细胞生物学杂志。 2005年12月19日； 171(6): 925–930.
报告
心肌细胞Apaf-1水平降低与内源性XIAP对细胞凋亡的严格调控有关 , 1 , 2 , 三 , 2, 三 和 1, 2
玛丽亚·波茨
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Allyson E.Vaughn公司
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霍利·麦克多诺
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坎·帕特森
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穆罕默德·德斯穆赫
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2005年4月14日收到； 2005年11月4日接受。
摘要 过度表达研究已确定X连锁凋亡抑制蛋白（XIAP）是一种有效的半胱氨酸蛋白酶抑制剂。 然而，内源性XIAP在调节哺乳动物细胞凋亡中的确切作用尚不清楚。 内源性XIAP严格调控细胞色素 c（c） 交感神经元中依赖于–的caspase激活，但在许多有丝分裂细胞中没有。 我们报道，有丝分裂后心肌细胞与成纤维细胞不同，对细胞溶质微量注射细胞色素具有显著的抵抗力 c（c） .心肌细胞对细胞色素的抵抗 c（c） 由内源性XIAP介导，因为XIAP缺乏的心肌细胞会随着细胞溶质细胞色素迅速死亡 c（c） 独自一人。 重要的是，我们发现心肌细胞和神经元一样，显著降低了Apaf-1水平，Apaf-1的降低与XIAP对caspase激活的严格调节直接相关。 这些数据确定了XIAP在心肌细胞中的重要功能，并指出在有丝分裂后细胞的凋亡调控方面存在惊人的相似性。
介绍 尽管对细胞系的研究已经确定了哺乳动物凋亡途径的主要成分，但不同原代细胞凋亡调控的差异在很大程度上仍未被探索。 凋亡的关键执行者是caspase蛋白酶( Fuentes Prior和Salvesen，2004年 ). 哺乳动物细胞凋亡过程中半胱氨酸天冬氨酸酶激活的一个主要机制涉及线粒体信号通路的聚合，以诱导细胞色素的释放 c（c） 一旦进入胞质溶胶，细胞色素 c（c） 与Apaf-1结合诱导其寡聚化，并招募procaspase-9形成凋亡小体复合体。 这导致了caspase-9的激活，然后激活caspase-3，进而裂解各种细胞蛋白以诱导细胞快速死亡( 亨加特纳，2000 ; 王，2001 ).
细胞色素 c（c） 凋亡抑制蛋白家族（IAP； Salvesen和Duckett，2002年 ). 这些蛋白包括X-连锁IAP（XIAP）、细胞IAP（cIAP）1和2以及神经元凋亡抑制蛋白，可以通过直接与激活的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶结合来阻止凋亡。 添加纯化的IAP阻断细胞色素 c（c） 体外介导的caspase激活和IAP的过度表达抑制多种细胞中caspase的激活和凋亡( Deveraux和Reed，1999年 ). 然而，内源性IAP在细胞色素后调节细胞凋亡的能力似乎受到了更大的限制 c（c） 在哺乳动物细胞中。 在许多有丝分裂细胞中，如HeLa细胞、人胚胎肾293细胞和原代成纤维细胞，细胞色素的胞浆积累 c（c） 单独使用足以诱导caspase快速激活和凋亡。 在这些细胞中，添加细胞色素 c（c） 细胞溶质裂解物在体外激活caspase( Liu等人，1996年 ; Kluck等人，1997年 ; 胡等，1999 )和微量注射细胞色素 c（c） 足以在完整细胞中诱导细胞快速死亡( Li等人，1997年 ; Brustugun等人，1998年 ; Juin等人，1999年 ; Chang等人，2000年 ). 这些结果反对严格的细胞色素后处理 c（c） IAP对有丝分裂细胞凋亡的调节。 相比之下，新生儿交感神经细胞对细胞溶质微量注射细胞色素有显著抵抗力 c（c） ( Deshmukh和Johnson，1998年 ; Neame等人，1998年 ). 在这些神经元中，对细胞色素的抵抗 c（c） 这归因于内源性XIAP对caspase激活的严格控制。 与野生型神经元不同，XIAP缺失的交感神经元会随着细胞色素迅速死亡 c（c） 独自一人( Potts等人，2003年 ).
内源性XIAP严格调控细胞色素后细胞凋亡的选择性能力 c（c） 在交感神经元中而不是在许多有丝分裂细胞中不是由于XIAP表达水平的差异。 相反，正如我们最近报道的那样，神经元分化伴随着Apaf-1水平的显著降低，导致凋亡小体活性的显著降低( Wright等人，2004年 ). 重要的是，Apaf-1的减少与内源性XIAP抑制神经元凋亡的能力增强直接相关。 恢复Apaf-1水平足以消除XIAP对半胱氨酸蛋白酶的严格调控并允许细胞色素 c（c） 单独诱导交感神经元快速凋亡( Wright等人，2004年 ). 因此，XIAP调节哺乳动物细胞凋亡的有效性可以通过调节Apaf-1活性来确定，而无需直接影响XIAP的表达或功能。
增加对细胞凋亡的控制对神经元是有利的，因为它们是有丝分裂后的，并且在生物体的生命中持续存在。 例如，XIAP对caspase激活的严格调控可能会保护神经元免受细胞色素意外引起的凋亡 c（c） 从受损的线粒体中释放出来。可以说，这种增加的凋亡调节可能对其他存活在生物体生命中的终末分化细胞也有进化上的益处。
为了验证这个假设，我们检查了细胞色素 c（c） –介导的caspase激活在原代心肌细胞中受到严格调控。 心肌细胞和神经元一样，都是有丝分裂后的细胞，再生能力有限，在生物体的生命中持续存在( Anrevoke等人，2002年 ). 因此，心肌细胞凋亡死亡是导致心力衰竭的重要因素( Gill等人，2002年 ; Clerk等人，2003年 ; Foo等人，2005年 ; Garg等人，2005年 ). 我们的结果表明，由于低Apaf-1水平，细胞色素 c（c） 与交感神经元一样，心肌细胞中依赖性caspase的激活受到内源性XIAP的严格调控。 内源性XIAP对心肌细胞和神经元中caspase激活的选择性调节能力表明了一种确保有丝分裂后细胞长期存活的共同机制。
结果和讨论 心肌细胞对胞浆微量注射细胞色素具有耐药性 c（c） 与许多有丝分裂细胞不同，交感神经元对细胞色素有显著的抵抗力 c（c） 为了确定终末分化心肌细胞是否表现出相同的抵抗力，我们将细胞色素微量注射到原代小鼠新生心肌细胞 c（c） 作为对照，我们还微量注射了从相同动物分离的成纤维细胞。 牛细胞溶质细胞色素 c（c） 单独使用足以诱导成纤维细胞快速死亡，90%的成纤维细胞在注射后30分钟内死亡( ). 相反，牛细胞色素 c（c） 单用细胞色素不能诱导心肌细胞死亡，因为90%以上的心肌细胞在细胞色素染色后10小时仍能存活 c（c） 注射( ). 酵母细胞色素对照注射 c（c） ，不能激活半胱天冬酶( Ellerby等人，1997年 )在成纤维细胞或心肌细胞中均未诱导死亡。 因此，新生儿心肌细胞，就像交感神经元一样，对细胞色素的胞浆注射有明显的抵抗力 c（c） .
细胞色素胞浆显微注射 c（c） 诱导成纤维细胞死亡，但不诱导心肌细胞死亡。 用25μg/μl牛或酵母细胞色素微注射新生大鼠心肌细胞和真皮成纤维细胞 c（c） ，并在注射后多次评估细胞存活率（使用形态学标准）。 （A） 注射细胞色素后3小时细胞的相控和荧光照片 c（c） 注射的细胞（箭头）通过与细胞色素共注入的罗丹明葡聚糖的存在进行鉴定 c（c） （B）细胞存活定量。 所示数据为三个独立实验的平均值±SEM。
Western分析表明新生心肌细胞表达Apaf-1、caspase-9和caspase-3( A） ●●●●。 这一结果与细胞色素 c（c） 由于凋亡机制的核心成分缺乏，不能诱导心肌细胞死亡。 在交感神经元中，细胞色素 c（c） –诱导的caspase激活受到内源性IAP的严格调控。 添加抑制IAP的外源Smac克服了对细胞色素的抗性 c（c） 并允许神经元发生凋亡( Deshmukh等人，2002年 ; Potts等人，2003年 ). 检测心肌细胞对细胞色素的抵抗 c（c） 也可归因于内源性IAP的严格调控，我们检测了过量Smac注射是否允许细胞色素 c（c） 激活心肌细胞凋亡。 细胞色素共注入 c（c） 成熟的Smac对诱导心肌细胞死亡非常有效，但两者都不是单独的( B） ●●●●。 为了证实外源Smac允许细胞色素 c（c） 为了通过抑制心肌细胞中的IAP来诱导细胞凋亡，我们检测了一种不能抑制IAP的突变Smac蛋白( Chai等人，2000年 )能够允许细胞色素 c（c） 导致死亡。 我们发现，与野生型Ala-Val-Pro-Ile（AVPI）–Smac不同，突变型Met-Val-Pro-Iel（MVPI）–Smac不能与细胞色素协同作用 c（c） 诱导心肌细胞死亡( C） ●●●●。 我们还证实了注射细胞色素引起的死亡 c（c） AVPI-Smac是caspase激活的结果。 添加泛半胱天冬酶抑制剂zVAD-FMK完全阻断细胞色素诱导的心肌细胞死亡 c（c） 和Smac( C） ●●●●。 总之，这些结果表明凋亡小体的成分在心肌细胞中存在并发挥作用，但只有当IAP的活性被阻断时才允许凋亡。
心肌细胞对细胞色素的抵抗 c（c） 可以通过外源性添加IAP抑制剂Smac来克服。 （A） Western blot显示大鼠心肌细胞培养物表达核心凋亡成分（Apaf-1、caspase-9和caspase-3）和各种IAP（XIAP、cIAP-1和cIAP-2）。 LDH和肌钙蛋白I显示为对照。 （B） 用25μg/μl牛细胞色素微注射大鼠心肌细胞 c（c） 注射后多次评估细胞存活率。 （C） 给大鼠心肌细胞注射25μg/μl的牛细胞色素 c（c） 以及1μg/μl成熟野生型AVPI-Smac或成熟突变型MVPI-Sac，在存在或不存在50μM泛半胱天冬酶抑制剂zVAD-FMK的情况下。 注射后多次评估细胞存活率。 所示数据为三个独立实验的平均值±SEM。
严格调节细胞色素 c（c） 内源性XIAP诱导心肌细胞凋亡 西方分析表明心肌细胞表达多种IAP，包括XIAP、c-IAP-1和c-IAP-2( A） ●●●●。 尽管交感神经元中有多个IAP表达，但仅去除XIAP就足以允许细胞色素 c（c） 神经元中依赖于–的caspase激活( Potts等人，2003年 ). 为了确定内源性XIAP是否是心肌细胞caspase激活的重要调节器，我们检测了细胞色素的能力 c（c） 诱导XIAP缺乏小鼠心肌细胞死亡( Harlin等人，2001年 ). 与对细胞色素有抵抗力的野生型心肌细胞相比 c（c） ，XIAP缺失的心肌细胞表现出明显的任性，并在细胞溶质微量注射细胞色素后死亡 c（c） 独自一人( A） ●●●●。 50%缺乏XIAP的心肌细胞在细胞色素的2小时内死亡 c（c） 注射后9h存活率<15%。 相反，80%的野生型心肌细胞在细胞色素染色后9小时仍能存活 c（c） 注射( B） ●●●●。 与对照注射酵母细胞色素相比，XIAP缺乏的心肌细胞通常对微量注射本身不敏感 c（c） 不会导致这些细胞死亡。
注射细胞色素后，XIAP缺乏的心肌细胞死亡 c（c） . 将从XIAP缺乏（−/−）或野生型（+/+）同窝小鼠分离的心肌细胞微量注射25μg/μl牛细胞色素 c（c） 作为对照，还向XIAP缺乏的心肌细胞注射25μg/μl酵母细胞色素 c（c） .（A）代表性细胞的相控和荧光照片。 箭头标记注入的细胞，通过罗丹明右旋糖酐和细胞色素的共注入进行鉴定 c（c） （B）注射后多次细胞存活的定量。 所示数据为三个独立实验的平均值±SEM。
因此，尽管XIAP在哺乳动物细胞中普遍表达，但这些结果确定心肌细胞只是第二种哺乳动物细胞类型，内源性XIAP对细胞色素有严格的控制作用 c（c） 依赖性凋亡。 然而，我们不能排除XIAP缺陷可能只是将IAP的总阈值降低到允许细胞色素水平以下的可能性 c（c） 激活这些细胞中的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶。
显著降低的Apaf-1水平为XIAP严格调控心肌细胞凋亡设定了阈值 我们最近报道，内源性XIAP调节细胞凋亡的有效性与细胞中依赖Apaf-1的凋亡小体活性呈负相关( Wright等人，2004年 ). 确定是否严格控制细胞色素 c（c） XIAP介导的心肌细胞死亡受类似机制的调节，我们检测了Apaf-1的水平。 作为比较，我们还检测了真皮成纤维细胞中Apaf-1的水平。 与心肌细胞不同，成纤维细胞不受内源性XIAP的严格调控，注射细胞色素后死亡 c（c） 独自一人( ). 我们发现心肌细胞中的Apaf-1蛋白水平显著降低到成纤维细胞中Apaf-1水平的25%以下( ). Apaf-1的减少并不是心肌细胞在培养基中保持6-8天的伪影，因为心肌细胞在分离后立即出现类似的低水平Apaf-1（图S1 A，可在 http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200504082/DC1 ).
与成纤维细胞相比，心肌细胞中的Apaf-1而非caspase-9水平显著降低。 （A） Western blot显示大鼠真皮成纤维细胞和心肌细胞培养物中Apaf-1和caspase-9蛋白（以及作为对照的LDH和Troponin I）的水平。 （B） 心肌细胞培养物中检测到的Apaf-1和caspase-9蛋白水平表示为成纤维细胞培养物所见水平（归一化为LDH）的百分比。 所示数据为三个独立实验的平均值±SEM。
我们检测了心肌细胞和成纤维细胞之间Apaf-1的显著差异是否反映了心肌细胞凋亡小体成分的普遍减少。 然而，我们发现心肌细胞和成纤维细胞之间的caspase-9水平没有差异。 因为E2F1已被确定为Apaf-1的转录调控因子( Moroni等人，2001年 )终末分化心肌细胞E2F1活性降低( Flink等人，1998年 )可能有助于这些细胞中Apaf-1水平的显著降低。
为了确定心肌细胞中的低Apaf-1表达是否确实是XIAP严格调控caspase激活的原因，我们检测了升高这些细胞中的Apaf-1水平是否会导致XIAP无效。 用表达GFP和Apaf-1或单独载体的质粒转染心肌细胞。 24小时后允许表达，将转染的心肌细胞（GFP阳性）注入细胞色素 c（c） 检测胞质细胞色素的能力 c（c） 诱导细胞凋亡。 增加Apaf-1水平在允许细胞色素方面非常有效 c（c） 单独诱导心肌细胞死亡( ). 单独过表达Apaf-1并不影响存活，因为当注射对照酵母细胞色素时，90%以上表达Apaf-1-的心肌细胞仍然存活 c（c） 此外，这种作用对Apaf-1具有选择性，因为其他凋亡小体成分procaspase-9的过度表达并没有克服XIAP的抑制作用( ). 因此，内源性XIAP严格调控心肌细胞凋亡的能力与Apaf-1水平的降低有关。
恢复Apaf-1水平消除了XIAP的严格控制并允许细胞色素 c（c） 诱导心肌细胞凋亡。 用单独表达GFP（Vector/GFP）、Apaf-1和GFP（Apaf-1-GFP）或procaspase-9和GFP的质粒转染大鼠心肌细胞。 24小时后，将25μg/μl牛或酵母细胞色素微量注射转染细胞（通过GFP表达识别） c（c） 和罗丹明葡聚糖（Cyt c/Rhod）。 （A） 细胞色素染色后2小时拍摄的代表性细胞的荧光照片（用于GFP或罗丹明选择性通道） c（c） 注射。 箭头指向注射了细胞色素的GFP阳性细胞 c（c） 和罗丹明。 （B） 各种条件下细胞存活率的定量（注射后2小时）。 所示数据为三个独立实验的平均值±SEM。
我们观察到细胞溶质细胞色素 c（c） 不足以诱导心肌细胞凋亡，这与细胞色素大量移位的研究一致 c（c） 在人心肌病心脏中细胞溶质无明显凋亡( Narula等人，1999年 ; Scheubel等人，2002年 ). 同样，最近的一项研究发现，staurosporine治疗能够诱导细胞色素 c（c） 心肌细胞释放而非凋亡( Sanchis等人，2003年 ). 然而，这项研究没有发现心肌细胞中检测到Apaf-1的表达，并得出结论：心肌细胞对细胞色素的抵抗 c（c） 因为这些细胞缺乏Apaf-1( Sanchis等人，2003年 ). 相反，我们报告心肌细胞表达低水平的Apaf-1，这种低Apaf-1活性的结果是内源性XIAP对caspase激活的严格控制。 使用野生型和XIAP缺乏小鼠心肌细胞的单细胞微量注射，我们发现细胞溶质细胞色素 c（c） 只要XIAP对半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的抑制被解除，则完全能够诱导心肌细胞凋亡。
严格的细胞色素后处理机制的总体相似性 c（c） 心肌细胞和交感神经细胞凋亡的调控引人注目( Potts等人，2003年 ; Wright等人，2004年 ). 在这两种有丝分裂后细胞类型中，内源性XIAP在控制细胞色素方面非常有效，但在有丝分裂成纤维细胞中没有 c（c） –依赖性胱天蛋白酶激活。 在这两种情况下，这都是由于Apaf-1表达显著降低的结果。 虽然心肌细胞和交感神经细胞具有非常不同的生理和形态特性，但这两种细胞的再生潜力有限，需要长期存活。 与新生儿、心脏（图S1 B）和脑组织相比，成人Apaf-1的表达进一步降低( Yakovlev等人，2001年 ). Apaf-1的低表达也见于其他组织，如肝脏和骨骼肌，其中包含大量有丝分裂后细胞（图S2，可在 http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200504082/DC1 ; Burgess等人，1999年 ). 总之，我们的数据表明，终末分化触发了Apaf-1水平的显著降低，并由此引发高效XIAP介导的安全制动，以确保有丝分裂后细胞的长期存活。
材料和方法 试剂 除非另有说明，否则所有试剂均购自Sigma-Aldrich或Fisher Scientific。 Apaf-1 cDNA是G.Nuñez（密歇根大学，密歇根州安娜堡）送的礼物，caspase-9 cDNA是C.Du（密苏里州堪萨斯城斯托尔斯研究所）送的。 如前所述，生成重组AVPI-和MVPI-Smac蛋白( Potts等人，2003年 ).
原代心肌细胞和成纤维细胞培养 按照制造商的说明，使用沃辛顿新生儿心肌细胞分离系统（沃辛顿生化公司）从出生后第0-1天的大鼠或小鼠中分离出原代心肌细胞培养物。 包括预处理步骤（2小时）以减少培养物中成纤维细胞的数量。 然后，将细胞接种在MEM中的层粘连蛋白涂层板上，该层粘连素涂层板上添加有2 mM谷氨酰胺、10%马血清、5%FBS、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素。 在电镀后6-8天对细胞进行实验。
从出生后第0-1天的大鼠中分离出初级皮肤成纤维细胞，如下所示。 取背部皮肤，在37°C下分别用1 mg/ml胶原酶和2.5 mg/ml胰蛋白酶处理1 h。 然后研磨组织，将分离的细胞置于补充有10%FBS、100μg/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DME中。 实验前细胞传代一次。
微量注射和细胞存活定量 使用Femtotip II针头（Eppendorf，Inc.）或拉动Flaming-Brown水平微移液器（Sutter Instrument Co.）和安装在倒置荧光显微镜（Leica）上的Narashigi微操作器的针头，将细胞微注射在35-mm板上。 在这些实验中，每种情况下注射50到150个细胞。 微量注射溶液含有100 mM KCl，10 mM KP 我 pH 7.4，8 mg/ml罗丹明葡聚糖，含25μg/μl牛或酵母细胞色素 c（c） 和1μg/μl AVPI-或MVPI-Smac。 微量注射后，活细胞被鉴定为持续跳动（心肌细胞）且形态完整的罗丹明阳性细胞。 死亡细胞呈圆形，常伴有膜崩解。
转染 根据制造商的说明，用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染新生心肌细胞。 简言之，将细胞切换至无抗生素培养基，并转染2.5μg DNA（0.6μg EGFP和1.9μg pCDNA3质粒，表达Apaf-1、procaspase-9或单独载体）。
蛋白质斑点 如前所述进行蛋白质印迹( Potts等人，2003年 ). 使用的主要抗体如下：抗XIAP（R&D Systems）、抗-cIAP-1（R＆D Systems， 和抗肌钙蛋白I（Chemicon）。 抗小鼠/兔HRP偶联的二级抗体购自Pierce Chemical Co.。使用ECL Plus检测系统检测蛋白质。 蛋白质水平通过台风扫描仪（GE Healthcare）上的扫描印迹进行量化，并使用ImageQuant软件（GE Hearthcare）进行分析。
图像采集和处理 所有图像均由安装在倒置荧光显微镜（DMIRE 2；徕卡）上的数字黑白电荷耦合设备相机（ORCA-ER；哈马松）采集。 使用40倍油浸物镜拍摄图像。 荧光图像是用四甲基罗丹明-异硫氰酸盐DiL-HQ过滤器组（罗丹明；Chroma Technology Corp.）拍摄的。 图像采集软件是Metamorph 5.0（Universal Imaging Corp.）。 图像被缩小并在Photoshop（Adobe）中裁剪，以准备最终的图形。
致谢 我们感谢克雷格·汤普森博士慷慨地为我们提供了XIAP基因敲除小鼠。 我们还要感谢凯文·赖特、米歇尔·史密斯和帕特里克·瑞安·波茨对这份手稿的批判性审查。
这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款NS42197（给M.Deshmukh）和HL65619（给C.Patterson）以及美国心脏协会拨款0455603U（给M.Deshmuk）的支持。
笔记
本文中使用的缩写：AVPI、Ala-Val-Pro-Ile； cIAP，细胞IAP； 凋亡蛋白抑制剂； 乳酸脱氢酶； MVPI，Met-Val-Pro-Ile； XIAP，X-linked IAP。
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