Syndecan-1和-4外体结构域的脱落受多种信号通路调控并由Timp-3敏感性金属蛋白酶介导

免疫化学物质

针对syndecan外结构域的抗体包括鼠抗小鼠syndecan-1外结构域mAb 281-2(Jalkanen等人，1985年)，兔抗重组小鼠syndecan-4外结构域多克隆抗血清MSE-4(Kim等人，1994年;Subramanian等人1997)以及针对重组人syndecan-1外结构域的小鼠单克隆抗体DL-101(Kainulainen等人，1998年). HRP-结合的驴抗大鼠IgG、HRP-山羊抗兔IgG，HRP-羊抗小鼠IgG和FITC-结合的链霉亲和素购自Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.或Organon/Cappel。

具有野生型或突变Juxtamembrane（JM）结构域的全长Syndecan-1融合构建物的生产

用于合成具有野生型和突变的膜旁结构域的全长syndecan-1的表达载体用于瞬时转染脱落分析。一种全长表达载体，其中包含来自LK444的全长鼠syndecan-1的HindIII片段(Kato等人，1995年)被插入pcDNA3（Invitrogen Corp.）的HindIII站点。通过限制性内切酶映射确定了正确的方向，并将该表达载体命名为syn1-WTJM。

为了获得一个假定的不可清除的syndecan-1突变体，syndecan-1的JM结构域跨越了Gln²³⁸至Gln²⁵²被替换为人类CD4（CD4-JM）相应JM结构域的氨基酸序列(Hodge等人，1991年)使用PCR和pfu DNA聚合酶。使用以下寡核苷酸：使用寡核苷酸A，5′-CAGCCCCCGGTGGACGGTCAAGGTCAAGTCTGCCC-3′和寡核苷酸B，5′GACACCTCCAGCACGGCCATGGCGCCAC-3′扩增含有人类CD4 cDNA的1225–1269核苷酸的人类CD4 JM区域。小鼠syndecan-1 cDNA中含有214-953核苷酸的syndecan-1的5′区(桑德斯等人，1989年)使用寡核苷酸C，5′-CACAAGCTTCCCGGCCGGTCTG-3′和D，5′-GGGCAGAACCTCCACCGGGCTGTG-3′扩增。使用寡核苷酸E，5′-CTTCTTAGGCGCAGACCAAAGGG-3′和F，5′-GTGCAATGCACGCGCCGCTGGGAGGTGTC-3′扩增了含有核苷酸995–1379的syndecan-1的3′区域。对这三个片段进行凝胶纯化，并使用PCR和pfu DNA聚合酶构建假定的不可切割结构。将产生的PCR产物亚克隆到pCR3载体（Invitrogen Corp.）中并测序。syndecan-1/CD4-JM片段亚克隆到pcDNA3的HindIII和BamHI位点，命名为syn1-CD4JM。

细胞系和培养条件

非粘附悬浮细胞系（浆细胞P3X63 Ag8.653[小鼠]和ARK[人类]；Ridley等人，1993年)用PMA刺激后进行免疫荧光和细胞混合实验。粘附细胞（NMuMG上皮细胞和SVEC4-10内皮细胞）用于检测脱落激动剂。在无血清培养基中使用PMA，并进行15–30分钟的孵育。在含有1%FCS的培养基中分析其他激动剂，并在测量成分脱落时常规孵育2或14小时。COS-7非洲绿猴肾细胞用于卵裂位点分析。

非粘附细胞在含有4.5 g/l葡萄糖（Mediatech）的RPMI 1640培养基中培养，补充10%热灭活FCS。贴壁细胞在含有4.5 g/l葡萄糖的DME（Mediatech）中培养，并补充10%（SVEC4-10）或7.5%（NMuMG）FCS（Intergen）。COS-7细胞在含有1 g/l葡萄糖的二甲醚中培养，并补充10%FCS。细胞在含有5%CO的加湿培养箱中培养₂.

Syndecan-1的细胞表面标记和荧光分析

将P3X63细胞与20μg/ml生物素化单克隆抗体281-2在冰上培养30分钟（防止脱落的条件），轻轻搅拌，在200℃离心洗涤两次克在4°C下去除未结合的单克隆抗体，并培养（10⁶细胞/管）在37°C下放置30分钟，有或没有0.5μM PMA。所有洗涤和孵育均在无血清RPMI 1640培养基中进行。处理后，将细胞在4°C的PBS中的4%多聚甲醛中固定15分钟，在PBS中洗涤，并在室温下与FITC-共轭链霉亲和素孵育30分钟。仅用FITC-链霉亲和素标记的细胞作为非特异性染色的对照。细胞在PBS中清洗，安装在ProLong Antifade（Molecular Probes，Inc.）中，并在配备外荧光和100×PlanApo油浸物镜的蔡司Axiopot显微镜上观察。样品是用柯达TMAX 400胶片在ASA 800曝光拍摄的。

脱落分析

粘附细胞在96孔组织培养板中培养汇合，用于PMA治疗和成分脱落分析，或在6孔板中与其他激动剂治疗。常规将非粘附细胞转移到1.5毫升微离心管（～10⁶细胞/管）用于PMA处理，如下所述。基本上按照前面所述进行脱落分析(Subramanian等人，1997年). 简言之，在试验时，在无血清（PMA治疗）或存在1%FCS（2小时和14小时试验）的情况下，用含有所示试验试剂的新鲜培养基替换培养基。细胞在37°C下培养15–30分钟（PMA处理）、2小时（其他激动剂）或14小时（组成性脱落）。孵育后，通过相位显微镜检查细胞的存活率和形态，并收获条件培养基进行斑点印迹分析。每孔使用100μl培养基进行三次96 well平板分析；使用90μl培养基进行斑点杂交分析。6孔板分析每孔含有600μl培养基，将其分为三等份进行斑点杂交分析。为了评估EGF和TRAP处理后细胞数量的变化，在一些检测中，细胞被胰蛋白酶化，并在孵育后用血细胞仪计数。对于使用高渗压、神经酰胺和鞘磷脂酶的分析，使用四氮唑盐（MTT）转化分析测定细胞活力(Hansen等人，1989年). 在每个实验中，不同处理后的细胞数量或存活率没有显著差异。所有分析至少进行两次。

为了确定导致脱落的蛋白水解酶活性是可溶性的还是膜相关的，将P3X63细胞与人类ARK细胞在37°C下共培养15分钟，这些细胞在37℃下用或不用0.5μM PMA预处理15分钟，并用无血清培养基冲洗两次。将细胞在1.5ml微型离心管中混合在一起，或通过Transwell插入物（6.5mm；Costar Corp.）将细胞彼此分离，该插入物包含具有0.4μm孔的聚碳酸酯过滤器。在细胞混合和Transwell分析中，恒定数量的P3X63细胞（5×10⁶)并使用不同数量的ARK细胞。将条件培养基分成三等份，用单克隆抗体281-2进行斑点杂交分析，检测未经处理的P3X63细胞分泌的syndecan-1。使用PMA处理的P3X63细胞和未处理的ARK细胞也进行了相同的检测，但使用单克隆抗体DL-101对条件培养基进行斑点杂交分析，以检测人syndecan-1。

为了确定假定的不可清除突变外结构域是否因PMA治疗而脱落，使用Lipofectamine（Life Technologies，Inc.）将野生型质粒（syn1-WTJM）和含有syn1-CD4JM突变的质粒瞬时转染到COS-7细胞中。细胞在100 mm组织培养板（Falcon）中培养以进行瞬时转染。转染后24 h对细胞进行胰蛋白酶处理，并在转染后36–48 h将细胞重新放置在6孔板中进行脱落试验。利用单克隆抗体281-2进行免疫细胞化学，确认syndecan-1在细胞表面的表达。如前所述，通过对细胞胰蛋白酶化后收集的上清液进行斑点杂交分析，发现这两种结构在同等水平上表达，以去除细胞表面syndecan-1(Subramanian等人，1997年).

抑制酪氨酸激酶活性可防止PMA、受体激活和细胞应激加速脱落

我们之前的研究表明，酪氨酸激酶抑制剂genistein通过受体活化阻止了syndecan-1和-4外结构域的脱落，这表明酪氨酸磷酸化参与了加速脱落(Subramanian等人，1997年). 使用NMuMG细胞，我们现在询问PMA、TRAP和细胞应激（例如神经酰胺和高渗）加速脱落是否与酪氨酸激酶活性有关。

Phorbol酯类，PKC激活剂，已知可增强多种细胞表面蛋白质的外结构域脱落(Hooper等人，1997年)，快速（5分钟）加速从各种培养细胞中脱落syndecan-1和-4外结构域（Fitzgerald，M.L.，J.-S.Chun和M.Bernfield，美国细胞生物学学会，1994。1813年（文章摘要）；Subramanian等人，1997年）。酪蛋白A25和2,5二羟基肉桂酸甲酯（蛋白质酪氨酸激酶抑制剂）都阻止了PMA加速syndecan-1的脱落(图1A） 和syndecan-4(图1B） 外结构域。

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图1

syndecan-1和-4的加速脱落取决于蛋白酪氨酸激酶的活性。（A和B）NMuMG上皮细胞与4αPDD（0.5μM）、一种非活性PMA类似物或PMA孵育30分钟，并在存在或不存在酪蛋白A25（5μg/ml）或2,5，二羟基肉桂酸甲酯（5μg/ml）的情况下孵育。NMuMG细胞在含有或不含酪蛋白A25（5μG/ml）的情况下，与以下物质共同培养2小时：（C和D）100μM TRAP，或（E和F）700 mOsm NaCl，或（G和H）100μM神经酰胺。收集条件培养基，并将其应用于阳离子Immobilon-N膜，以使用ECL检测进行斑点杂交分析。利用单克隆抗体281-2和MSE-4抗血清分别用ECL检测Syndecan-1（A、C、E和G）和Syndecan-4（B、D、F和H）外结构域。结果表示为用密度扫描定量的AU中syndecan外结构域脱落量，并用NIH图像软件进行分析。每个点代表三次测定的平均值±SD。与未经处理的对照组相比，对于所分析的每种脱落激动剂，单独与抑制剂孵育对脱落水平没有影响。

凝血酶受体（也称为蛋白酶激活受体-1[Dery和Bunnett 1999年;Dery等人，1998年])被14氨基酸凝血酶受体激动肽（TRAP）激活，而TRAP没有固有的蛋白水解活性(Troyer等人，1992年;Dery和Bunnett 1999). 酪蛋白A25抑制TRAP加速syndecan-1的脱落(图1C） 和syndecan-4(图1D） 外结构域，如之前报道的SVEC4-10细胞(Subramanian等人，1997年). 因为syndecan-1和-4外结构域位于损伤组织周围的液体中(Subramanian等人，1997年)，我们推断细胞应激可能会加速脱落。我们测试了高渗和应激反应激动剂神经酰胺是否会加速syndecan外结构域脱落。用700mOsm-NaCl处理NMuMG细胞可加速syndecan-1和-4胞外域的脱落(图1E和图F)和神经酰胺(图1G和图H). 酪蛋白A25也抑制了这种脱落。检测SVEC4-10细胞时也观察到类似的结果。鞘氨醇髓鞘酶（1 U/ml）可产生神经酰胺、山梨醇（700 mOsm）、NaCl（低至400 mOmm）和热休克（42°C），也可加速syndecan-1和-4外结构域的脱落（数据未显示）。这些结果表明，介导细胞应激反应的因子可以加速syndecan-1和-4外结构域的脱落(Rosette和Karin 1996;Verheij等人，1996年)因此，牵连了c-Jun NH₂-加速脱落中的终末/应激激活蛋白激酶（JNK/SAPK）途径(Kyriakis和Avruch，1996年). 因此，PMA、凝血酶受体激活和细胞应激加速了合十碳外结构域的脱落，这涉及蛋白酪氨酸激酶（PTK）活性。除了在高渗条件下和神经酰胺存在下的最小细胞收缩外，在这些检测期间，细胞形态和活力没有受到影响。

蛋白激酶C活性的抑制可防止PMA和细胞应激加速的脱落，但不能阻止受体激活

为了确定由PMA、凝血酶和EGF受体激活或细胞应激加速的syndecan外结构域脱落是否与PKC活性有关，我们测试了双吲哚甲酰胺I（PKC的一种有效和选择性抑制剂）(Toullec等人，1991年)，影响脱落。双吲哚甲酰亚胺I完全阻断PMA加速syndecan-1脱落(图2A） 和-4(图2B） ●●●●。高渗压加速了合成癸烷-1和合成癸烷-4的脱落(图2C和图D)和神经酰胺(图2E和图F)也被双吲哚甲基苯胺I抑制。相反，TRAP-和EGF-都不加速syndecan-1或-4的脱落(图2G和图H)受双吲哚甲酰胺I影响。使用SVEC4-10细胞观察到类似结果。因此，PKC活性的抑制阻止了由PMA和细胞应激加速的syndecan-1和-4外结构域的脱落，但不影响凝血酶或EGF受体激活的脱落。这些结果表明，不同的激动剂激活不同的细胞内信号通路以加速合成癸烷的脱落。

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图2

PMA和压力加速的脱落，而不是通过受体激活加速的脱落取决于蛋白激酶C的活性。将NMuMG细胞（A和B）与PMA或4αPDD（0.5μM）孵育30分钟。将NMuMG细胞（C和D）与700 mOsm NaCl或（E和F）100μM神经酰胺或（G和h）10 ng/ml EGF或100μM TRAP孵育2 h。在不存在或存在双吲哚甲基苯胺I（Bis.，1μM）的情况下对每种激动剂进行分析。条件培养基中的syndecan-1（A、C、E和G）和syndecan-4（B、D、F和H）外结构域通过斑点杂交分析进行检测，如图1.定量按照图1，每个点代表平均值±SD(n个= 3). 对于每种测定的脱落激动剂，与未处理的对照相比，单独用抑制剂孵育对脱落水平没有影响。

抑制MAP激酶活性可防止受体激活而非PMA加速脱落

我们询问靶向有丝分裂原活化蛋白激酶（MAP激酶）信号系统的抑制剂是否影响脱落。我们测试了特定MAP激酶抑制剂PD98059和SB202190是否影响脱落。PD98059是MAP激酶的选择性抑制剂，可在体内外阻断ERK MAP激酶随后的磷酸化和活化(Alessi等人，1995年;Dudley等人，1995年). PD98059（≤50μM）未抑制PMA加速syndecan-1脱落(图3A） 或syndecan-4(图3B） NMuMG细胞的外结构域，但确实阻断了EGF加速(图3C和图D)和TRAP加速(图3E和图F)这些外胚层脱落。PD98059在浓度高达100μM时不影响细胞活力(Desdouits-Magnen等人，1998年)检测过程中未发现细胞形态变化。SB202190是体内外p38 MAP激酶途径的特异性抑制剂(Lee等人，1994年;Cuenda等人，1995年). SB202190（≤50μM）未抑制PMA或受体激活的syndecan-1或-4的脱落（数据未显示）。这些结果表明，应激和受体激活，而非PMA加速脱落都与MAP激酶活性有关。

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图3

MAP激酶活性的抑制可通过受体激活而非PMA来阻止脱落。NMuMG细胞在含有或不含有0.5μM PMA的情况下孵育（A和B）30分钟，或在含有或不含有10ng/ml EGF的情况下孵育（C和D）2小时，或在含有或不含有100μM TRAP的情况下孵育（E和F）2小时。在没有或存在PD98059（20μM）的情况下对每种激动剂进行分析。通过斑点杂交分析条件培养基中的syndecan-1（A、C和E）和syndecan-4（B、D和F）外结构域，如图1.定量按照图1每个点代表平均值±SD(n个= 3). 与未经处理的对照组相比，对于所分析的每种脱落激动剂，单独与抑制剂孵育对脱落水平没有影响。

PMA引起细胞表面合成葡聚糖外体脱落

P3X63细胞是一种小鼠血浆细胞系，表达丰富的细胞表面syndecan-1，几乎检测不到细胞内syndecan-1的水平，并且以低构成率脱落syndechan-1。P3X63细胞裂解物和条件培养基的免疫沉淀和斑点杂交分析表明，PMA处理导致细胞表面syndecan-1迅速丢失，条件培养基中脱落的syndecan-1外结构域随之出现（Fitzgerald，M.L.，J.-S.Chun，and M.Bernfield，American Society of cell Biology，1994）。1813年（摘要））。我们现在已经用生物素化单克隆抗体281-2在4°C下在这些细胞表面标记了syndecan-1，以避免结构性脱落。细胞表面可见明亮的荧光和偶尔的点状染色(图4A） ●●●●。PMA处理这些细胞后，syndecan-1染色在5分钟后减少，30分钟后完全消失，除了一些残留的点状染色(图4B） ●●●●。为了证实脱落是从细胞表面脱落的，我们询问了未标记的P3X63细胞在4°C下的胰蛋白酶化是否会定量去除细胞表面的syndecan-1(Jalkanen等人，1987年)，防止随后PMA引起的脱落。经胰蛋白酶化细胞经PMA处理后，条件培养基中未检测到syndecan-1外结构域（数据未显示）。此外，用细胞松弛素D（1μg/ml）或秋水仙碱（50μM）预处理细胞不会抑制PMA加速脱落，而由抗体诱导的细胞表面合成癸烷-1交联实际上可以防止加速脱落（数据未显示）。因此，加速syndecan-1外结构域脱落是一种细胞表面事件。

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图4

Syndecan外结构域通过细胞表面的蛋白水解裂解而脱落。将活的P3X63小鼠血浆细胞与生物素化单抗281-2在4°C下孵育30分钟，然后在37°C下使用或不使用0.5μM PMA治疗30分钟。将细胞固定并用FITC-抗生物素标记，用于未处理的（A）或PMA处理的（B）细胞上的细胞表面综合征-1的免疫荧光检测。

细胞表面相关蛋白水解活性是加速脱落的原因

接下来，我们评估了负责核心蛋白裂解和外结构域脱落的蛋白水解酶活性是可溶性的还是膜相关的。对于这些测定，将PMA处理的人ARK细胞和未处理的小鼠P3X63细胞混合在一起或通过Transwell膜彼此分离。在这两种分析中，使用了恒定数量的P3X63细胞和不同数量的ARK细胞。分别使用单克隆抗体DL-101和281-2区分人类和小鼠syndecan-1外结构域。当细胞混合以允许细胞与细胞接触时，经PMA处理的ARK细胞加速了未经处理的P3X63细胞的syndecan-1胞外区脱落(图5A） ●●●●。然而，当Transwell膜分离细胞时，PMA处理的ARK细胞并没有加速未处理P3X63细胞的脱落(图5B） ●●●●。当使用经PMA处理的P3X63细胞和未经处理的ARK细胞进行相同的实验时，也观察到类似的结果（数据未显示）。这些结果表明，负责脱落的蛋白水解活性是与细胞相关的，而不是可溶的。此外，由于这种蛋白水解酶活性可以作用于邻近细胞，它可能作用于细胞表面。

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图5

与膜相关的蛋白水解活性是加速脱落的原因。将P3X63细胞与人类ARK细胞共培养15分钟，这些细胞经过或不经过PMA预处理15分钟，并用无血清培养基冲洗两次。细胞（A）混合在一起或（B）通过Transwell膜相互分离。恒定数量的P3X63细胞（5×10⁶)并使用不同数量的ARK细胞。用单克隆抗体281-2对条件培养基进行斑点杂交分析，检测P3X63细胞表面脱落的syndecan-1。定量按照图1每个点代表平均值±SD(n个= 3).

PMA加速Syndecan-1外体结构域的脱落是由于核心蛋白中一个相邻膜位点的裂解所致

我们之前的研究表明，从培养细胞中释放出来的无GAG-free syndecan-1和-4胞外域核心蛋白大小相同，无论是组成性脱落、PMA或受体活化加速还是直接纤溶酶或凝血酶治疗(Subramanian等人，1997年). 基于相对分子质量，通过SDS-PAGE分析棚外结构域和跨膜蛋白聚糖确定相对分子质量(Jalkanen等人，1987年;Rapraeger等人，1987年;Subramanian等人，1997年)，我们预测切割发生在核心蛋白胞外域的一个近膜位点。

我们通过用人类CD4 T细胞跨膜抗原的相应氨基酸序列替换野生型syndecan-1近膜结构域的15个氨基酸，构建了一个假定的不可清除syndecan-1突变体(图6A） 并检测突变株是否对PMA加速脱落具有抗性。CD4不经历PMA加速脱落(Wang等人，1987年;Shin等人，1991年)这表明CD4没有被释放syndecan-1的蛋白水解活性所裂解。尽管PMA处理转染野生型syndecan-1（syn1-WTJM）的COS-7细胞释放可溶性外结构域，这是一种被肽羟肟酸盐（参见下文）抑制的活性，但PMA并没有加速syndecan-1从转染syn1-CD4旁膜突变体的细胞中释放(图6B） ●●●●。使用CHO细胞和HT-1080人纤维肉瘤细胞观察到类似结果（数据未显示）。因此，核心蛋白在细胞表面15个氨基酸内的膜旁区域被裂解。

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图6

PMA加速了syndecan-1外结构域的脱落，这是由于在核心蛋白的膜旁部位发生了断裂。（A） 野生型（WT）syndecan-1和CD4-juxtamembrane（JM）突变体syndecan-1的示意图。外结构域的JM区域显示为WT氨基酸序列和CD4-JM结构域突变序列（粗体）。（B） 用WT syndecan-1或CD4-JM突变体瞬时转染COS-7细胞。在不含或不含肽羟肟酯BB-1101（1μM）的情况下，用或不含PMA（0.5μM，培养15分钟）培养细胞。通过斑点杂交分析测定条件培养基中的Syndecan-1外结构域，并按照图1.每个点代表平均值±SD(n个= 3).

金属蛋白酶羟基磷灰石抑制剂防止加速脱落

因为各种细胞表面蛋白质外结构域的加速脱落已被证明需要MP活性(Hooper等人，1997年)，我们检查了一组MP抑制剂对PMA加速syndecan-1脱落的影响。我们发现过渡金属离子螯合剂EDTA和1,10菲咯啉，以及羟肟酸基MP抑制剂锕系元素(Sayama等人，1995年)，以剂量依赖的方式阻断了PMA加速的综合征-1胞外结构域从P3X63和SVEC4-10细胞的脱落，但磷酰胺，一种对嗜热菌素特异性的锌螯合剂，不影响加速的脱落（Fitzgerald，M.L.和M.Bernfield，美国细胞生物学家学会，1997。2286（摘要））。天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和丝氨酸蛋白酶抑制剂（胃蛋白酶抑制素A、E-64、苯甲脒、亮氨酸蛋白酶和PMSF）没有阻止PMA加速脱落（数据未显示）。

因此，我们测试了以羟肟酸为基础的MP抑制剂的效果，该抑制剂最初用于抑制前TNF-α的脱落(Odake等人，1994年;Sayama等人，1995年;Wojtowicz-Praga等人，1997年;Pratt等人，1998年)PMA、受体激活和细胞应激加速了syndecan-1和-4的脱落。肽羟肟酸酯BB-2116和BB-1101减少了syndecan-1的脱落(图7A） 和syndecan-4(图7B） 以浓度依赖性方式从PMA处理的NMuMG细胞中提取外结构域，而不影响细胞形态或活性；IC₅₀约0.1μM。使用P3X63和SVEC4-10细胞时观察到类似结果（数据未显示）。EGF-、TRAP-和神经酰胺加速syndecan-1的脱落(图7C和图E)和syndecan-4(图7D和图F)外结构域也被羟肟酯BB-1101抑制。缺少锌结合域的对照羟肟酸化合物BB-3861在高达10μM的浓度下对合成癸烷的脱落没有影响（数据未显示）。这些结果表明，被测试的每种激动剂加速的syndecan-1和-4脱落取决于金属蛋白酶的活性。

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图7

肽羟肟酸盐可抑制加速脱落。（A和B）NMuMG细胞在存在或不存在肽羟肟酯BB-2116或BB-1101的情况下，在含有或不含有PMA的情况下培养30分钟（0.5μM）。（C和D）SVEC4-10细胞在加入或不加入10 ng/ml EGF或100μM TRAP的情况下，在1μM BB-1101存在或不存在的情况下培养2 h。在存在或不存在1μM BB-1101的情况下，使用或不使用100μM神经酰胺培养（E和F）NMuMG细胞2 h。条件培养基中的Syndecan-1（A、C和E）和Syndecan-4（B、D和F）外结构域通过斑点杂交分析进行测定，如图1.定量按照图1每个点代表平均值±SD(n个= 3). 与未经处理的对照组相比，对于每种检测的脱落激动剂，单独与抑制剂（1μM）孵育可降低脱落水平。

基质相关金属蛋白酶抑制剂TIMP-3防止加速脱落

由于肽羟肟酸MP抑制剂阻止了syndecan-1和-4外域脱落，我们测试了分泌型MMP抑制剂的金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）家族成员(Murphy and Willenbrock 1995年;Anand-Apte等人，1996年;Gomez等人，1997年). TIMP家族成员有不同的表达模式(Leco等人，1994年)，与不同的前果胶酶形成复合物(Murphy and Willenbrock 1995年;Gomez等人，1997年;Butler等人，1999b;Murphy等人，1999年)和结合肝素的能力不同(Butler等人，1999b). PMA加速NMuMG细胞syndecan-1和-4外结构域的脱落(图8，A和B）被TIMP-3特异性抑制；当浓度达到20μg/ml时，TIMP-1和TIMP-2对脱落没有影响。当使用P3X63和SVEC4-10细胞时，观察到类似的结果（数据未显示）。TIMP-3抑制呈浓度依赖性；IC₅₀为～5μg/ml，在存在20μg/ml（～0.8μM）TIMP-3的情况下，PMA加速脱落被完全阻止(图8C和图D). 为了确定由生理激动剂加速的脱落是否也被TIMP-3抑制，我们测试了TIMP-3对EGF-、TRAP-和神经酰胺加速的syndecan-1和-4外结构域脱落的影响。TIMP-3减少SVEC4-10细胞EGF和TRAP受体激活的脱落(图9A和图B)以及神经酰胺诱导NMuMG细胞中这些合成癸烷的脱落(图10C和图D). 因此，PMA和各种生理激动剂加速脱落需要TIMP-3敏感的MP活性。

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图8

TIMP-3特别抑制PMA加速脱落。在存在或不存在20μg/ml TIMP-1、-2或-3的情况下，用PMA（0.5μM，持续30分钟）处理（A和B）NMuMG细胞。（C和D）NMuMG细胞在有或无TIMP-3的情况下，在指定浓度下用或不用PMA（0.5μM，持续30分钟）处理。条件培养基中的Syndecan-1（A和C）和Syndecan-4（B和D）外结构域通过斑点杂交分析进行测定，如图1.定量按照图1每个点代表平均值±SD(n个= 3). 与未经处理的对照组相比，对于所分析的每种脱落激动剂，单独使用TIMP-1、-2或-3（20μM）对脱落水平没有影响。

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图9

TIMP-3抑制受体和应激激活的脱落。（A和B）SVEC4-10细胞用或不用10 ng/ml EGF或100μM TRAP处理，或（C和D）NMuMG细胞在有或没有20μg/ml TIMP-3的情况下用或不使用100μM神经酰胺处理2 h。条件培养基中的syndecan-1（A和C）和syndecan-4（B和D）外结构域如图1.定量按照图1每个点代表平均值±SD(n个= 3). 与未经处理的对照组相比，对于所分析的每种脱落激动剂，单独使用TIMP-1、-2或-3（20μM）对脱落水平没有影响。

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图10

合成癸烷-1和-4的组分脱落被肽羟肟酸盐抑制，但不被TIMP-3抑制。SVEC4-10细胞在存在或不存在指定浓度的（A和B）肽羟肟酯BB-2116和BB-1101或（C和D）TIMP-3的情况下培养14小时。条件培养基中的syndecan-1（A和C）和syndecan-4（B和D）外结构域如图1.定量按照图1每个点代表平均值±SD(n个= 3). 在本试验中，TIMP-1和TIMP-2（20μM）没有抑制成分性脱落，在2小时脱落试验中，与未经处理的对照组相比，单独使用PTK、PKC或MAPK抑制剂不会影响脱落水平。

多信号通路调节Syndecan-1和-4外体脱落

多种激动剂被鉴定为syndecan-1和-4外域脱落的加速器(图11). 通过激活EGF和凝血酶受体加速的脱落与ERK-MAP激酶途径的激活最相关，但似乎不涉及PKC激活。相反，与细胞应激相关的激动剂（如高渗和神经酰胺）似乎需要JNK/SAPK-MAP激酶途径上游的PKC激活。SB 202190抑制p38 MAP激酶活性对任何受试激动剂加速脱落的作用有限。总之，这些结果与特定MAP激酶信号通路的作用密切相关。

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图11

Syndecan胞外区脱落。通过对其核心蛋白的蛋白水解裂解，可以完整地去除合癸糖外结构域，从而产生可溶性热休克蛋白，保留其细胞表面对应物的结合特性。PMA和多种生理效应物（例如EGF家族成员、凝血酶、高渗压、鞘磷脂酶和神经酰胺）通过激活多种细胞内信号通路，加速了syndecan-1和-4外结构域从细胞表面脱落。这些信号汇聚在TIMP-3敏感的细胞表面金属蛋白酶系统上，该系统可裂解细胞表面15个氨基酸内的核心蛋白，并可作用于未受刺激的相邻细胞。脱落是由组织损伤刺激的，这些合胞外结构域存在于炎症液体中(Subramanian等人，1997年)调节生长因子和蛋白酶的活性(Kainulainen等人，1998年;Kato等人，1998年). 有关详细信息，请参阅文本。

Syndecan-1和-4外结构域也因PKC的佛波酯活化而脱落。因此，产生二酰甘油的生理效应器也可能会加速脱落。在所研究的细胞类型中，佛波酯引起的脱落显然不需要MAP激酶活性，但这种调节可能是细胞类型特异性的。例如，尽管磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂沃特曼和LY 294002不能抑制上皮细胞和内皮细胞中EGF和凝血酶受体激活的脱落，但它们能有效抑制3T3-L1脂肪细胞中胰岛素诱导的脱落（Fitzgerald，M.和M.Bernfield，未发表的结果）。

每种激动剂加速的脱落涉及PTK活性。这种活性可以磷酸化合癸糖核心蛋白细胞质结构域，但由于用PMA激活的细胞可以从未激活的相邻细胞中分裂合癸聚糖外结构域，脱落显然不需要这种磷酸化。渗透汽化物抑制蛋白酪氨酸磷酸酶后，Syndecan-1和-4脱落加快(Reiland等人，1996年；Fitzgerald，M.，未发表的结果），这种磷酸化在静息细胞中无法检测到或检测到较低水平(Ott和Rapraeger 1998年)组成性地脱落同分体外结构域。因此，PTK活性可能会磷酸化切割酶和/或脱落系统的其他未知成分。

在每一次测试中，我们测试了PKC、MAP激酶或PTK抑制剂单独的作用。与未经处理的对照组相比，抑制剂在任何情况下都不会影响脱落水平。这些数据表明，在短暂的分析期间（30分钟至2小时），这些抑制剂不会影响合成、糖基化或向细胞表面运输合成癸烷。每个受试细胞系对syndecan-1和-4胞外区脱落激动剂的反应几乎相同，表明相同的过程介导了两种HSPG的脱落。由于涉及多种不同的细胞内途径，我们的结果与建议多种蛋白质共同脱落系统的研究形成对比(Arribas等人，1996年;Mullberg等人，1997年). 然而，与提议的通用脱落系统一致，蛋白质裂解位于膜旁位置，脱落酶似乎没有裂解特定序列，脱落受到类似浓度的肽羟肟酸盐的抑制(Hooper等人，1997年;Hooper和Turner 1999年). 需要鉴定与脱落有关的酶，以记录这些脱落机制的差异。

Syndecan Ectodomains从细胞表面脱落

突触外结构域脱落是一种细胞表面事件。PMA处理P3X63细胞后30分钟内，荧光标记的syndecan-1从细胞表面消失，细胞预胰蛋白酶化以去除细胞表面syndecan-1可防止加速脱落，表明核心蛋白裂解位点位于质膜的细胞外表面。将人类CD4中的15个氨基酸区域引入到syndecan-1核心蛋白外结构域的相应膜旁区域，可以防止加速脱落，这表明核心蛋白裂解位点位于质膜15个氨基酸残基内。我们目前正在确定精确的解理位点。

负责这种分裂的酶活性似乎与细胞表面有关，因为与PMA激活的细胞接触会加速未处理细胞的脱落。因为syndecan和裂解活性都与质膜有关，在4°C时脱落被阻止(Jalkanen等人，1987年)脱落也可能受膜动力学变化（例如流动性和肌动蛋白丝结合）的调节。

TIMP-3敏感性金属蛋白酶介导调节性Syndecan外体脱落

在每种测试的细胞类型中，syndecan-1和-4的加速脱落被肽羟肟酸盐BB-2116和BB-1101阻断，这两种化合物最初设计用于抑制锌依赖性基质金属蛋白酶（MMPs）(Odake等人，1994年;Wojtowicz-Praga等人，1997年;Pratt等人，1998年). 高浓度的这些化合物抑制多种跨膜蛋白的胞外结构域脱落(Hooper等人，1997年). 事实上，BB-2116和BB-1101抑制每种细胞类型的syndecan加速脱落，其浓度比抑制MMP-1（可溶性人类成纤维细胞胶原酶）所需浓度高约100倍。这些数据表明，syndecan sheddase是MP，而不是MMP。

生理性MMP抑制剂TIMP-3，但不是密切相关的抑制剂TIMP-1和TIMP-2，也可以抑制syndecan的加速脱落。其中，TIMP-1和TIMP-2可以在本研究中使用的浓度下抑制所有已知MMP的活性(Murphy and Willenbrock 1995年)再次表明syndecan sheddase不是已知的MMP。TIMP-3在TIMP中是独一无二的，因为它含有肝素结合基序(Butler等人，1999a)通过这种方式，它在很大程度上与细胞外基质结合(Pavloff等人，1992年;Leco等人，1994年;Kishnani等人，1995年). 事实上，这种结合似乎增强了其抑制活性(Butler等人，1999a). TIMP-3由多种组织和细胞表达(Reponen等人，1995年)并通过细胞因子、生长因子和抗炎剂处理细胞而诱导(Leco等人，1994年)表明它可能调节组织重塑。

TIMP-3对HS链的亲和力可能会扩大其在同癸烷外结构域脱落中的作用。Syndecan HS链可能将TIMP-3定位于细胞表面，即胞外区脱落的位置，从而增强其抑制活性(Amour等人，1998年). 相反，可溶性合癸聚糖外结构域上的HS链可能会降低其在细胞表面的抑制能力。此外，TIMP-3活性的这种调节可能会影响膜锚定蛋白的脱落，例如我-选择素、TNF-α和对TIMP-3敏感的白细胞介素6受体(Hargreaves等人，1998年;Borland等人，1999年).

我们的结果表明，syndecan脱落酶是一种锌依赖性MP。该酶不可能是已知的MMP，因为TIMP-1或TIMP-2不抑制脱落。此外，这种活性与细胞表面有关，而大多数基质金属蛋白酶是分泌酶。然而，syndecan sheddase可能是膜型（MT）MMPs的成员。虽然已经确定了至少四名MT-MMP家族成员(Mattei等人，1997年)，MT1-MMP和MT2-MMP可能被排除在外，因为它们被TIMP-2抑制(Will等人，1996年;Butler等人，1997年). 事实上，目前尚不清楚TIMP-3是直接抑制syndecan脱落酶还是蛋白酶级联中参与syndecan-shedase脱落的另一种酶。

ADAMs家族的跨膜蛋白，结合了粘附分子和蛋白酶的特征(沃尔夫斯堡与怀特1996;布洛贝尔1997;黑白1998;Izumi等人，1998年)也是syndecan sheddase的候选者。迄今为止唯一确定的哺乳动物细胞表面相关金属蛋白酶解酶是ADAM 17（TACE）。TACE裂解TNF-α的外结构域(Black等人，1997年;Moss等人，1997年)和其他几种结构和功能无关的跨膜蛋白。然而，PMA加速了TACE缺陷的成纤维细胞系syndecan-1和-4外结构域的脱落(Black等人，1997年)尽管与P3X63、NMuMG和SVEC4-10细胞相比，其比率有所降低（Fitzgerald，M.，未发表的结果），但这表明TACE不是合成癸烷脱基酶。

组成性和加速性Syndecan胞外体脱落使用不同机制

负责加速脱落的酶切似乎与构成脱落的酶解不同。每种哺乳动物的合癸烷和单体的完整外结构域果蝇属合成癸烷组成性地被释放到培养细胞的条件培养基中(Kim等人，1994年;Spring等人，1994年)作为正常细胞表面HSPG周转的一部分(Yanagishita和Hascall 1992;Yanagishita 1998年). 与加速的外结构域脱落相比，TIMP-3不抑制组成性间体聚糖外结构域的脱落，其抑制需要增加约10倍的肽羟肟酸盐浓度。这些数据表明，不同的蛋白水解酶系统用于加速和组成性的同癸烷外结构域脱落，与这些过程的不同细胞作用相一致。

我们感谢Dmitriy Leyfer、Elena Shneider和Mie Abe（马萨诸塞州波士顿儿童医院）提供的卓越细胞培养技术援助。

这项工作得到了美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）的产前培训拨款5T32NS07264（发给M.L.Fitzgerald）、帕克·B·弗朗西斯基金会（发给P.W.Park）、美国国立卫生院（NIH）的CA 28735和HL56398（发给M.Bernfield）以及英国威康信托基金会和关节炎研究运动（发给G.Murphy）的支持。