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细胞生物学杂志。2005年7月18日；170（2）：295–304。
数字对象标识：10.1083/jcb.200409117
预防性维修识别码：PMC2171419型
PMID：16009721
第条

JNK通过磷酸化14-3-3拮抗Akt介导的生存信号

Jun Sunayama先生,Fuminori Tsuruta公司,Masuyama Norihisa、和后藤由纪子
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

生命和死亡的决定是通过整合哺乳动物细胞中的各种凋亡和存活信号来实现的。因此，很可能存在一种通用机制，将多种信号集成在备选方案之间进行裁决。在本研究中，我们建议14-3-3代表这样一个积分点。一些促凋亡蛋白通常在通过Akt等生存介导激酶磷酸化后与14-3-3相关。我们之前报道过细胞应激诱导c-Jun NH2-末端激酶（JNK）介导的Ser184的14-3-3ζ磷酸化（Tsuruta，F.、J.Sunayama、Y.Mori、S.Hattori、S.Shimizu、Y.Tsujimoto、K.Yoshioka、N.Masuyama和Y.Gotoh，2004）。欧洲工商管理局J型. 23:1889–1899). 这里，我们表明JNK对14-3-3的磷酸化从14-3-3释放促凋亡蛋白Bad和FOXO3a，并拮抗Akt信号的作用。作为解离的结果，Bad被去磷酸化并转移到线粒体，在那里它与Bcl-2/Bcl-x结合L（左）由于Bad和FOXO3a与其他促凋亡蛋白共享14-3-3结合基序，我们认为这种由JNK介导的14-3-3磷酸化协同调节这些促凋亡蛋白，使细胞更容易受到凋亡信号的影响。

介绍

促进存活和凋亡的信号之间的平衡对于决定细胞命运至关重要。生存信号提高了凋亡信号可以诱导细胞死亡机制的阈值，因此，生存信号的减少导致细胞对凋亡信号的高度敏感性。因此，理解细胞死亡调控的关键是揭示存活和凋亡信号整合的分子机制。

14-3-3蛋白是磷酸化-Ser/磷酸化-Thr结合分子家族，在许多生物过程中发挥重要作用，包括调节细胞死亡(van Hemert等人，2001年;Masters等人，2002年;亚菲，2002). 14-3-3在通过Akt等生存诱导激酶磷酸化后，通过隔离和灭活包括Bad和FOXO3a在内的几种促凋亡蛋白来促进细胞存活(查等，1996;Datta等人，1997年;del Peso等人，1997年;比格斯等人，1999年;Brunet等人，1999年;Kops等人，1999年;Zhang等人，1999年;Masuyama等人，2001年;Masters等人，2002年;Basu等人，2003年). 事实上，可用14-3-3的减少使细胞对凋亡信号敏感，14-3-3过度表达使细胞对细胞凋亡信号产生抵抗(Chan等人，1999年;Zhang等人，1999年;Xing等人，2000年;大师与傅，2001;Samuel等人，2001年;野村等，2003年;Tsuruta等人，2004年). 因此，可用14-3-3的水平对于确定凋亡信号启动程序的阈值至关重要。

14-3-3似乎受到磷酸化的调节。脑组织中大量存在分别位于Ser186和184的14-3-3β和ζ的磷酸化形式(Aitken等人，1995年). 我们发现c-Jun NH在其各自的磷酸化位点磷酸化了14-3-3ζ和σ亚型2-末端激酶（JNK；Tsuruta等人，2004年). 这一发现促使我们研究14-3-3的磷酸化是否对细胞死亡的调节有任何影响，因为JNK被认为在应激诱导的细胞凋亡中起着关键作用，这与环境相关(Yang等人，1997年;Tournier等人，2000年;Lei等人，2002年;邓等人，2003;Kuan等人，2003年). 值得注意的是，14-3-3ζ的磷酸化导致Bax从14-3-3中分离出来，导致Bax移位到线粒体并导致细胞凋亡(Tsuruta等人，2004年). 缺乏磷酸化位点的突变体的表达（14-3-3ζ的Ser184A或14-3-3σ的Ser186A）有效地减弱了由应激激活的JNK诱导的细胞死亡，表明14-3-3是JNK在诱导细胞死亡中的主要靶点。然而，Bax不是典型的14-3-3配体，因为这种结合不需要常见的配体结合沟，也不依赖配体（Bax）磷酸化(野村等，2003年). 因此，尚不清楚14-3-3的磷酸化是否也影响“典型”14-3-3配体的结合，这些配体通常包含14-3-3结合基序RSXpSXP或RXXXpSXP(Muslin等人，1996年;Yaffe等人，1997年). 由于Ser184位于配体结合沟附近，该残基的磷酸化可能调节许多典型14-3-3配体的结合，包括上述促凋亡蛋白。为了研究JNK介导的14-3-3磷酸化可能通过除Bax外调节典型14-3-3配体而导致细胞死亡的假设，我们检测了14-3-3磷酸化对Bad结合的影响，Bad结合在Bad磷酸化的14-3-3-常见配体结合沟上。

Bad是Bcl-2家族的“仅BH3”成员(Danial和Korsmeyer，2004年). 生存因子通过Ser112、136和155的磷酸化抑制Bad的促凋亡功能(查等，1996;Datta等人，2000年;Lizzano等人，2000年;Zhou等人，2000年). Ser112和136的磷酸化产生14-3-3-结合基序RHSpS112YP和RSRpS136AP，以及随后与14-3-3的相互作用导致Bad的细胞质螯合和失活。Akt、Pak-1和p70S6激酶似乎介导生存因子诱导的Bad在Ser136的磷酸化，而Rsk、线粒体相关蛋白激酶A、Pak-1和-5以及Pim-1负责Ser112的磷酸化(Datta等人，1997年;del Peso等人，1997年;Blume-Jensen等人，1998年;Bonni等人，1999年;Harada等人，1999年,2001;Tan等人，1999年;Schurmann等人，2000年;Shimamura等人，2000年;Cotteret等人，2003年;Aho等人，2004年). Bad的去磷酸化形式以线粒体为靶点，通过结合和灭活Bcl-2/Bcl-x而导致细胞凋亡L（左）(Wang等人，1999年). 因此，生存因子通过调节Bad磷酸化来调节Bad和14-3-3之间的相互作用。然而，Bad和14-3-3之间的相互作用是否也受14-3-3的磷酸化状态调节，尚待确定。因为Bad和JNK都与应激诱导的细胞死亡有关(Yang等人，1997年;Tournier等人，2000年;Datta等人，2002年;Lei等人，2002年;邓等人，2003;Kuan等人，2003年)，我们将Bad作为JNK介导的凋亡信号的潜在靶点。

结果

JNK促进Bad在体内从14-3-3蛋白中分离

14-3-3β和σ的Ser186（对应14-3-3ζ的Ser184）是位于NH的表面残留物2螺旋线8的末端靠近配体结合槽的顶部(图1a；Liu等人，1995年;肖等人，1995年). 我们检测了该位点的磷酸化是否会影响Bad的结合，Bad是一种典型的14-3-3配体。我们首先研究了JNK的激活是否影响14-3-3和Bad之间的相互作用。当内源性Bad从COS-1细胞裂解物中免疫沉淀时，内源性14-3-3被共沉淀(图1b） ●●●●。然而，当用蛋白质合成抑制剂樟柳霉素处理COS-1细胞时，与Bad共沉淀的14-3-3的量显著减少(图1b） ●●●●。Bad与14-3-3的共沉淀也通过HCT116细胞的紫外线照射而减少(图1c） 。我们在这些实验中选择了茴香霉素和紫外线处理，因为已知这些细胞应激可以有效激活JNK，并且需要JNK激活才能诱导小鼠胚胎成纤维细胞的细胞死亡(Tournier等人，2000年)和HCT116电池（参见图5、a和b）。接下来，我们研究了这种细胞应激诱导的14-3-3和Bad之间的分离是否由内源性JNK的激活介导。显性阴性（DN）JNK或JNK抑制肽的表达（称为JNK结合域[JBD]；狄更斯等人，1997年)消除了樟柳霉素或紫外线处理诱导14-3-3和Bad之间解离的能力，证明了JNK在这一事件中的先决条件作用(图1、b和c). 茴香霉素处理COS-1细胞或紫外线照射HCT116细胞导致JNK底物c-Jun磷酸化，DN-JNK或JBD的表达阻断了这些作用(图1d） ●●●●。然后我们询问活性JNK的表达是否足以诱导14-3-3和Bad之间的分离。组成活性（CA）形式的JNK（MKK7-JNK野生型[WT]）的表达，而不是激酶阴性（KN）JNK的表达（MKK-7-JNK[KN]），导致与Bad共沉淀的14-3-3数量减少(图1e） ●●●●。虽然JNK诱导caspase级联激活(Lei等人，2002年;Tsuruta等人，2004年)，MKK7-JNK（WT）的这种作用不受p35共表达的影响，p35是一种泛酶抑制剂，这表明JNK促进Bad从14-3-3中分离，与半胱氨酸蛋白酶激活无关(图1e） ●●●●。

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JNK促进体内Bad与14-3-3的分离。（a） 14-3-3ζ的假定JNK磷酸化位点与配体结合沟相邻，用红色表示。右侧面板是假定磷酸化位点（Ser184）周围区域（白框，左侧）的特写视图，用黄色表示。（b） 用所示质粒转染COS-1细胞，并在没有或存在10μg/ml茴香霉素的情况下培养3 h。用Bad或正常兔IgG（NRI）抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀（IP）。（c） 用所示质粒转染HCT116细胞，并用50 J/m的剂量照射2紫外线照射6 h。用14-3-3σ抗体或正常山羊IgG（NGI）抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀。（d） 按照b和c所述转染细胞并培养细胞。细胞裂解物用所示抗体进行免疫印迹分析。（e） 如图所示，用MKK7-JNK和p35表达载体转染COS-1细胞18小时。用Bad抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀。（b–e）用所示抗体对所得沉淀物进行免疫印迹分析（IB）。在三个独立的实验中获得了相同的结果。

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JNK介导的14-3-3磷酸化调节Bad依赖性细胞死亡。将所示质粒与GFP表达质粒一起转染HCT116细胞12 h，并用50 J/m照射2紫外线照射6小时（a–d）或3小时（e）。细胞用Hoechst 33342染色10分钟（a、c和e）。测定核固缩的GFP阳性细胞百分比。数据显示了三个独立实验中从150-200个细胞的三个字段中获得的值的平均值±SD。（a和c）*，P<0.01；（e） *，P<0.05。每个样品至少分析750个细胞（a）、600个细胞（c）和500个细胞（d）。（b和d）用指示的抗体对细胞裂解物进行免疫印迹分析（IB）。p19和p17片段代表裂解（和激活）的caspase-3。SA，Ser186A。

JNK介导的14-3-3磷酸化导致体外14-3-3释放Bad

接下来，我们询问JNK诱导Bad从14-3-3中分离是否依赖于体外重组试验中14-3-3的磷酸化状态。我们进行了GST下拉实验，以检测重组GST-tagged 14-3-3ζ和His-tagged Bad蛋白之间的关联(图2). Bad仅在Ser112和/或136磷酸化时与14-3-3蛋白相互作用(Zha等人，1996年). 为了磷酸化Ser136处的Bad，我们将重组Bad与COS-1细胞免疫沉淀的CA-Akt预孵育。我们证实，Bad与GST–14-3-3ζ共沉淀，但不单独与GST共沉淀，仅当其与CA-Akt在ATP存在下预孵育时(图2a） ●●●●。然后，在用Akt-phosphoriated Bad进行GST下拉实验之前，我们通过MKK7-JNK（WT）对GST-14-3-3ζ进行磷酸化，发现14-3-3ξ的磷酸化减少了与GST-143-3ζ共沉淀的Bad量。相反，当使用GST–14-3-3ζ的Ser184A突变体时，无论是否使用MKK7-JNK（WT）预培养，都会沉淀出类似数量的Bad。这些结果表明，JNK在Ser184的14-3-3ζ磷酸化降低了其对Bad的亲和力(图2a） ●●●●。

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JNK介导的14-3-3磷酸化导致体外14-3-3释放Bad。（a和b）GST标记的蛋白用His标记的MKK7-JNK进行体外激酶分析，并与预先孵育有或没有CA-Akt免疫复合物的His标记Bad野生型（WT；a）或Ser128A（b）孵育。使用谷胱甘肽-Sepharose珠沉淀GST蛋白。与GST或GST–14-3-3ζ共沉淀的Bad蛋白量通过免疫印迹分析（IB）和所示抗体测定。至少在两个独立的实验中获得了相同的结果。

最近的研究表明，初级小脑颗粒神经元中JNK和Cdc2磷酸化Bad的Ser128，Bad的磷酸化抑制Bad与14-3-3的相互作用(Donovan等人，2002年;Konishi等人，2002年). 此外，JNK在Thr201磷酸化小鼠Bad，尽管该位点在人类Bad中不保守(Yu等人，2004年). 因此，我们研究了无论Bad在Ser128或Thr201处的磷酸化状态如何，Ser184处14-3-3ζ的磷酸化是否会导致Bad与14-3-3的分离。我们发现，当活性Akt磷酸化14-3-3ζ时，任何重组突变Bads（Bad Ser128A、Thr201A或Ser128A-Thr201A）都可以与14-3-3ξ相互作用，当MK7-JNK（WT；图2b和图S1，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200409117.DC1). 因此，JNK介导的14-3-3磷酸化可以独立于Bad的Ser128和Thr201磷酸化诱导Bad的分离。

JNK促进线粒体不良易位

Bad主要定位在细胞质中，但在生存因子缺乏时重新分布到线粒体(Li等人，2004年). 因为14-3-3被认为是Bad的细胞质锚定(《穆斯林与兴》，2000年)我们发现，JNK介导的14-3-3磷酸化从14-3-3释放Bad，我们假设JNK可能调节Bad的定位。为了研究这一点，我们使用Myc-tagged Bad（Myc-Bad）。在所有与Myc-Bad的实验中，p35被联合转染以防止Myc-Ba德过度表达诱导的caspase活性。免疫细胞化学分析显示，在健康细胞中，大部分Myc-Bad定位于细胞质，而小部分与MitoTracker CMXRos共定位(图3a） ●●●●。我们发现MKK7-JNK（WT）的表达，而不是MKK7-JNK（KN）的表达，导致Myc-Bad易位到线粒体。为了证实JNK促进Bad易位的作用，我们用MKK7-JNK构建体转染COS-1细胞后，通过亚细胞分级检测了内源性Bad的分布(图3b） ●●●●。在线粒体部分中检测到的内源性Bad的量通过MKK7-JNK（WT）的表达而增加。相反，MKK7-JNK（KN）的表达没有这些影响。在这个实验中，线粒体标记F的丰度1F类0-这些组分中的ATP酶亚基α和细胞溶质标记物α-微管蛋白亚基不受任何结构表达的影响。虽然MKK7-JNK（WT）导致caspase-3的激活(Lei等人，2002年;Tsuruta等人，2004年)，p35的共表达未能抑制Bad向线粒体部分的易位，这表明MKK7-JNK（WT）促进内源性Bad向线粒体的易位，而不依赖于胱天蛋白酶的激活。

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活性JNK促进Bad转运至线粒体。（a） 如图所示，用Myc-Bad和p35表达载体以及MKK7-JNK表达载体转染COS-1细胞18小时。通过荧光显微镜检查它们的Myc-Bad（抗Myc染色，绿色）和线粒体（CMXRos，红色）分布；每个代表性单元格的两个单独图像被叠加（叠加）显示。（b） 如图所示，在没有或存在p35载体的情况下，用GFP和MKK7-JNK表达载体转染COS-1细胞18小时。通过监测GFP的表达，转染效率为～75%。（c） 用表达载体转染HCT116细胞以获得指示质粒，并用50 J/m的剂量照射2紫外线照射6 h。（d）用GFP、MKK7-JNK（WT）和14-3-3ζ（WT）或Ser184A表达载体转染COS-1细胞18 h。（b–d）然后，对细胞进行亚细胞分离，并使用Bad抗体通过免疫印迹分析（IB）评估线粒体和细胞溶质部分中内源性Bad的数量。线粒体标记F1F类0-ATP酶和细胞溶质标志物α-微管蛋白用作内标物。在三个独立的实验中获得了相同的结果。

我们还确定了紫外线是否通过激活内源性JNK诱导Bad易位到线粒体。紫外线照射HCT116细胞导致线粒体部分内源性Bad增加(图3c） 。此外，JBD的表达抑制了Bad从胞浆向线粒体的移位(图3c） 支持JNK介导细胞紫外线诱导的Bad易位的观点。

如果JNK通过14-3-3蛋白的磷酸化促进Bad移位到线粒体，缺乏磷酸化位点的14-3-3突变体的表达应阻止JNK诱导的Bad移位，因为14-3-3的非磷酸化形式应在细胞质中保留Bad。正如预期的那样，14-3-3ζSer184A和14-3-3ξ（WT）的共同表达抑制了MKK7-JNK（WT(图3d） ●●●●。这些结果强烈表明，14-3-3是JNK促进Bad易位到线粒体的重要靶点。

JNK促进Bad与Bcl-2/Bcl-x的关联L（左）

Bcl-2家族蛋白的BH3-only亚家族，包括Bad，被认为通过拮抗Bcl-2/Bcl-x的抗凋亡功能来促进细胞凋亡L（左）(Yang等人，1995年;Danial和Korsmeyer，2004年). 因为我们发现活性JNK可以通过14-3-3的磷酸化诱导Bad易位到线粒体，我们接下来询问JNK是否也诱导Bad与Bcl-2/Bcl-x的关联L（左）当用抗Bad抗体免疫沉淀健康细胞中的内源性Bad时，少量Bcl-2/Bcl-xL（左）共免疫沉淀(图4a） ●●●●。相反，当MKK7-JNK（WT）在这些细胞中表达时，内源性Bcl-2/Bcl-x的数量L（左）与内源性Bad相关的14-3-3大大增加，对应于与Bad相关的14-3-3的减少(图4a） ●●●●。如果JNK促进Bad与Bcl-2/Bcl-x的关联L（左）通过14-3-3的磷酸化，14-3-3ζSer184A的表达应阻断JNK诱导的Bad和Bcl-2/Bcl-x之间的相互作用L（左）的确，14-3-3ζSer184A的表达抑制了与Bcl-2/Bcl-x相互作用的Bad蛋白的增加L（左）(图4b） ●●●●。总之，这些结果表明，JNK的激活通过14-3-3的磷酸化诱导线粒体Bad的激活。

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活性JNK的表达促进Bad与Bcl-2/Bcl-x的关联L（左）并调节Bad的磷酸化状态。（a和b）用MKK7-JNK和p35（a）或Myc–14-3-3ζ（WT或Ser184A）和MKK7-JNK（b）的表达载体转染COS-1细胞18小时，并用指示的抗体进行免疫印迹分析（IB）或用Bad抗体进行免疫沉淀（IP）；用所示抗体对所得沉淀物进行免疫印迹分析。（b） 星号表示Myc-tagged 14-3-3ζ的位置。（c） 用MKK7-JNK表达载体将COS-1细胞转染指定时间。（d） 用所示质粒转染COS-1细胞12小时，并在没有或存在500 nM冈田酸（OA）的情况下培养6小时。（c和d）用Bad抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀，并用指示的抗体对所得沉淀进行免疫印迹分析。（e） 用MKK7-JNK（WT）和14-3-3ζSer184A表达载体转染COS-1细胞18 h。如图所示，对细胞裂解物进行免疫印迹分析。在两个独立的实验中获得了相同的结果。

JNK通过14-3-3调节Bad的磷酸化状态

虽然Bad是通过JNK介导的14-3-3磷酸化从14-3-3中释放出来的，但这种释放本身不足以使其与Bcl-2/Bcl-x复合物结合L（左）因为Ser112、136或155的Bad磷酸化已被证明阻碍其与Bcl-2/Bcl-x的关联L（左）(查等，1996;Datta等人，2000年;Zhou等人，2000年). 发现JNK的激活导致Bad与Bcl-2/Bcl-x的关联L（左）促使我们检查表达活性JNK的细胞中Bad的磷酸化状态。我们最重要的发现是，MKK7-JNK（WT）的表达导致Ser112和136的Bad磷酸化水平逐渐降低(图4c） 。MKK7-JNK（WT）转染后16 h，14-3-3和Bad开始分离，而Bad磷酸化在转染后～18 h明显减少(图4c） 。Bad在Ser155的磷酸化，这是抑制Bcl-2/Bcl-x的关键位点L（左）MKK7-JNK（WT；图S2 a，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200409117.DC1). 我们不认为JNK通过灭活负责Bad磷酸化的激酶而导致Bad的去磷酸化，因为我们观察到MKK7-JNK（WT）的表达并没有降低负责Bad磷酸化的两种主要激酶Akt或Rsk的活性，在其降低Bad磷化的条件下（图S2 b）。

因此，JNK似乎诱导14-3-3释放Bad和Bad去磷酸化。这两件事之间有因果关系吗？为了验证这一点，我们用磷酸酶抑制剂冈田酸（OA）处理COS-1细胞，以防止Bad在Ser112和136的去磷酸化(图4d） ●●●●。我们证实OA维持了Bad磷酸化水平，但我们观察到MKK7-JNK（WT）的表达仍然减少了与Bad相关的14-3-3的数量(图4d） ●●●●。这表明Bad的去磷酸化不是JNK介导Bad从14-3-3分离的先决条件。另一方面，14-3-3ζSer184A的表达抑制了Ser112和136的Bad去磷酸化(图4e） ●●●●。这有力地支持了14-3-3的Bad释放对于JNK激活后Bad去磷酸化是必要的这一观点。因为Chiang等人（2003年）已经表明14-3-3和蛋白磷酸酶2A竞争Bad，并且14-3-3维持Bad的磷酸化状态，可以想象，14-3-3的JNK介导的释放使Bad可被磷酸酶接近，并且其因此被去磷酸化。

JNK介导的14-3-3磷酸化调节Bad依赖性细胞死亡

接下来，我们研究了JNK诱导的14-3-3磷酸化在细胞死亡依赖Bad并被Akt抵消的细胞环境中对细胞死亡调节的相对贡献。在HCT116细胞中，紫外线诱导的凋亡依赖于JNK(图5和MKK7-JNK（WT）诱导的凋亡被Bad的小干扰RNA（siRNA）抑制（图S3，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200409117.DC1)这表明它们至少部分依赖于内源性Bad。值得注意的是，14-3-3σSer186A的表达以及14-3-3σ（WT）的表达在较小程度上抑制了紫外线诱导的细胞凋亡(图5、c和d)和MKK7-JNK（WT）诱导的细胞凋亡(Tsuruta等人，2004年). 低水平Bad的异位表达导致紫外线诱导的细胞凋亡增强；此外，14-3-3σSer186A的表达和14-3-3∑（WT）的表达在一定程度上抑制了这种增强；图5e） ●●●●。这些结果清楚地表明，14-3-3以磷酸化依赖的方式抑制Bad介导的凋亡。

在HCT116细胞中，血清的促生存作用似乎由Akt途径介导，因为DN-Akt的表达抵消了这些作用(图6a） ●●●●。MKK7-JNK（WT）抑制血清和CA-Akt的促生存作用，而MKK7-2JNK的促凋亡作用则被血清和CA-Akt抑制(图6，a和b），表明该细胞系中JNK和Akt之间存在拮抗性相互作用。抗Bad的siRNA部分抑制了血清剥夺或DN-Akt表达引起的细胞凋亡增强（图S4，见http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200409117.DC1). 重要的是，14-3-3σSer186A的表达也抑制了血清剥夺和DN-Akt诱导的细胞凋亡，并且比14-3-3∑（WT；图6、c和d). 这些结果支持了14-3-3以磷酸化依赖的方式抑制Bad介导的凋亡的观点，在这种情况下，血清通过Akt途径促进细胞存活。

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Akt和JNK在细胞死亡调节中的拮抗作用。（a） 用GFP、MKK7-JNK（WT）和Akt突变体的表达载体转染HCT116细胞，并与10%的血清孵育6h，然后用Hoechst 33342染色，通过染色质凝集检测进行细胞死亡试验。右侧面板显示，内源性Akt在血清剥夺6小时后被去磷酸化。每个样本至少分析了540个细胞（a）和480个电池（b）（*，P<0.01和**，P<0.04）。（b） 用GFP、CA-Akt和指示量的MKK7-JNK（WT）表达载体转染HCT116细胞，并与10%的血清孵育6 h，必要时与10%血清或不与10%血清孵育8h（d），并通过染色质凝集检测进行细胞死亡试验。（c） *，P<0.05；（d） *，P<0.001；和**，P<0.04。每个样本至少分析460个细胞（c）和640个细胞（d）。（a–d）数据是从三个独立实验中的每一个150-200个细胞的三个字段中获得的值的平均值±SD（误差条）。

JNK介导的14-3-3磷酸化影响另一个14-3-3配体：FOXO3a

如前所述，许多14-3-3配体与14-3-3的常见配体结合槽结合，并共享14-3-3结合基序。因此，JNK介导的磷酸化可能导致14-3-3配体的分离，而不仅仅是Bad。为了验证这一观点，我们检测了14-3-3的JNK介导的磷酸化是否从14-3-3释放FOXO3a（图S5，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200409117.DC1)，因为Akt通过直接磷酸化使促凋亡蛋白FOXO3a失活，诱导其与14-3-3结合(Brunet等人，1999年). 在体外重组试验中，Akt介导的磷酸化增加了与His–14-3-3ζ共沉淀的GST-FOXO3a的量。然而，即使Akt磷酸化FOXO3a，MKK7-JNK（WT）对14-3-3ζ的磷酸化也会减少与14-3-3ξ共沉淀的FOXO3a的量。另一方面，当使用His–14-3-3ζ的Ser184A突变体时，无论是否与MKK7-JNK（WT）预孵育，都会沉淀出类似数量的FOXO3a，这表明JNK在Ser184直接进行14-3-3ξ磷酸化会降低其对FOXO3a的亲和力。虽然我们发现FOXO3a的表达促进了细胞凋亡，而14-3-3的表达以Ser184依赖的方式抑制了凋亡，但在我们的初步实验中，通过RNA干扰（RNAi）下调内源性FOXO3的表达并不影响紫外线处理诱导的细胞凋亡（未发表的数据）。因此，我们认为FOXO3a可能不是紫外线诱导该细胞系凋亡的关键介质，尽管这一结果并不排除在该系统中可能存在与FOXO3a具有冗余功能的促凋亡因子。事实上，从[35S] 在体外GST下拉试验中，当在Ser184进行JNK介导的GST-14-3-3ζ磷酸化时，蛋氨酸标记的COS-1细胞从GST-143-3ζ中分离出来(图7). 这表明JNK协同调节这些14-3-3结合蛋白。

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JNK在Ser184对14-3-3ζ进行磷酸化，释放14-3-3ξ结合蛋白的子集。用标记的MKK7-JNK（WT）表达载体或对照载体转染COS-1细胞12 h，并在10μg/ml茴香霉素或DMSO存在下培养1 h。用Flag抗体从细胞裂解液中免疫沉淀标记的MKK7-JNK（WT），并与重组GST、GST-14-3-3ζ（WT[35S] 蛋氨酸标记的COS-1细胞裂解物。GST蛋白用谷胱甘肽-Sepharose珠沉淀，结合蛋白用10%SDS-PAGE溶解，并通过放射自显影和考马斯亮蓝（CBB）染色检测。基本上，至少在两个独立的实验中获得了相同的结果。在对照实验（载体+DMSO）中，发现许多蛋白质与GST-14-3-3ζ（WT）和GST-143-3ζSer184A相关，但不单独与GST相关。这些蛋白的一个子集与JNK-磷酸化GST-14-3-3ζ（WT）无关。这种分离似乎依赖于Ser184处14-3-3ζ的磷酸化，因为GST-14-3-3ξSer184A与几乎相同的一组蛋白质相关，而不管它是否被JNK磷酸化。JNK磷酸化后从GST-14-3-3ζ（WT）中分离出来的蛋白质也没有与GST-143-3ζ突变体（K49E）结合，该突变体在常见的配体结合沟中含有点突变。这有力地支持了Ser184处14-3-3ζ的JNK磷酸化释放典型的14-3-3配体的观点。

讨论

14-3-3：生存和凋亡信号的整合点

在本研究中，我们描述了JNK信号通路调节细胞死亡的新机制。我们发现，JNK介导的14-3-3磷酸化从14-3-3释放Bad，并诱导其向线粒体移位，以及与Bcl-2/Bcl-x的关联L（左），这可能导致其失活。值得注意的是，这种磷酸化还导致14-3-3中几个14-3-3配体的释放，包括促凋亡蛋白FOXO3a。由于许多促凋亡蛋白共享一个共同的14-3-3结合基序（RSXpSXP或RXXXpSXP），14-3-3中的JNK磷酸化位点位于其配体结合沟附近，因此JNK的磷酸化很可能影响该配体结合位点，通过共同的机制导致这些促凋亡蛋白的释放和随后的激活。我们的结果支持这样一种观点，即JNK介导的14-3-3磷酸化影响广泛的14-3-3-配体的活性，最终导致细胞死亡程序的开始。

最近的研究表明，JNK在Ser128和Thr201处直接磷酸化Bad(Donovan等人，2002年;Konishi等人，2002年;Yu等人，2004年). 前一残基的磷酸化降低Bad对14-3-3的亲和力并激活Bad，而后者的磷酸化减少Bad对Bcl-2/Bcl-x的亲和力L（左）并使Bad失效。我们发现，JNK介导的14-3-3磷酸化在类似程度上减少了其与WT和Ser128A-Bad蛋白的相互作用。这表明JNK可以独立于Bad Ser128的磷酸化作用，从14-3-3释放Bad。然而，这两种JNK介导的磷酸化（在Bad和14-3-3上）可能并行或协同作用以有效激活Bad。另一方面，Thr201存在于小鼠Bad中，但不存在于人类Bad中并且可能一般不参与Bad调节。

似乎存在一个阈值，低于该阈值，凋亡信号可以发生，但不会导致细胞死亡。在这种情况下，14-3-3可以作为一种“缓冲液”，隔离多种促凋亡蛋白，以响应生存信号，包括Akt介导的蛋白，从而提高这个假设阈值。这也与增加或减少14-3-3的有效量可以改变存活和凋亡之间的平衡，从而提高或降低凋亡信号的阈值的观察结果相一致。至少有三种方法可以超越14-3-3设置的阈值。第一种可能也是最简单的方法是增加促凋亡蛋白的总量，使其超过阈值水平。第二种方法是减少生存信号量，这将导致去磷酸化和释放14-3-3的促凋亡蛋白(图8b） ●●●●。第三种方法是通过JNK介导的14-3-3磷酸化降低可用14-3-3的水平，从而释放促凋亡蛋白(图8c） 。在这种情况下，JNK可以降低这个假设阈值，从而使细胞更容易受到凋亡信号的影响。

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通过14-3-3蛋白对抗Akt（存活）和JNK（凋亡）信号的模型。（a） 细胞暴露于生存信号后，通过14-3-3介导的Akt-磷酸化促凋亡蛋白（如Bad和FOXO3a）的隔离来抑制凋亡。（b） 生存信号减少会促进促凋亡蛋白的去磷酸化，导致这些蛋白从14-3-3释放出来，从而导致细胞死亡。（c） 有效的（持续的）凋亡信号促进JNK介导的14-3-3磷酸化，导致14-3-3的促凋亡蛋白释放和细胞死亡。粉红色和蓝色圆圈中的P分别代表Akt和JNK介导的磷酸化。

如前所述，细胞凋亡和存活信号之间的平衡对于理解细胞死亡调控至关重要。我们认为14-3-3可能是JNK介导的应激信号和Akt介导的生存信号的关键整合点，从而有助于决定细胞是否应该存活或死亡。

材料和方法

材料

茴香霉素从Sigma-Aldrich获得，OA从Calbiochem获得，CMXRos从Molecular Probes获得。

细胞培养和转染

COS-1细胞保存在补充有10%FBS和1%青霉素/链霉素的DME（Sigma-Aldrich）中。HCT116细胞保存在含有10%FBS、1%青霉素/链霉素和1.5 mM的McCoy 5A培养基（Sigma-Aldrich）中我-谷氨酰胺。使用Fugene6（Roche Diagnostics）将质粒转染COS-1细胞，使用LipofectAMINE 2000（Invitrogen）转染HCT116细胞。

质粒构建

编码小鼠Bad（全长）和FOXO3a（aa 1–525）的结构由M.E.Greenberg（马萨诸塞州波士顿哈佛医学院）提供。我们从H.Fu（佐治亚州亚特兰大埃默里大学医学院）获得了编码14-3-3ζ的结构体，从B.Vogelstein（马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学医学院（the Johns Hopkins University School of Medicine，Baltimore，MD））获得了14-3-3σ。对于Myc-tagged Bad表达载体，将Bad cDNA片段插入pCS4-Myc的BglII位点。使用QuikChange试剂盒（Stratagene）进行定点突变，以在Bad中将Ser128和Thr201转化为Ala变化，并在14-3-3ζ中将Lys49转化为Glu变化。将WT、Ser128A、Thr201A和Ser128A-Thr201A-Bad cDNA克隆至pET28a（Novagen）的BamHI位点，将K49E 14-3-3ζcDNA克隆到pCS4-Myc的BglII位点。pcDNA3-MKK7-FLAG-JNK（WT和KN）、pET28a-MKK7-FLAG-JNK。马萨诸塞州伍斯特市马萨诸塞大学医学院戴维斯分校（Davis，University of Massachusetts Medical School，Worcester，MA）之前曾有描述(Masuyama等人，2001年;Tsuruta等人，2002年,2004).

抗体

14-3-3（K-19；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）、14-3-3σ（C-18；Santa Cruz Bintechnologies，Inc.）和Bad（C-20；Santa Cruz BietechnologY，Inc.）的抗体、phospho-Bad（Ser112；Cell Signaling）、phosphao-BadL（左）（S-18；Santa Cruz Biotechnology，Inc.），裂解caspase-3（细胞信号），F1F类0-ATP酶亚单位α（7H10；分子探针）、α-微管蛋白（DM1A；Sigma-Aldrich）、GAPDH（MAB374；Chemicon）、GST（B-14；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）、c-Jun（细胞信号）、磷酸化c-Jun（细胞信号）、Akt（细胞信号）、磷酸化Akt（Ser473；58F11；细胞信号）、Rsk（Upstate Biotechnology）或磷酸化p90Rsk（Thr359-Ser363；细胞信号传导）用于免疫印迹分析。M.E.Greenberg提供了一种针对磷酸化Bad（Ser155）的抗体(Datta等人，2000年). 免疫沉淀法使用Bad抗体（C-20；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）、14-3-3σ抗体（C-18；Santa Cruz Bintechnologies，Inc.），HA抗体（Y-11；Santa Cruz BietechnologY，Inc.）和Flag抗体（M2；Sigma-Aldrich），正常兔IgG抗体（Santa Cru z Biotechnology公司）或正常山羊IgG（Santa Cruz Biotech，Inc.）。

免疫印迹分析

用PBS清洗细胞，并在提取缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，10 mMβ-甘油磷酸，5 mM EGTA，1 mM焦磷酸钠，5 mM-NaF，1 mM-Na）中溶解细胞三VO（旁白）4、0.5%Triton X-100和1 mM DTT）添加蛋白酶抑制剂（1 mM PMSF、5μg/ml亮氨酸蛋白酶、5μg/ml胃蛋白酶抑制素A和5μg/ml抑肽酶）。通过SDS-PAGE分离蛋白质，并将其电转移到聚偏二氟乙烯膜上。用适当的一级抗体和HRP结合的二级抗体探测膜。Western Lightning（PerkinElmer）对斑点进行了可视化。

蛋白质纯化

他的6-标记的Bad（WT、Ser128A、Thr201A或Ser128A-Thr201A）表达于大肠杆菌基于pET28a的载体BL21。添加IPTG后，发生诱导；用镍纯化His标记蛋白2+-结合柱（ProBond树脂；Invitrogen）。GST-14-3-3ζ、GST-FOXO3a（aa 1-525）和His的纯化6-如前所述执行标记为MKK7-JNK的操作(Brunet等人，1999年;Tsuruta等人，2004年).

亚细胞分离

用PBS清洗细胞，将其悬浮在300μl冰镇等渗缓冲液（200 mM甘露醇、70 mM蔗糖、1 mM EDTA、10 mM Hepes-NaOH、pH 7.4和1 mM DTT）中，并添加上述蛋白酶抑制剂，然后用Potter-Elvehjem均质器（Mazela Z型；Eyela型）均质。在500℃离心，去除细胞核和未破碎细胞克10分钟，上清液在10万下进一步离心克持续60分钟。将产生的上清液保存为细胞溶质部分，用等渗缓冲液清洗颗粒，再悬浮在补充有蛋白酶抑制剂的提取缓冲液中，并在20000下离心克5分钟后清除碎片。所得上清液作为线粒体部分保存。

协同免疫沉淀分析

在裂解缓冲液（20 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，10 mMβ-甘油磷酸，5 mM EGTA，1 mM焦磷酸钠，5 mM-NaF，1 mM-Na）中裂解COS-1细胞三VO（旁白）40.05%Triton®声波风廓线仪X-100和1 mM DTT）。然后将裂解产物与Bad（C-20）抗体孵育1h，然后与蛋白A–Sepharose珠（GE Healthcare）孵育1 h。在上述裂解缓冲液中对HCT116细胞进行裂解，并用蛋白G–Sepharo珠对裂解产物进行预处理。将裂解产物与14-3-3σ抗体（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）和蛋白G–Sepharose珠培养2 h。在用SDS-PAGE分离后，对珠上回收的蛋白-抗体复合物进行免疫印迹分析。

实验

重组GST–14-3-3ζ（WT或Ser184A）在存在激酶反应缓冲液（100μM ATP、20 mM Tris-HCl、pH 7.5和15 mM MgCl2)在30°C下保持30分钟。他的6-Bad（WT、Ser128A、Thr201A或Ser128A-Thr201A）蛋白在激酶反应缓冲液中预先孵育，有或没有活性Akt免疫沉淀。随后，将Bad蛋白与GST–14-3-3ζ和谷胱甘肽–Sepharose 4B小珠在4°C下混合1 h，并用Bad和GST抗体对小珠结合蛋白进行免疫印迹分析。

免疫荧光分析

COS-1细胞生长在聚乙烯上-天-赖氨酸包被盖玻片，并转染表达Myc-tagged Bad和p35的质粒和/或编码MKK7-JNK蛋白的表达质粒。将细胞在RT下固定在含有4%PFA的PBS中10分钟。将固定的盖玻片在含有0.5%Triton X-100的PBS中透化10分钟，在PBS中洗涤两次，并在封闭溶液（含有2%BSA的PBS）中孵育30分钟。然后将细胞与抗Myc抗体（9E10；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）1小时，并在封闭溶液中用AlexaFluor488抗小鼠IgG抗体（Molecular Probes）1小时。如有指示，细胞在固定前用CMXRos染色以观察线粒体。荧光图像由共焦激光扫描显微镜（LSM-510型；卡尔蔡司显微成像公司）记录。所有图像均使用物镜（1.4 NA；C-Apochro）在40倍下拍摄。使用LSM5图像浏览器（Carl Zeiss MicroImaging，Inc.）对图片进行分析。

RNAi实验

人类Bad mRNA的siRNA来自日本生物服务有限公司。本研究中用于Bad的siRNA序列为有义（5′-UGAGUACGUUGUGGUGGAdTdT-3′）和反义（5’-UCACAAAACUCGUCCACACAdTdT—3′）。将正义序列的5′末端标记为德克萨斯红，并将序列随机用于对照siRNA（正义，5′-AGUUCGAUUUUAGGGGGAdTdT-3′；反义，5′-UCCCCCUAAAAUCGAACUdTdT3′）。根据制造商的说明，使用Oligofectamine试剂（Invitrogen）进行对HCT116细胞的转染，不同之处在于使用转染试剂的孵育时间为120分钟。通过Texas red评估，转染效率>95%。

细胞凋亡测定

将HCT116细胞接种到60mm培养皿中，并将表达GFP的质粒与编码JBD、Bad、MKK7-JNK（WT）和各种Akt或14-3-3蛋白的表达质粒一起转染。24小时后，必要时在10%血清中用紫外线照射细胞6小时。用Hoechst 33342染色10分钟后，测定GFP阳性细胞的百分比（核固缩）。对于RNAi实验，2.5×105将细胞接种到35 mm培养皿中，并转染100 pmol siRNA。36 h后，将0.625μg GFP、MKK7-JNK（WT）或各种Akt蛋白表达载体转染细胞，48 h后，用紫外线照射细胞。然后，他们被Hoechst 33342染色。

统计分析

结果表示为平均值±SD，并使用未配对吨测试。

在线补充材料

图S1显示，无论体外Bad的Ser128和Thr201磷酸化如何，JNK介导的14-3-3磷酸化都可以诱导Bad的分离。图S2显示，活性JNK的表达导致Ser112、136和155的Bad磷酸化降低，而不抑制Akt和Rsk的磷酸化。图S3显示，紫外线和活性JNK诱导的细胞死亡部分依赖于Bad。图S4显示，抗Bad的siRNA的引入抑制了由血清剥夺或DN-Akt诱导的细胞死亡。图S5显示，JNK介导的14-3-3ζ磷酸化导致体外14-3-3ξ释放FOXO3a。在线补充材料可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200409117.DC1。

致谢

我们感谢M.Miura博士、H.Fu博士、B.Vogelstein博士、R.Davis博士和M.E.Greenberg博士提供试剂。我们还感谢马克·兰菲尔博士阅读了手稿，并感谢Gotoh实验室的成员进行了有益的讨论。

这项工作得到了日本教育、科学、体育和文化部的资助，以及日本科技公司的21世纪胚胎科学和技术先驱研究的支持。

笔记

本文中使用的缩写：CA，组成活性；DN，显性阴性；JBD、JNK绑定域；JNK，c-Jun NH公司2-末端激酶；KN，激酶阴性；OA、冈田酸、siRNA、小干扰RNA；RNA干扰；WT，野生型。

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文章来自细胞生物学杂志由以下人员提供洛克菲勒大学出版社