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学习记忆。2008年1月；15(1): 29–38.
数字对象标识：10.1101/lm.661908
预防性维修识别码：PMC2170513型
PMID：18174371

S6K1和S6K2的去除导致学习、记忆和突触可塑性的不同改变

玛西娅·D·安条安,1 马亚恩·梅哈夫,2 查尔斯·霍弗,三，4 杰拉尔德·里斯,5 萨拉·科兹玛,6 乔治·汤姆斯,6 埃林·舒曼,5 科比·罗森布拉姆,2和埃里克·克伦1,三，4,7
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

蛋白质合成是表达持久记忆和持久突触可塑性所必需的。在细胞增殖和生长过程中，S6激酶（S6Ks）被激活并协调从头合成蛋白质。我们假设S6K介导的蛋白质合成对学习、记忆和突触可塑性的表现至关重要。我们用S6K1或S6K2基因缺陷的基因工程小鼠验证了这一假设。我们发现，S6K1缺陷小鼠在训练一小时内表现出早期的上下文恐惧记忆缺陷、条件味觉厌恶（CTA）缺陷、莫里斯水迷宫获得障碍和探索行为缺乏。相反，S6K2缺乏小鼠在训练七天后表现出上下文恐惧记忆降低，CTA的潜在抑制减少，Morris水迷宫中的空间学习正常。令人惊讶的是，S6K1和S6K2缺陷小鼠的蛋白质合成依赖性晚期长期增强（L-LTP）均未发生改变。然而，去除S6K1，而不是S6K2，会损害早期LTP的表达。此外，我们观察到S6K1缺陷小鼠的Akt磷酸化基础水平升高，在L-LTP诱导后进一步升高。综上所述，我们的研究结果表明，S6K1的去除导致了一系列不同的行为和突触可塑性表型，而S6K2的去除并没有反映这些表型。我们的观察表明，这两个基因本身都不是L-LTP所必需的，相反，可能是认知过程所需的其他类型的突触可塑性所必需的。

蛋白质合成是多种学习任务以及多种形式的突触可塑性所必需的(Davis and Squire 1984年;Frey等人1988;Rosenblum等人，1993年;Kang和Schuman，1996年;Manahan-Vaughan等人，2000年). 已知S6激酶（S6K）活性与蛋白质合成增强相关(杜夫纳和托马斯1999). S6K最初参与含有5′寡嘧啶结构域（5′TOP）的mRNA的翻译，该结构域编码翻译装置的成分并促进核糖体的生物生成(法拉利和托马斯1994;Jefferies等人，1994年;梅尤哈斯2000). 然而，5′TOP mRNA的翻译仍然发生在缺乏两个S6K基因的突变小鼠中(Pende等人，2004年)，新的研究支持这些激酶的替代翻译控制功能(Ruvinsky等人，2005年;鲁文斯基和梅尤哈斯2006). 最近的研究表明，S6K对真核生物mRNA上蛋白质合成前启动复合物（PIC）的形成至关重要(Holz等人，2005年). 磷酸化核糖体蛋白S6是S6Ks的直接底物，可被招募到7-甲基鸟嘌呤核苷帽结合复合物中，表明其在翻译控制中起直接作用(Roux等人，2007年). 此外，已鉴定出S6K的直接底物，其类似地促进增强蛋白质合成，包括真核生物起始因子4B（eIF4B），一种RNA解旋酶促进因子(Raught等人，2004年); 真核延长因子2激酶&肽链延长的调节因子(Wang等人，2001年); 和程序性细胞死亡蛋白4（PDCD4），一种调节解旋酶真核起始因子4A（eIF4A）水平的蛋白质(Dorrello等人，2006年).

在哺乳动物中，有两个基因编码S6K，即S6K1和S6K2，每个基因都由两种蛋白质亚型表示：S6K1S和S6K1L（通常称为p70S6K和p85S6K），以及S6K2S和S6K2L(Um等人，2006年). 迄今为止，雷帕霉素（mTOR）和磷脂酰肌醇依赖性蛋白激酶1（PDK1）的哺乳动物靶点似乎以类似的方式调节S6K(Um等人，2006年). 在海马体中，S6K1/2激活的其他上游介质包括1类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和细胞外信号调节蛋白激酶（ERK）信号通路，这两种信号通路都是蛋白质合成依赖性晚期LTP（L-LTP）所必需的(Raymond等人，2002年;Sanna等人，2002年;Tang等人，2002年;Alarcon等人，2004年;Kelleher等人，2004年;Banko等人，2005年;Tsokas等人，2005年,2007). 有趣的是，S6K1的激活已被证明在刺激神经递质受体或诱导蛋白合成依赖性LTP后发生，在某些情况下，已观察到激活的S6K在树突棘特定区域的动态定位(Cammalleri等人，2003年;Francesconi等人，2004年;Lenz和Avruch 2005;Tsokas等人，2005年,2007;Gonzalez-Meja等人，2006年;Page等人，2006年). 众所周知，在LTP诱导后不久，核糖体蛋白S6的磷酸化和5′TOP编码蛋白延伸因子1A、延伸因子2、多聚腺苷化结合蛋白以及S6本身的合成发生(Kelleher等人，2004年;Tsokas等人，2005年,2007).

因此，多条证据支持S6K在突触可塑性以及学习和记忆中的独特作用。与此假设一致，背景恐惧记忆训练导致S6磷酸化增强(Kelleher等人，2004年). 此外，已知mTOR、PI3K和ERK抑制剂都能降低S6K的激活，从而抑制关联恐惧记忆的表达和空间学习的保持(Atkins等人，1998年;Selcher等人，1999年;Chen等人，2005年;Bekinschtein等人，2006年;Dash等人，2006年;Horwood等人，2006年;Parsons等人，2006年). 最后，在一些记忆任务的训练后，S6K1的磷酸化在几个大脑区域增强(Bellelovsky等人，2005年;Bekinschtein等人，2006年;Dash等人，2006年;Parsons等人，2006年).

为了确定S6K在认知过程中的作用，我们使用了S6K1或S6K2缺陷的基因工程小鼠，并测量了它们在多项学习和记忆任务中的表现。我们还分析了S6K1和S6K2缺陷小鼠的不同形式的突触可塑性。我们的结果表明，在学习、记忆和海马突触可塑性方面存在选择性损伤，这是每个S6K基因去除所特有的。这些研究表明，S6K1和S6K2对行为学习和海马突触可塑性的正常表达有不同的贡献。

结果

巴甫洛夫式恐惧条件反射包括将有害刺激（美国足部电击）与条件反射刺激（听觉线索，CS）配对，在一次训练试验后会形成长期恐惧记忆。训练前后输注蛋白质合成抑制剂会导致啮齿动物恐惧记忆表达的选择性缺陷（有关综述，请参阅Klann和Dever 2004). 这表明，如果S6激酶参与蛋白质合成，S6K1或S6K2基因缺失的小鼠可能会出现恐惧记忆表达缺陷。因此，我们最初评估了S6K1或S6K2缺陷小鼠在关联恐惧条件反射中的表现。在训练S6K小鼠的任一基因型期间测得的恐惧行为与野生型小鼠在最初探索小室和接触第一个线索-电击配对期间的恐惧行为相当。这表明，S6K缺陷小鼠在短暂探索腔室期间表现出相似的行为，并且能够对痛苦的经历作出反应(图1A、B). 在最后一次提示后，恐惧行为的表达出现轻微缺陷——训练期间的电击配对(图1A、B). 这种缺陷不太可能是由于疼痛敏感性降低所致，因为当进行足电击痛阈值测试时，S6K缺陷小鼠对野生型小鼠表现出类似的反应（数据未显示）。S6K1-和S6K2缺陷小鼠在最后一次线索-电击配对过程中的反应略有下降，这表明它们在这一联想任务中有轻微的习得性学习障碍。然后，通过在训练后一小时、一天或七天将老鼠放回调节室，测试它们在一段时间内对上下文信息的保留（上下文测试）。我们观察到，S6K1缺陷小鼠在训练后一小时就表现出上下文恐惧记忆的减少(图1C). 相比之下，S6K2基因敲除小鼠在训练后7天表现出上下文恐惧记忆的缺失，而野生型同窝小鼠的冻结程度从第一天开始增加(图1D). S6K2缺陷小鼠在上下文恐惧记忆方面的表现没有改善，这表明它们在长期记忆巩固方面存在缺陷。在这些任务中，在S6K1和S6K2杂合敲除小鼠中发现了类似的情境特异性恐惧损伤（数据未显示），这表明这些基因中的任何一个都需要充分表达才能形成足够的记忆。与周围恐惧记忆的损伤相比，S6K1和S6K2缺陷小鼠在训练后两小时、一天或七天呈现听觉线索期间的冻结与野生型小鼠相当(图1C、D). 重要的是，S6K1和S6K2缺陷小鼠在呈现听觉线索期间的表现与野生型小鼠没有区别，这表明S6K1或S6K2缺失小鼠能够正确获得和表达习得性恐惧。因此，S6K1和S6K2是获取和巩固正常情境而非线索恐惧记忆所必需的。

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S6K基因敲除小鼠表现出特定情境的关联恐惧记忆缺陷。(一,B类)S6K1敲除（KO）(一)，S6K2 KO系列(B类)和野生型（WT）小鼠在训练箱中暴露3分钟（探索）和第一次提示后2分钟（电击配对）表现出类似的行为反应。第二次线索-电击配对（Shock2）后2分钟，S6K1 KO和S6K2 KO小鼠与WT小鼠相比达到阈下最大冷冻行为（Shock2:S6K1 WT:94±4%，n=24；S6K1 KO:74±9%，n=22；S6K2 WT:83±4%，n=31；S6K2KO:63±7%，n=29）。(C类)在上下文测试中，S6K1 KO小鼠在训练后一小时（1H）和一天（1D）表现出较少的恐惧记忆（1H:WT=77±6%，n=12；S6K1 GO=41±5%，n=1；1D:WT=88±12%，n=12。(D类)在上下文测试中，S6K2 KO小鼠在训练后7天（7D）表现出轻度缺陷表达。这种明显的缺陷可能反映了在S6K2 KO小鼠中未观察到的WT小鼠的性能改善（1D:WT=68±6%，n=18；S6K2 GO=62±6；7D:WT=82±8%，n=12；S6K2KO=57±10%，n=7）。S6K2 KO小鼠的听觉线索记忆正常。有趣的是，S6K1和S6K2杂合KO小鼠也表现出与S6K1 KO和S6K2 KO小鼠相比的上下文恐惧记忆缺陷（数据未显示）。(**,P（P）<0.001和*，P（P）与同一时间点的WT同窝小鼠相比，<0.05。#，P（P）与WT小鼠在1小时时的表现相比，<0.05t吨-测试。）

在新奇味觉学习20分钟内，在岛叶皮层观察到蛋白质合成信号分子的变化(Bellelovsky等人，2005年). 与这一发现相一致的是，S6K亚型磷酸化显著增加与味觉学习有关(Bellelovsky等人，2005年). 这些发现表明S6K亚型的缺失可能会改变味觉记忆的表达。为了检验这种可能性，S6K阴性小鼠暴露于一种新的液体味道（0.5%糖精），一小时后与氯化锂注射液配对，以在条件味觉厌恶（CTA）任务中诱发轻度疾病。在条件反射期间，S6K1和S6K2缺陷小鼠与野生型小鼠消耗了相似数量的新奇味道，表明味觉消耗是正常的(图2A、B). 然而，S6K1缺陷小鼠对与氯化锂搭配的新奇味道的厌恶指数较低(图2C). 为了测试厌恶记忆的强度，将S6K1缺陷小鼠再次暴露于这种新奇的味道下，进行多次实验。测定的消光曲线表明S6K1基因敲除小鼠的厌恶性味觉记忆很脆弱(图2D). 为了确保S6K1缺陷小鼠保持正常的味觉反应，并能够表达厌恶味道，在多次试验中提出了奎宁，一种通常厌恶的味道。S6K1基因敲除小鼠对奎宁的厌恶指数与野生型小鼠相当（数据未显示）。与S6K1缺失小鼠的强烈缺陷相反，S6K2缺失小鼠在CTA后表现出正常的味觉厌恶(图2E). 然而，预先暴露新味道（潜在抑制[LI]）并没有改变S6K2缺陷小鼠的厌恶感，这导致野生型小鼠厌恶感显著降低(图2E). 这一发现表明S6K2是一种新的味觉体验的长期记忆所必需的。综上所述，这些结果表明S6K1和S6K2都是正常联想味觉学习所必需的。

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S6K基因敲除小鼠存在味觉学习缺陷。(一)S6K1基因敲除组（KO）和野生型（WT）在新的味觉训练过程中消耗的水/0.5%糖精的比率具有可比性（S6K1 KO:1.158±0.197，n=5；WT:0.972±0.107，n=7；t检验；P（P）= 0.529). (B类)同样，S6K2 KO和野生型之间的这一比率没有差异（S6K2 GO:0.859±0.092，n=7；WT:0.848±0.087，n=8；t检验；P（P）= 0.096). (C类)与野生型小鼠相比，S6K1敲除小鼠对与LiCl配对的新口味（0.5%糖精）的厌恶程度较低（WT=0.78±0.04，n=5；S6K1 KO=0.62±0.05，n=7）。(D类)四天的灭绝训练表明，S6K1 KO小鼠的味觉厌恶程度与WT小鼠不同（灭绝系数：WT=-0.07±0.03；S6K1 GO=-0.18±0.02）。然而，S6K1 KO小鼠能够表达对0.04%奎宁的自然厌恶，表明味觉反应是完整的（数据未显示）。(E类)S6K2 KO小鼠表现出正常的味觉厌恶（CTA测试：WT=0.86±0.05，n=5；S6K2 GO=0.77±0.11，n=5.）。然而，在CTA训练课程之前，两次预先接触这种新奇味道的实验表明，S6K2 KO小鼠保持着较高的厌恶指数（潜在抑制，LI-右侧），而WT小鼠则没有（LI测试：WT=0.42±0.10，n=7；S6K2 KO=0.71±0.04，n=7.）。(*,P（P）与WT室友和学生的室友相比，<0.05t吨-测试）。

空间学习是一种复杂的行为，需要多模态的感官处理，主要依赖海马体，需要蛋白质合成才能实现正常表现。为了测试S6K亚型在空间学习中的可能作用，在Morris水迷宫任务中训练S6K1和S6K2缺失小鼠。在Morris水迷宫训练期间，S6K1和S6K2缺陷小鼠在七天内实现了相似的潜伏期(图3A、B). 在训练的第三天和第七天，平台被移除，通过测量小鼠的搜索模式对其进行探针试验。S6K1和S6K2缺陷小鼠对先前包含平台的水池的目标象限表现出类似的偏好(图3C、D). 空间选择性还通过交叉次数和在平台准确位置花费的时间进行测量。S6K1缺陷小鼠在第三天穿越平台的次数更少，在精确的目标位置停留的时间也更少，但在第七天时未检测到这种损伤(图3E、F). 相反，在两次探针试验中，S6K2缺陷小鼠的表现与野生型小鼠相当(图3G，H). 在60秒游泳测试中，S6K1空白小鼠的游泳速度保持在对照小鼠的～90%(图3I). 尽管存在这种轻微的缺陷，S6K1缺陷小鼠在可见平台版本的水迷宫中的表现与野生型小鼠相似(图3J)并在训练中取得了正常表现(图3A). S6K2缺乏小鼠保持正常游泳速度(图3K)并在可见平台任务中表现良好(图3L). 总之，这些发现表明，在Morris水迷宫任务中，S6K1是获得准确空间学习的最佳条件，而S6K2不是空间学习的必要条件。

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S6K1基因敲除小鼠在莫里斯水迷宫中有适度的空间学习缺陷。(一,B类)S6K1淘汰赛（KO）中的训练延迟是正常的(一)和S6K2 KO(B类)老鼠。(C类,D类)第三天和第七天训练结束时进行的探针试验表明，与S6K1 KO中相邻（Adj）和相对（Opp）象限相比，KO小鼠对包含平台（Target）的象限表现出正常偏好(C类)和S6K2 KO(D类)老鼠。第3天在目标象限花费的时间百分比：WT=50±2，n=27；S6K1 KO=47±3，n=24；重量=42±4，n=20；S6K2 KO=46±3，n=20。第7天在目标象限花费的时间百分比：WT=57±3；S6K1 KO=60±3；重量=43±4；S6K2 KO=50±3。(E类)S6K1 KO小鼠在第3天对平台的确切位置表现出空间记忆缺陷（通过平台交叉的数量测量），但在第7天表现出正常记忆。(F类)S6K1 KO小鼠在第3天在平台上停留的时间也更少，但在第7天没有。第3天，分别在目标位置花费的平台穿越次数和时间（秒）：WT=3.2±0.4和1.41±0.09；S6K1 KO=2.3±0.3和0.96±0.14；第7天：WT=4.80±0.04和2.1±0.2；S6K1 KO=4.7±0.4和2.1±0.2。(G公司)S6K2 KO小鼠在第3天和第7天通过平台时表现出正常的空间记忆。(H（H）)同样，在第3天和第7天的探针试验期间，S6K2 KO小鼠在平台位置度过了正常时间。(一、 K（K）)S6K1 KO小鼠在60s试验期间游泳速度出现轻度损伤（体重的88.7±5.3%），这在S6K2 KO小鼠中不明显。(J、 L（左）)为了测量水迷宫中的视觉敏锐度和动机，将一条可见的线索放在游泳池新区域的水下平台上，并在四次训练试验中测量平台的潜伏期。在莫里斯水迷宫的可视平台版本中，S6K1 KO(J型)和S6K2 KO(L（左）)他们能够达到类似的训练潜伏期，证明视力和动机行为是正常的。(*,P（P）与WT窝友相比<0.05）。

由于探索行为、运动功能和焦虑会影响小鼠在联想学习任务中的表现，因此对这些参数进行了基本测量。S6K1和S6K2缺陷小鼠在野外任务中表现出运动活动和焦虑。在这个测试中，老鼠在一个明亮的盒子里探索了30分钟，同时通过自动捕捉激光束的断裂来测量它们的运动。一般来说，大多数老鼠在探索盒子时都会有丰富的垂直和水平动作、抬头和偶尔的刻板行为（例如梳洗）。我们观察到S6K1基因敲除小鼠在这项任务中表现出明显的低活性。与野生型同窝出生的小鼠相比，S6K1缺陷小鼠的水平和垂直运动次数、每次运动的持续时间以及行进的总距离显著减少(表1). 这项行为任务的另一个方面是确定焦虑的总体水平，因为众所周知，焦虑过度的小鼠在盒子明亮中心的时间明显少于在不太明亮的外围的时间。我们发现S6K1突变小鼠表现出正常的焦虑水平，因为其在中心和外围的时间比例与野生型同卵鼠相当(表1). 与这些发现相反，S6K2阴性小鼠在所有测试任务中均正常(表1). 为了确定S6K1基因敲除小鼠探索行为的缺陷是否是身体运动障碍或缺乏动机兴趣的结果，我们进一步测量了旋转杆任务的运动协调和能力。在这项任务中，小鼠被放置在一个加速旋转的杆上，在连续的试验中测量跌倒的潜伏期。在八次试验中，所有小鼠都表现出类似的学习曲线(表1). 这些结果表明，当S6K1缺陷小鼠受到挑战时，它们能够正常的运动学习和表现。

表1。

S6K基因敲除小鼠的运动和焦虑行为

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S6K1基因敲除小鼠具有异常的低活性探索行为。开放字段行为：小鼠被放置在一个明亮的盒子中央，在30分钟内自动跟踪运动。S6K1基因敲除（KO）小鼠在所有运动测量中都显示出缺陷。相比之下，S6K2 KO小鼠与野生型小鼠在相同的运动测量方面具有可比性。由于小鼠倾向于避开开阔场地的中心，因此，与周围相比，在中心移动的时间百分比被用作衡量焦虑程度的指标。S6K1 KO和S6K2 KO动物在盒子中央的时间比例与野生型相当，这表明S6K1和S6K KO小鼠的这种行为都是正常的。应该注意的是，每个菌株的野生型小鼠之间的菌株特异性差异是明显的。旋转杆性能：将小鼠放在一个以4 rpm开始的旋转杆上，每20秒递增加速一次，直到最后40 rpm，然后记录下落的延迟时间。在两天内进行了八次试验（4次试验/天，试验间隔为1小时）。在初始试验和最终试验期间，S6K1 KO和S6K2 KO小鼠在旋转杆任务中表现正常。S6K1 KO、S6K2 KO和各自的野生型同卵双胞胎之间的学习曲线无法区分（数据未显示）。与以往报道一致，S6K1 KO小鼠体重下降（野生型86±5%，P<0.05），而S6K2 KO小鼠保持正常体重（野生型102±4%，P>0.05）(Shima等人，1998年;Pende等人，2004年). 然而，这种尺寸上的损伤并不影响旋转棒任务的性能。

一水平和垂直活动是Versamat软件中系统定义的变量。

b条P（P）<0.001，学生的t吨-测试。

c（c）P（P）<0.05与学生的t吨-测试。

众所周知，海马体对周围恐惧学习的表达很重要，这项任务揭示了S6K突变小鼠的选择性缺陷（参见图1A、B). 这让我们研究了海马体突触可塑性的表达，这通常被认为是记忆的一种可能的细胞相关性。首先，我们检查了S6K1和S6K2缺陷小鼠海马的基本神经解剖学，并量化了基础突触传递。（1）海马体大体形态未见异常(图4A)，（2）Schaffer侧支CA1突触记录的输入/输出曲线中测量的突触传递(图4B、C)（3）配对脉冲突触易化，一种短期突触前可塑性的测量(图4D，E). 这些发现表明S6K突变小鼠是研究长期突触可塑性的合适模型。

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在S6K敲除小鼠中，海马的大体形态和Schaffer侧支通路中突触传递的基本测量是正常的。(一)海马体尼塞尔染色显示WT(左边)、S6K1淘汰赛（KO）(中间的)和S6K2 KO(正确的)具有相似的海马结构。(B类,C类)对于每个切片，以递增强度（0–15 V）传递刺激，并测量纤维抽射（输入）的振幅，作为递增纤维刺激大小的指示。群体场兴奋性突触后电位（fEPSP）的初始斜率（纤维束停止后0.2–0.3毫秒）也被评估为输出指标。(B类)纤维抽射幅度（输入）与诱发fEPSP斜率（输出）的比较显示出一条与S6K1 KO（R2=0.997，n=15片）和WT片（R2=0.999，n=15片）。(C类)在S6K2 KO（R2=0.999，n=14个切片）和WT切片（R2=0.974，n=14片）。(D类,E类)在10到300毫秒的上升刺激间隔内进行配对刺激，以检查突触前易化。每对的第二个响应的振幅除以第一个，并绘制为第一个和第二个脉冲之间时间的函数。在S6K1 KO的海马脑片中，配对脉冲促进作用无法区分(D类)和S6K2 KO(E类)老鼠。

接下来，我们研究了两种形式的持久性突触可塑性，这两种突触可塑性之前曾被报道需要蛋白质合成：由4组高频刺激（HFS）引发的L-LTP，或由3组θ突发刺激（TBS）诱发的L-LTP。在以前的研究中，无论是一般的蛋白质合成抑制剂茴香霉素还是mTOR抑制剂雷帕霉素（选择性地降低S6K活性），在最后一系列刺激后1至2小时，都会降低L-LTP(Nguyen和Kandel 1997年;Alarcon等人，2004年;Kelleher等人，2004年;Banko等人，2005年). 相反，在最后一批HFS治疗后的三小时内，我们观察到S6K1或S6K2缺陷小鼠的L-LTP没有降低(图5). 两组HFS诱导的L-LTP也对雷帕霉素和茴香霉素敏感，并伴有S6K1的选择性磷酸化(Cracco等人，2005年;Tsokas等人，2005年). 因此，我们在S6K1缺陷小鼠中检测到这种LTP，并观察到它也正常表达(图6A). 为了进一步证实S6K1缺陷小鼠的L-LTP正常，我们在诱导后4.5小时监测其表达(图6B). 我们的研究结果表明，S6K缺陷小鼠的L-LTP并没有如人们预期的那样出现缺陷。

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L-LTP在S6K基因敲除小鼠中正常表达。(一,B类)S6K1基因敲除（KO）小鼠（开环，n=7片，7只小鼠）与野生型（WT）同窝小鼠（实心圆，7片，七只小鼠）相比，用四个间隔的HFS序列诱发的L-LTP正常表达(A）在S6K2 KO小鼠中（开放方形，n=8片，8只小鼠）与WT同窝小鼠（实心方形，n=6片，6只小鼠）进行比较(B类). (C类,D类)S6K1 KO小鼠（开圈，n=7片，7只）与WT小鼠（实心圈，5片，5只）相比，3组θ-突发刺激（TBS）诱发的L-LTP也正常表达(C类)和S6K2 KO小鼠（方形，n=10片，9只）与WT小鼠（实心方形，n=10片，8只）的比较(D类). 显示的代表性痕迹在上面每张图都是在10分钟前拍摄的(一)170分钟后(b条)L-LTP的诱导。

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L-LTP在S6K1基因敲除小鼠中正常表达。(一)用2组100 Hz的序列（序列间间隔30秒）诱发L-LTP，并在诱导后60分钟进行监测。S6K1基因敲除（KO）（开环，n=8片）和野生型（WT）（实心环，n=13片）无差异。比例尺，200毫秒，0.5毫伏(B类)同样，在S6K1 KO（开环，n=10片）和WT（实心环，n=10片）诱导后的300分钟内，用4列间隔100Hz的刺激序列（5分钟的脑间间隔）诱发的L-LTP未显示出明显差异。在底部在该小组中，S6K1 KO切片（开放三角形，n=10切片）的基本反应与未模拟切片在类似时间过程中的WT（实心三角形，n=10切片）相似。LTP诱导前后的代表性痕迹显示给正确的每个图的。比例尺，400毫秒，0.5毫伏。

由于稳健的诱导方案并没有改变S6K缺陷小鼠中L-LTP的表达，因此我们继续确定用一系列HFS诱导的早期LTP（E-LTP）在这些小鼠中是否发生了改变，这类HFS通常不依赖蛋白质合成。我们观察到S6K1缺陷小鼠中的E-LTP比野生型小鼠中的E-LTP更短暂(图7A). 相反，S6K2突变小鼠的E-LTP与野生型小鼠的E-LTP无法区分(图7B). 我们的结果表明，S6K1（而非S6K2）唯一参与海马中蛋白质合成依赖性E-LTP。

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S6K1基因敲除小鼠E-LTP缺乏。(一)将一系列HFS送到S6K1 KO小鼠或WT同窝小鼠的切片中，并在100分钟后监测fEPSP。(插入)将数据分为20分钟增量的列，并按照x轴上的大图形所示进行标记，并在y轴上进行折叠增加。在LTP诱导后20–60分钟，S6K1 KO小鼠（8只小鼠中有11片为开环和条形，n=11片）与WT小鼠（实心圆形和条形，n=9片，8只小鼠）相比表现出增强减弱。以基线fEPSP百分比表示的时间点值如下：HFS后20–40分钟：WT=150±14，S6K1 KO=118±2*P（P）< 0.05; HFS后40–60分钟：WT=147±15，S6K1 KO=112±3*P（P）< 0.05. HFS后60–80分钟，S6K1 KO切片中的增强恢复到基线水平（S6K1 GO=110±10，P（P）>与基线相比，0.05），而诱导后80–100分钟，WT切片中的增强恢复到基线（图中未显示数据：WT=120±11，P（P）>与基线相比为0.05）。(B类)相同的诱导方案显示，与WT小鼠（实心方形和条形，n=8片，8只小鼠）相比，S6K2 KO小鼠的切片中E-LTP正常。(一,B类)代表性跟踪10分钟前(一)，45分钟后(b条)，感应显示在正确的。使用配对的双尾Student’st吨-测试。

由于在S6K1缺陷小鼠中蛋白质合成依赖的L-LTP没有改变这一令人惊讶的结果，我们检测了诱导L-LTP后S6K1缺乏小鼠中S6K1的上游调节器或下游效应器是否存在代偿性变化。与之前的调查结果类似(Sanna等人，2002年;Kelleher等人，2004年;Tsokas等人，2007年)，我们发现L-LTP诱导后野生型小鼠中Akt和S6磷酸化显著升高(图8). 在S6K1缺乏小鼠的切片中，L-LTP诱导适度升高了S6磷酸化，但升高没有统计学意义(图8A、B). 我们还观察到S6K1缺陷小鼠切片中基础Akt磷酸化和L-LTP诱导的Akt磷酸化显著增强(图8A、C). S6K1缺乏小鼠表达正常水平的基础S6磷酸化(图8A、B). 值得一提的是，其他激酶也可以磷酸化我们检测的S6磷酸化位点，并且可以通过增强该位点的磷酸化来弥补S6K1的缺失(Roux等人，2007年). 与最近对大鼠海马脑片的研究相反(Tsokas等人，2007年)，在L-LTP诱导后，我们没有观察到S6水平的增加。我们的研究结果表明，去除S6K1导致磷酸化Akt的基础水平升高，在L-LTP诱导后进一步升高。

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S6K1缺陷小鼠的磷酸化Akt基础水平增加，在L-LTP诱导刺激后进一步增强。将来自野生型（WT）或S6K1敲除（S6K1 KO）小鼠的海马切片置于记录室中，并给予测试脉冲或L-LTP诱导刺激（四列100Hz刺激，间隔5分钟）。在发出刺激（4×HFS）后10分钟或在接收试验脉冲（对照）的同等时间后取出切片，冷冻并进行显微解剖；CA1立即均质并用所示抗体进行蛋白质印迹分析。(一)Ser 473磷酸化Akt（p-Akt）、总Akt、Ser235/Ser236磷酸化核糖体蛋白S6（pp-S6）、总核糖体蛋白质S6（S6）和70-kD亚型S6K1（p70S6K1）的代表性Western blot。(B类)4×HFS后，WT切片中S6的磷酸化水平显著增加（实心棒，对照=100±12%，4×HFS=158±14%，n=3*P（P）< 0.05). 相反，在4×HFS后，S6K1 KO切片中观察到S6的磷酸化水平略有增加，但没有统计学意义（开条，对照=119±11%，4×HFS=142±20%，n=3，P（P）= 0.11). pp-S6的免疫反应性归一化为总S6。数值为平均值±SEM，并绘制为%野生型对照。(C类)4×HFS后WT切片中Akt的磷酸化水平显著增加（实心棒，对照=100±4%，4×HFS=134±16%，n=4*P（P）< 0.05). 与有或无L-LTP诱导刺激的WT小鼠相比，S6K1 KO小鼠的磷酸化Akt水平异常升高（开放栏，对照组=135±16%，4×HFS=232±48%，n=4*P（P）< 0.05). p-Akt的免疫反应性归一化为总Akt。数值为平均值±SEM，并绘制为%野生型对照。统计数据采用单向方差分析进行计算，对原始数据进行多次比较，然后在适当的情况下进行Tukey检验。

讨论

我们的行为研究表明，S6K1缺陷小鼠在基于多项任务的记忆获取方面存在特定缺陷。训练后一小时，情境恐惧记忆就受损(图1C)，厌恶性条件味觉记忆在消退训练中表现不佳并迅速退化(图2C、D)，适度训练后不能正确获得精确的空间记忆(图3E、F). 同时，我们发现S6K1缺陷小鼠的E-LTP也受损(图7A). 令人惊讶的是，蛋白质合成依赖性L-LTP在S6K1缺陷小鼠中是完整的(图5A、C,6A、B)，表明S6K1可能不需要用于合成耐受LTP所需的从头开始蛋白质。总之，这些发现表明S6K1对记忆和可塑性的早期阶段至关重要，而这些早期阶段是这些过程中持久的突触修饰的先决条件。

有趣的是，我们发现S6K1缺陷小鼠海马脑片中磷酸化Akt的基础水平升高，在L-LTP诱导的刺激下进一步升高(图8A、C). 这一发现与S6K1缺乏小鼠由于失去了从S6K1延伸至胰岛素受体底物1（IRS1）的负反馈回路而免受衰老和饮食相关肥胖的影响的观察结果一致(Um等人，2004年). 新的报告支持S6K1通过涉及IRS1磷酸化的类似负反馈机制直接调节Akt活性(Radimerski等人，2002a,b条;Um等人2004). S6K1缺陷海马中Akt升高可能表明酪氨酸激酶的胰岛素受体家族正常参与海马LTP的表达。胰岛素受体家族信号通路抑制剂可显著降低与L-LTP受损相关的PI3K–Akt活性，这一发现进一步支持了这一观察结果(Townsend等人，2007年). 同时，众所周知，表达LTP需要Akt活性(Sanna等人，2002年). 综上所述，这些观察结果表明，由于S6K1缺陷小鼠具有较高的Akt活性，所以L-LTP在S6K1缺乏小鼠中得以保留。

在我们对S6K1缺陷小鼠的研究中，我们惊讶地发现E-LTP而非L-LTP出现缺陷(图5A,​、6A、，6A级,​，7A）。第7章). 这表明E-LTP需要S6K1底物的磷酸化，而不是直接参与翻译控制，因为E-LTP通常与蛋白质合成无关。在这方面，S6K1的候选底物是神经纤维蛋白，这是一种突触细胞骨架蛋白，已被证明与S6K1结合(伯内特等人，1998年). E-LTP是否需要S6K1-neurabin相互作用尚待确定。

E-LTP通常与多种蛋白激酶的激活有关(Soderling和Derkach 2000)在L-LTP诱导过程中，类似的激酶补体可能被激活，以募集更多直接调节蛋白质合成机制的信号通路(Abel等人，1997年;Atkins等人，2005年). 我们的研究结果表明，在缺乏S6K1的情况下，PI3K–Akt–mTOR信号转导途径能够通过选择性底物调节促进正常蛋白质合成能力。除S6K1外，影响蛋白质合成表达的PI3K–mTOR途径的主要靶点是eIF4E结合蛋白（4E-BP）。通过PI3K–Akt–mTOR信号通路使4E-BP磷酸化，释放隔离的eIF4E，促进cap-binding复合物的形成和随后的翻译。此外，小鼠海马中4E-BP的主要亚型4E-BP2的基因缺失导致L-LTP受损(Banko等人，2005年). 我们的数据支持这样的观点，即通过PI3K–Akt–mTOR途径磷酸化4E-BP，与L-LTP相关的蛋白质合成能力在S6K1缺陷小鼠中得以保留。

我们发现S6K1缺陷小鼠有许多学习和记忆障碍。S6K1缺陷小鼠中出现的情境特异性恐惧记忆损伤可能是由于缺乏正常的探索行为所致。野外测试中探索性动作的不足(表1)可能是因为之前在S6K1突变小鼠中报道的肌肉组织异常(Ohanna等人，2005年). 然而，S6K1基因敲除小鼠能够在旋转杆运动任务中取得最佳表现，并在隐藏和可见平台水迷宫训练中获得相似的潜伏期(图3A、J;表1). 因此，很难确定这种低积极性探索行为是由于肌肉损伤、缺乏对新颖事物的好奇，还是这些因素的综合作用。众所周知，在新环境中的探索行为会在海马体中产生错综复杂的位置细胞活动模式，这些活动与躯体感觉、嗅觉和视觉体验有关，对习得很重要(O'Keefe和Dostrovsky 1971年;奥基夫1993;Eichenbaum等人，1994年;Kentros等人，2004年). 这表明S6K1通常可以促进显著的经验依赖性语境信息获取。

与S6K1缺陷小鼠相比，S6K2缺陷小鼠表现出依赖长期记忆编码的行为缺陷。研究发现，S6K2基因缺失小鼠在训练后七天的情境恐惧记忆有轻微改变(图1D). 在CTA的潜在抑制中，S6K2敲除小鼠表现不佳，CTA需要在更长的时间内保持新奇的味觉学习(图2E). 这些发现表明，S6K2对于一次性学习任务所特有的长期记忆的编码非常重要。众所周知，S6K2高度局限于细胞核(Lee-Fruman等人，1999年;Park等人，2002年). 这一观察表明S6K2影响转录，转录与翻译类似，参与记忆形成的表达和L-LTP的表达。

有趣的是，利用多种诱导方案，S6K2缺陷小鼠没有表现出L-LTP表型(图5B、D,​，7B）。7亿). 这些发现支持了海马LTP不需要S6K2的假设。由于S6K2基因敲除小鼠的记忆表型表现，有必要进一步探讨S6K2在其他形式的突触可塑性中的潜在作用。我们的发现是，S6K2缺陷小鼠中CTA的潜在抑制被选择性地破坏，这表明可能与海马区不同的大脑区域有关。

在我们对S6K1和S6K2缺陷小鼠的行为分析中，还有其他问题需要考虑。为了保持生存能力，我们将每个菌株维持在各自的同源背景上。这种可能性仍然存在，这些菌株本身略有不同，这可能解释了S6K缺陷小鼠之间观察到的不同差异。然而，我们在野生型小鼠中观察到了可比较的行为反应，并且仅使用同窝小鼠来描述S6K缺陷小鼠的行为特征。另一个需要考虑的是，由于S6K1和S6K2是同源的，因此在我们的单个基因敲除中可能会出现每个基因的代偿性升高。我们发现S6K1蛋白在S6K2缺乏小鼠的整个海马匀浆中的表达没有改变（M.D.Antion和E.Klann，未证实）。在S6K1缺乏小鼠的许多身体组织中，S6K2 mRNA升高了许多倍(Shima等人，1998年). 然而，在S6K1缺陷小鼠的大脑中，S6K2 mRNA的水平仅增加了1.3倍(Shima等人，1998年). 这些发现，再加上我们对每只S6K突变小鼠独特的学习和生理表型的观察，表明在每只S6K-缺陷小鼠的大脑中不太可能发生代偿功能。

总之，我们的发现表明S6K1-和S6K2-突变小鼠在学习、记忆和海马突触可塑性方面存在不同的缺陷。这些S6激酶的具体功能可以从我们的研究中推断出来，并且这些功能很可能来源于每个S6激酶在大脑中的独特定位和调节。已知S6K1定位于细胞核和细胞液中，而S6K2主要局限于细胞核(Lee-Fruman等人，1999年;Park等人，2002年). 重要的是，最近已确定S6K1的特定绑定合作伙伴，但S6K2未共享(Richardson等人，2004年;Holz等人，2005年;Ruvinsky和Meyuhas 2006). 有趣的是，核糖体蛋白S6磷酸化位点缺陷小鼠表现出的表型包括体重减少和细胞增殖，这让人想起S6K1缺陷小鼠(Ruvinsky等人，2005年). 这表明S6是S6K1而非S6K2的关键底物，因为S6K2缺陷小鼠不具备这一特征。与对S6K1进行的丰富研究历史相比，对最近发现的S6K2的了解较少。与S6K1缺陷小鼠相比，S6K2缺失小鼠没有任何明显的物理表型。然而，除S6K1外，移除S6K2会导致小鼠围产期死亡，这表明S6K2可能具有重要的生理功能(Pende等人，2004年). 值得注意的是，S6K2包含几个独特的结构特征，可能赋予不同于S6K1的功能特异性。例如，S6K2中存在S6K1中未找到的类似SH3的绑定域(痛风等，1998年). 需要进一步研究每个S6激酶的选择性激活，以了解单个S6激酶对认知加工的贡献。

材料和方法

S6K1和S6K2缺陷小鼠

S6K1和S6K2同源基因敲除小鼠是通过将每个基因替换为新霉素盒来创建的，新霉素盒导致每个基因的直接缺失，如前所述(Pende等人，2004年). S6K1突变小鼠最初在129/SveJ×C57Bl/6混合系上产生(Shima等人，1998年)，S6K2突变小鼠最初是在129/OlaHsd×C57Bl/6混合系上产生的(Pende等人，2004年). 每种小鼠品系在接收时至少两次与C57Bl6/J小鼠交配，并保持在各自的同源系上，尽量减少近亲繁殖。这样做是为了保持杂种的活力，因为我们观察到在第四次与C57Bl6/J小鼠回交后，活的敲除小鼠数量减少。在所有研究中，将每个菌株的杂合子小鼠进行杂交，以产生野生型、杂合子敲除和纯合敲除小鼠。如前所述，通过PCR尾消化物对小鼠进行基因分型(Shima等人，1998年;Pende等人，2004年). 所有小鼠均按照贝勒医学院动物护理和使用委员会的指南进行治疗。在行为测试中，所有的室友在三到五个月大时进行评估。在大多数情况下，杂合小鼠的表现与野生型小鼠相似，除非文中另有说明。

联想学习和记忆

对于关联恐惧学习，给小鼠3分钟时间探索一个调节室，然后在30秒90-dB白噪声之前接受两次间隔为2毫秒、0.9毫安的足部电击。恐惧记忆是通过一个动作感应相机测量的，它记录了老鼠不动（冻结）的时间百分比。对于上下文记忆，将小鼠放回调节室5分钟。对于线索恐惧记忆，在上下文测试后1小时，将小鼠置于新环境中3分钟，然后暴露于听觉线索3分钟。对于条件性味觉厌恶症（CTA），将糖精（0.5%）作为一种新的味觉给维持缺水时间表的小鼠，并在1小时后腹腔注射氯化锂（0.14 M，2%体重）以产生不适感。两天后，给小鼠提供水或糖精的选择，并测量液体的消耗量。厌恶指数定义为试验中消耗的水/（水+糖精）（单位：mL）。在潜在抑制范式（LI）中，除了小鼠在糖精与氯化锂注射液配对之前预先暴露于糖精两次外，其余小鼠均按CTA处理。在训练后连续三天重复厌恶测试，以测量消亡系数。对于自然味觉厌恶，小鼠可以在水和0.04%奎宁（一种厌恶的味道）之间进行选择。

莫里斯水迷宫

训练小鼠在一池水（直径1.38米）中找到一个淹没的平台（10×10平方厘米），周围有视觉上明显的线索，为期七天，每天进行四次试验。在第三天和第七天的训练结束时，移除平台，并用Noldus Ethovision软件在1分钟内测量小鼠的游泳路径。

野外评估

将小鼠置于一个明亮的房间（43×42×30 cm）的中央，允许其探索30分钟。活动由自动计算机系统程序（Versamax，Accusan Inc.，Columbus，OH）跟踪。

电生理学

海马切片是用前面描述的方法制备的(Hou和Klann 2004). 切片在30°C的加湿接口室中培养，该接口室灌注有含氧ACSF（mM:125 NaCl，2.5 KCl，1.25 NaH）2人事军官4，25氯化钠三，25葡萄糖，1 MgCl2，2氯化钙2含95%O气体2/5%一氧化碳2)至少在录制前两小时。在所有记录中，将双极铂刺激电极置于Schaffer侧支上，并用玻璃微吸管（1–5 MΩ）在放射层中测量场电位。切片接受的刺激强度范围为0–15 V，频率为0.33 Hz，总持续时间为0.05毫秒。通过Patchclamp版本8.2分析收集的所有信号。产生40%-50%最大fEPSP的测试脉冲每20秒发送一次，平均超过2分钟。在所述刺激前20分钟测量基础反应。对于E-LTP的诱导，以50%的最大强度进行1秒的100Hz HFS序列。对于L-LTP，以5分钟的列车间隔交付了四列HFS。L-LTP也通过两种替代方案诱导：三列TBS（10次100Hz刺激，持续时间为50毫秒，以5 Hz频率交付），列车间隔为20秒，或两列HFS，列车间隔30秒。

蛋白质印迹

在交付四列HFS 10分钟后，立即将切片冷冻在干冰上，并在含有以下成分的冰冷缓冲液中对CA1区进行显微切割和均质化：10 mM HEPES、150 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM-EGTA、10 mM Na4P（P）2O（运行）7和10μl/mL以下每种抑制剂：蛋白酶抑制剂混合物1、磷酸酶抑制剂混合物1和磷酸酶抑制剂化合物2（西格玛，圣路易斯，密苏里州）。对于每个样品，将5-6个显微切片汇集在一起。测定蛋白质含量，并通过SDS-PAGE对样品进行解析，并在甲醇基TRIS–甘氨酸–SDS缓冲液中将样品印在聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。将每个一级抗体悬浮在总体积为5-10 mL的0.2%的TTBS（0.1%吐温20）中的I-Block中，并在膜上培养，在室温下剧烈混合2小时或在4°C下过夜。所有初级抗体均来自Cell Signaling Technology（马萨诸塞州贝弗利）：Ser235/236 S6单克隆兔D57.2.2E（1:2500）；S6单克隆兔5G10（1:2000）；Ser 473 Akt单克隆小鼠587F11（1:1000）；泛阿克特（1:1000）；和p70S6K（1:1000）。在TTBS中至少冲洗膜3次，每次5分钟，并在室温下在I-Block中结合辣根过氧化物酶（1:5000）的二级抗体中再培养1-2小时。在最后一组TTBS冲洗后，将膜悬浮在ECL液中1–5分钟，并将其暴露在柯达XOMAT膜中30 s至10分钟。使用Scion图像密度测定法（Scion，Frederick，MD）分析斑点。进行了单向方差分析，其中测量了实验内的多次比较，然后在适当的情况下进行了Tukey检验。P（P）<0.05被认为具有统计学意义。

致谢

S6K小鼠获得了NOVARTIS（瑞士巴塞尔）的许可。Richard Paylor博士和Corinne Spencer博士通过MRDRRC拨款协助BCM的行为核心。这项工作得到了NIH向E.K.提供的NS34007、NS047384和FRAXA研究基金的支持。

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文章来自学习与记忆由以下人员提供冷泉港实验室出版社