染料的生长培养基中培养10分钟，然后固定。测定MitoTrackerH的相对摄取量₂XRos导入转染细胞后，我们分析了单平面共焦图像。使用ImageJ，我们测量了MitoTrackerH的相对荧光（RF）强度₂XRo和区域。我们在同一张图片上测定了转染细胞和未转染细胞的RF/面积。对于每张图片，转染细胞的RF/面积被未转染细胞RF/面积分割。几张图片的平均值和标准差(n个≥6）使用双尾非配对t吨测试。

蛋白质印迹

SDS-PAGE后，将蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜（Millipore）上。用10%脱脂奶粉在TBS中封闭斑点。根据制造商的建议或如上所述稀释初级抗体。用0.05%吐温20/TBS洗涤印迹。二级抗体来自Santa Cruz Biotechnology，Inc.、DakoCytomation和Southern Biotechnology Associates，Inc.。免疫反应带通过Western Lightning（PerkinElmer）或CDP Star（Roche）观察。

我们非常感谢A.Hirschy博士、M.Wegner博士（德国埃朗根纽伦堡大学）、M.Ryan博士、D.Chan博士和A.Helenius博士赠送的试剂，并感谢S.Atanasoski博士对Western blot分析的支持。

这项工作得到了瑞士国家科学基金会和美国国家“神经可塑性和修复”研究能力中心以及A.Schenne的FIRB-RBAU01KJE4_002的支持。