小肠粘膜由烧瓶状粘膜下内陷（称为利伯库恩隐窝）和指状管腔突起（称为绒毛）组成。地穴主要由一个单克隆的增殖室组成，而绒毛的特点是具有不同谱系的分化细胞，并且是多克隆的，因为它们接收来自多个地穴的细胞(20). 隐窝含有肠干细胞，目前无法通过任何公认的标志物进行形态学鉴定或与其他肠上皮细胞区分。根据长期标记分析，肠干细胞位于Paneth细胞上方的隐窝中(20). 每一个活跃的干细胞似乎都会产生两种不同的瞬时扩增细胞群，一种致力于产生吸收性肠细胞，另一种则致力于产生杯状、Paneth和内分泌谱系的分泌细胞(5,20). Paneth细胞是在隐窝基底完成分化的唯一谱系；其他三个谱系的成员在从地穴迁移到邻近绒毛时完成了分化。这些分化细胞的迁移终止于位于绒毛尖端附近的细胞挤压区。在那里，细胞因凋亡而死亡，并流入肠腔。在小鼠中，这个细胞周期在3到5天内完成(5,20).
典型Wnt/β-catenin信号通路是在发育过程中建立组织结构和各种成人组织内稳态的主要参与者之一(8). β-连环蛋白是这一典型Wnt通路的重要细胞质信号转导子(2). 在Wnt配体缺乏通路刺激的情况下，β-连环蛋白被磷酸化并被靶向降解。负责β-catenin失稳的降解复合物包含抑癌基因产物axin或conductin和腺瘤性息肉病大肠杆菌（APC）以及糖原合成酶激酶3β和酪蛋白激酶I（CKI）。Wnt配体与Frizzled和/或LRP跨膜受体结合后，细胞质蛋白Disheveled被激活并阻断降解复合物的作用。β-连环蛋白随后能够进入细胞核并与TCF/LEF转录因子结合，从而诱导Wnt靶基因的转录调控(2). 结直肠癌是人类第二常见的恶性肿瘤类型，大体上是由激活Wnt信号通路的突变引发的(2). 这些肿瘤的特征是APC和axin的截断突变，以及β-catenin中降解诱导磷酸化位点的突变，所有这些都导致组成性核β-catelin/TCF复合物的形成(8).
Wnt信号转导的几项研究表明其对不同组织干细胞的影响。在小鼠表皮，β-catenin基因的条件性消融阻断了隆起干细胞向卵泡谱系的分化(13). TCF3是Wnt信号级联的转录因子，优先在隆起干细胞室表达，并被建议维持干细胞池(22). 造血干细胞中Wnt信号的激活触发了自我更新的增加，而axin的过度表达会使通路失活，导致重建效率降低(31). 在神经细胞中，Wnt通路的失活减少了祖细胞室的扩张，而通路的激活增加了该室(42). 为了阐明Wnt/β-catenin信号在肠上皮细胞中的作用，采用了几种基于各种途径成分失活和过度激活突变的体内方法(14,16,17,27,35,39,40). 在胚胎发育期间，TCF4被证明需要维持肠上皮的增殖室，因为基因消融导致新生儿上皮完全由分化的非分裂细胞组成(16). 在成人中，Wnt信号的改变也表明该通路在肠增殖和Paneth细胞分化中的重要作用(14,16,17,27,35,39,40). 然而，所有这些研究都报告了相当温和且仅短暂的表型，这使得有时很难区分观察到的表型是通路失活的直接结果还是恢复机制的一部分。此外，Wnt信号传导在肠道干细胞控制中的作用并没有得到直接解决。
在本研究中，我们确定了成年小鼠肠上皮中β-catenin缺失的直接后果。β-catenin失活导致肠上皮细胞迅速丢失，首先是与增殖受阻和肠细胞分化增加相一致的隐窝丢失。重要的是，在Wnt信号缺失的情况下，肠干细胞被诱导最终分化，导致致命的肠功能丧失。
材料和方法
动物模型。
空的和漂浮的β-catenin的等位基因(13)，Wnt报告鼠用lacZ公司传导位点敲除(19)和绒毛creERT2(9)前面已经描述过。按照Bettess等人的方法，在分析前连续2至6天，每20 g体重向10周龄小鼠腹腔注射1 mg他莫昔芬（Sigma），诱导β-连环蛋白消融(三). 两种对照（β-catenin+/液氧-绒毛蛋白creERT2）和诱导突变体（β-catenin−/氧-按照相同的给药方案注射绒毛蛋白creERT2）动物。例如，“第3天”实验是在0小时、24小时和48小时注射，72小时后处死动物。由于对照动物与未注射动物相比没有表现出表型，我们也将其称为“野生型”我们通过免疫组织化学常规评估β-catenin缺失的效率，并在诱导后第2天开始观察所有肠上皮细胞的有效缺失。虽然所有后续分析都是在缺失1至5天后进行的，但我们仅显示了首次观察到明显表型变化的时间点。在短期溴脱氧尿苷（BrdU）掺入实验中，小鼠在处死前2 h注射1 mg BrdU（Sigma）。在BrdU迁移试验中，小鼠在处死前2或3天注射1 mg BrdU一次。
β-半乳糖苷酶测定。
从小肠中分离出整批样品；用磷酸盐缓冲盐水（PBS）清洗；用2.5%戊二醛在pH 7.4的PBS中于4°C下固定30分钟；在PBS中冲洗，并在X-Gal溶液（1 g/升X-Gal[5-溴-4-氯-3-吲哚-β-d日-PBS中的半乳糖苷]，pH 7.4，5 mmol/升亚铁氰化钾，5 mmol/升铁氰化钠，2 mmol/升MgCl2和0.2%Triton X-100）在37°C的黑暗中过夜。随后，用PBS清洗组织样品并将其嵌入塑料中（Technovit7100）。用曙红对厚度为4μm的切片进行复染，通过乙醇系列脱水，并嵌入Entellan中。相对LacZ信号强度被评估为最大活动的百分比。增殖被评估为地穴中每个位置的中期/后期细胞数量。在这两项分析中，计算了100多个地穴。
电子显微镜。
在PBS中清洗肠组织，并在4°C下将其固定在2.5%戊二醛中的0.1 M二羧酸钠缓冲液中过夜。将组织切成1-mm三用于固定的立方体。在1%四氧化锇中的0.1 M碳酸缓冲液中进行1 h的后固定（2 ml 4%的OsO水溶液4、4 ml 0.2 M缓冲液和2 ml H2O立即混合使用）。在0.1M缓冲液中冲洗并脱水后，将组织放入环氧丙烷（1.2环氧丙烷）中两次，持续15分钟。然后在20°C下两次施加环氧丙烷/环氧树脂混合物（50/50），持续1小时，然后在4°C下过夜。将组织包埋在新制备的树脂中，并在60°C下聚合72小时。使用Philips CM 10透射电子显微镜拍摄照片。
LRC的Tritiated TdR标记。
三周龄小鼠每天注射两次25μCi[三H] 胸腺嘧啶([三H] TdR）连续四天。三周后，分别给动物注射三苯氧胺2、3和4天，并在第二天处死。用PBS清洗肠道，并用4%甲醛固定。准备厚度为4μm的切片进行放射自显影（K5乳剂；Ilford），并暴露15天。用核固红对切片进行复染。在肠道横切面计数标记染色细胞（LRC）。检测LRCs的阈值设定为每个细胞核5个或更多个晶粒。
转录分析。
肠组织在OCT中冷冻，将10μm厚的切片涂在膜载玻片上，用于激光捕获显微切割（LCM；Molecular Machines and Industries，零件号50102），用曙红染色，脱水，并使用mCut激光显微切割系统（Nikon Eclipse TE200）进行切割。使用Pico Pure分离试剂盒（Arcturus）分离RNA。通过琼脂糖凝胶电泳和安捷伦生物分析仪分析进行RNA质量控制后，使用MessageAmp II aRNA试剂盒（Ambion）进行扩增，并使用IVT Affymetrix试剂盒标记扩增的RNA。生物素标记的cRNA在430v 2.0小鼠Affymetrix阵列上杂交。RMA使用瑞士洛桑DNA阵列设施开发的RACE渐晕图在R包中进行归一化和信号估计。使用贝叶斯检验进行统计分析，只有变化超过1.5倍的解除管制基因和P（P）为进一步分析，考虑了低于5%的阈值。使用GenMAPP软件进行基因本体和通路分析。
结果
肠上皮中Wnt/β-catenin信号传导的丧失是致命的，这是由于肠道稳态的快速阻断。
为了可视化肠道内内源性Wnt信号活动，我们使用了一种报告小鼠菌株lacZ公司传导位点敲除(19). 传导蛋白是已知的Wnt信号传导的通用靶基因。在肠隐窝的下半部分、Paneth细胞以及细胞位置2和6之间观察到最强的Wnt活性（图。). Wnt活性的这种定位仅与增殖的瞬时扩增细胞部分重叠，因为它们的峰值分布位于细胞位置6和8之间，如有丝分裂图所示（图。). 因此，Wnt信号活动仅限于肠隐窝，在肠干细胞所在的区域最强（参见图。)而不是快速增殖的瞬时扩增细胞。
密码维护需要主动Wnt信号。（A至C）Wnt活性与地穴中的细胞增殖。（A） 使用传导素定位Wnt活性-lacZ公司报告鼠。箭头显示有丝分裂图。Bar，20μm。（B） Wnt活性（蓝色；任意单位）相对于细胞增殖（红色；中期/后期细胞）沿隐窝绒毛轴的定位示意图，从隐窝中的Paneth细胞到Paneth以上的位置10。（C） 肠隐窝示意图。数字表示地下室底部Paneth细胞的细胞位置，对应于位置0到位置10。中期/后期的细胞在位置9处表示。（D） β-连环蛋白消融后第6天肠切片的H&E染色。请注意，肠上皮在突变体中大部分丢失。棒材，200μm。隐窝区域的（E至I）H&E染色。突变体表现出从诱导后第2天（F）开始的渐进性隐窝丢失，并导致在第4天（H）建立扩展的绒毛间区。棒材，100μm。（J） 对每个样品200个窝/绒毛单位和每个组3只小鼠的形态学变化进行量化。左轴：白色条表示每个窝的上皮细胞数量，灰色条表示不属于绒毛部分的上皮细胞总数（绒毛间区）。误差线表示标准偏差。右轴：虚线表示每个字段的地下室数量（以百分比表示）。wt，野生型。
LRC在突变小鼠中发生分化。（A至C）标记20天后注射氚化TdR的小鼠肠道放射自显影术。在野生型上皮（A）中，在Paneth细胞上方的隐窝中发现LRC（箭头所示）。在4天的突变上皮（B）中，LRC（箭头所示）数量相似，但位置异常。条形，25μm。（C） 控制（左）和突变LRC的定位模式方案，其中特定位置的LRC频率被描绘为不同宽度的黑线。最初，未诱导β-catenin中的LRC−/液氧小鼠（0d）的定位与对照组相同。β-catenin缺失两天后，突变LRC散布在整个隐窝区域（数据未显示），然后在第4天（4d）沿着隐窝绒毛轴均匀分布。我们为每组两只小鼠定量了300个隐窝绒毛单位。在这两个组中，约20%的隐窝（对照）或隐窝绒毛单元（突变）被发现含有LRC，当每个核保留5粒以上时，LRC得分为阳性。肠细胞分化标记FabpL的（D和E）反染色表明，在β-catenin缺失（E）后4天，LRC（箭头）在突变株中分化，而在对照组（D）中保持未分化。图片给出了一个典型示例；突变体中的所有LRC在此时间点表达FabpL。棒材，25μm。（F至I）体内肠上皮细胞迁移试验。在注射三苯氧胺之前立即对增殖细胞进行BrdU脉冲标记，随后在对照（F和H）和突变（G和I）上皮中注射三苯氧胺后第2天（F和G）和第3天（H至I）通过免疫组织化学定位迁移细胞。棒材，50μm。wt，野生型。
我们建立了一个小鼠模型来研究Wnt/β-catenin信号在肠道内稳态中的作用。该模型使用β-catenin基因的一个空的和一个浮动的等位基因(13)与在肠绒毛启动子控制下表达的cre重组酶（creERT2）的他莫昔芬诱导变异体结合，该启动子允许对β-catenin缺失进行时空控制(9). 在绒毛-creERT2小鼠中，所有肠上皮细胞，包括干细胞，都经历了cre介导的重组，长期随访分析证明了这一点(9). 使用该小鼠系统，我们诱导成年小鼠在不同时间段内β-catenin基因消融。这导致突变小鼠（绒毛蛋白-creERT2-β-catenin）的所有肠上皮细胞丢失−/液氧)诱导后6天内（图。)，而对照小鼠（绒毛creERT2-β-catenin+/液氧)没有表现出任何表型，因此被称为“野生型”。随后，在小鼠因肠道功能丧失而死亡之前，必须对其进行安乐死。β-catenin缺失后2天内，在隐窝区域观察到第一个表型变化（图。)当突变体隐窝膨胀而细胞数量没有明显变化时（图。). 随后，隐窝的数量和细胞数随着隐窝形状的改变而减少，导致第3天绒毛间区变平（图。和). 4天后，由于β-catenin消融，隐窝几乎消失（图。). β-catenin消融后第4天，绒毛大小也逐渐减小，达到对照组的50%左右。
观察到的隐窝形态变化与隐窝细胞增殖的剧烈变化相吻合。虽然缺失后1天突变的隐窝显示出未改变的增殖，但在β-catenin缺失的第二天观察到增殖完全受阻，这是通过短期BrdU掺入进行评估的（图。)（另请参阅补充材料中的数据）。此外，在β-连环蛋白突变体中发现细胞周期控制的已知成分发生改变。Wnt靶基因c的表达-myc公司绒毛间区细胞周期抑制剂p21增加（数据未显示）。通过免疫组织化学对活性caspase 3（凋亡细胞死亡的标志）进行分析，凋亡增加与β-catenin突变体的隐窝丢失无关（图。). 然而，在消融4天后，突变体显示绒毛尖端的细胞凋亡略有增加（图。). 这种晚期凋亡事件密切反映了这些分化细胞的正常寿命，这些分化细胞向绒毛上迁移，在绒毛尖端发生凋亡，并在野生型动物中在4至5天内脱落到肠腔中（参见图。).
肠上皮中β-连环蛋白消融导致的细胞增殖和死亡。（A和B）β-catenin消融后2天通过短时BrdU掺入评估细胞增殖完全丧失。（C至F）活性半胱天冬酶3的免疫染色（箭头）显示，到第3天（E），突变隐窝中的凋亡特征没有增加。然而，在第4天观察到突变绒毛尖端（F）有适度增加。棒材，50μm。（G） 凋亡的量化表示为每100个绒毛中caspase 3阳性细胞的数量。为了量化，每只小鼠计数200个绒毛，每组计数3只小鼠。wt，野生型。
由于β-catenin在维持细胞间粘附连接中起着重要作用(2)，隐窝丢失可能是由于细胞粘附缺陷所致。在cre介导的重组后2天，仍在细胞膜上发现β-连环蛋白（图。)表明粘附缺陷不能解释早期表型，如增殖阻滞。此外，我们通过电子显微镜证实，连接复合体在β-catenin缺失3天后不受影响（图。). 当β-连环蛋白在细胞膜上已经缺失时，突变体中存在正常的粘附连接、桥粒和紧密连接（参见图。)强烈提示肠上皮细胞的丢失不是由于细胞粘附的破坏，而是由于β-catenin在典型Wnt信号中的作用。
肠上皮细胞的丢失是由于典型的Wnt信号。（A至D）β-catenin蛋白表达的免疫荧光时间过程显示，在诱导后的第2天（C），其存在于粘附连接中。棒材，50μm。（E） 小鼠肠隐窝区域的电子显微照片。β-catenin缺失3天后，紧密连接（白色箭头）、粘附连接（黑色箭头）和桥粒（白箭头）等连接复合体仍然不受影响。放大倍数，×23000。
β-catenin消融对肠系分化的影响。
导致β-catenin突变体中隐窝丢失的一个原因是过早分化。CD44是隐窝祖细胞的标志物，其表达的免疫组织化学分析揭示了突变小鼠隐窝和新形成的绒毛间区域中CD44阳性细胞的进行性缺失（图。). 相反，这些区域被发现表达肠细胞分化标记。在野生型小鼠肠道中，绒毛细胞具有碱性磷酸酶酶活性，并且在隐窝区域不存在；相反，碱性磷酸酶活性在4天β-catenin突变体的绒毛间区丰富（图。).
肠上皮分化对β-catenin消融的影响。（A到C）CD44免疫染色显示突变体（B和C）在第2天到第4天之间逐渐丧失隐窝表型。棒材，10μm。（D和E）野生型（D）窝中没有肠细胞分化标记物碱性磷酸酶（通过蓝色硝基蓝四唑-5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸染色检测），但在突变型（E）绒毛间区（括号）中存在。杯状细胞的（F至H）PAS染色显示数量不变。该图显示了杯状细胞数量的量化，表示为每个绒毛（H）中PAS染色阳性细胞的数量。每只小鼠计数200个绒毛，每组计数3只。（I至K）溶菌酶免疫染色显示Paneth细胞在野生型隐窝（I）和突变体（J和K）中的定位。插图分别显示面板I和J的放大倍数较高。棒材，20μm。wt，野生型。
通过周期性酸性-Schiff（PAS）染色分析，杯状细胞在β-catenin突变体中似乎不受影响（图。). 然而，考虑到杯状细胞相对较长的寿命和突变小鼠的快速死亡，杯状细胞分化的后期效应可能会被忽略。Paneth细胞表现出异常的形态，因为含有溶菌酶的小泡尺寸增大，数量减少，并且细胞在整个绒毛间区β-catenin缺失时定位错误（图。). 同样，由于Paneth细胞具有较长的寿命，因此无法研究其功能或分化的后期影响。
肠上皮β-catenin消融后干细胞的分化。
祖细胞命运的丧失表明，Wnt/β-catenin信号缺失可能导致肠道干细胞功能缺陷。大多数组织特异性干细胞很少分裂，这一特征可用于原位鉴定这些细胞。用氚饱和标记所有分裂细胞后[三H] TdR，不经常分裂的细胞会在很长一段时间内保留标记（所谓的LRC），而周期更频繁的细胞会失去标记。我们连续四天每天两次向3周龄小鼠注射氚化TdR。三周后，我们诱导β-catenin消融2至4天。正如预期的那样，野生型小鼠肠道中大约每五个隐窝中就有一个含有标签的干细胞，位于先前报告的细胞位置2，即Paneth细胞的正上方（图。) (29). 在β-catenin缺失突变体中，总LRC数与野生型相似；然而，它们的分布变得异常。对500多个隐窝绒毛单位的观察表明，LRC散布在整个隐窝区域，在β-catenin缺失后2天内偶尔在绒毛中发现。随后，LRC在4天内均匀分布在隐绒毛轴上（图。). 为了评估β-catenin失活是否会影响肠上皮细胞的迁移，我们在注射三苯氧胺之前用BrdU脉冲标记对照和突变小鼠2至3天。因此，我们标记了一组祖细胞后代，它们将在未来几天内分化并向绒毛尖端迁移。BrdU免疫组织化学显示，突变小鼠的整体细胞迁移率保持不变（图。). 因此，我们接下来评估分散的LRC是否可能是迁移分化的细胞。我们进行双重染色，以通过放射自显影检测LRC，并通过免疫组织化学方法检测肠细胞标记FabpL分化的肠细胞。在4天的突变体中，我们检测到所有与FabpL共标记的LRC（图。,n个=30），与对照动物相比，LRC仅限于地穴，不表达FabpL（图。). 这强烈表明β-catenin缺失导致干细胞向肠细胞系的强制分化。这种分化过程支持了隐窝的丢失，并有助于阻止增殖。
肠祖细胞室丢失背后的转录变化。
为了了解肠上皮中β-catenin缺失导致肠隐窝丢失的分子机制，我们对肠隐窝进行了转录谱分析。在诱导β-catenin缺失2天后，我们用LCM从野生型和突变型小鼠上皮细胞中分离出隐窝细胞。在RNA分离和RNA质量评估后，对RNA进行扩增，并对差异基因表达进行Affymetrix分析（差异表达基因的完整列表见补充材料表S1）。
总的来说，表达谱与组织学分析观察到的表型相匹配。Wnt信号活性的丧失反映在β-catenin本身和Wnt靶基因conductin和c的下调-myc公司p21的上调进一步反映了这一点，p21被c-myc公司(37). 事实上，体外转染带有显性阴性TCF形式的大肠杆菌细胞会导致细胞凋亡率降低-myc公司，p21增加，随后G增加1细胞周期阻滞和分化增强(37)，这与我们的结果一致。与此相一致，细胞周期控制的其他关键基因（即。，ccnd2号机组和ccna2号机组)在我们的转录谱分析中下调，Wnt信号的其他已知靶基因如ephB2型和ephB3这些肾上腺素受体的破坏与异常细胞混合和Paneth细胞定位错误有关(1)根据我们对Paneth细胞定位的免疫组织化学分析（参见图。). 上调基因包括肠细胞分化标记物碳酸酐酶4，这与我们对末端分化增强的分析一致。总之，这些结果支持我们的结论，即干细胞和瞬时扩增细胞在细胞周期中被阻止，并由于β-catenin缺失而被迫进入肠细胞分化（参见图。).
最近，CD133被用作标记物，以富集负责人类结肠肿瘤形成的肿瘤干细胞(24,32). 然而，能够明确识别正常肠干细胞或肠癌干细胞的标记物尚未确定。我们推断，我们的肠干细胞维持相关功能基因列表可能包含此类标记，因此我们将我们的基因列表与肠道肿瘤以及其他干细胞群体中发现的解除管制的基因进行了比较。详细地，我们将我们的基因列表与PTEN缺乏小鼠和APC（Min/+）和蛋白激酶Cα缺乏APC（Min/+）小鼠肠道肿瘤的转录谱进行了比较(12,18,25,26,30). 我们确定了在这些阵列中上调而在我们的β-catenin缺失阵列中下调的常见基因。接下来，我们将获得的基因列表与90多个人类结肠腺瘤和腺癌的转录组进行了比较，并将列表缩小为在至少20%的人类阵列中也上调的基因(4,10,23,43). 为了关注与干细胞相关的基因，我们接下来确定了与不同干细胞群体特征基因的重叠(15,33). 在我们的研究和用于比较的研究中，由于干细胞的缓慢循环特性或肿瘤中增殖的增加，许多细胞周期相关基因都被解除了调控。因此，根据Whitfield等人的转录谱分析，我们从基因列表中排除了已知的细胞周期相关基因(38)和Cho等人(7)以及塞莱拉和斯坦福在线数据库。表中总结了与上述所有标准相匹配的常见解除管制基因因此，它列出了肠干细胞和癌症干细胞标记物的候选物。根据对人类腺瘤的分析和正常肠道的原位杂交，已经独立描述了其中六个基因的干细胞特异性表达(36). 我们通过原位杂交证实了其他几种细胞的干细胞表达，例如Sox4，也由Paneth细胞表达，以及Diap3（图。; 数据也未显示）。重要的是，我们发现这两个基因在突变小鼠隐窝中的表达受到强烈抑制，这与β-catenin信号丢失后干细胞表型的丢失一致（图。).
β-连环蛋白消融后干细胞标志物的快速下调。（A和B）Sox4位于肠野生型隐窝（A）的底部，在第2天（B）β-catenin突变体中受到强烈抑制。（C和D）Diap3在野生型隐窝（C）的干细胞位置表达，在β-连环蛋白突变体（D）中强烈减少。虚线表示地下室界限。棒材，10μm。wt，野生型。
表1。
β-连环蛋白敲除隐窝中下调的基因与其他干细胞群体和肠道肿瘤的基因特征重叠一
| 基因符号 | 基因名称 | 表情变化（折叠） |
|---|
| 脚踝10 | 锚蛋白重复域10 | 0.54 |
| 顶点1* | 无嘌呤/无嘧啶核酸内切酶1 | 0.44 |
| Ascl2公司* | Achaete-scute复合物类同源物2(果蝇属) | 0.40 |
| Bcl7c公司 | B细胞CLL/淋巴瘤7C | 0.64 |
| 隔膜3 | 透明同系物3(果蝇属) | 0.58 |
| 杰明4* | Gem（核细胞器）相关蛋白4 | 0.53 |
| 帽子1 | 组蛋白转氨酶1 | 0.58 |
| Hdac2型 | 组蛋白脱乙酰酶2 | 0.63 |
| Ifitm2型 | 干扰素诱导的跨膜蛋白2 | 0.40 |
| Impdh2公司 | 肌苷5′-磷酸脱氢酶2 | 0.49 |
| Msi2公司 | 武藏同源物2(果蝇属) | 0.54 |
| 纳格1 | NMDA受体调节基因1 | 0.51 |
| 神经元3 | 神经生长素3 | 0.40 |
| 槽口2 | Notch基因同源物2(果蝇属) | 0.64 |
| 拉萨3 | RAS p21蛋白激活剂3 | 0.64 |
| Rgs12型 | G蛋白信号调节器12 | 0.66 |
| 罗布布3* | Rho相关BTB域包含3 | 0.53 |
| 138卢比 | 无名指蛋白138 | 0.63 |
| Rwdd3号机组 | RWD域包含3 | 0.65 |
| 斯马卡5 | SWI/SNF相关、基质相关、肌动蛋白依赖性染色质调节因子，a亚家族，成员5 | 0.30 |
| Smyd2公司 | SET和MYND域包含2 | 0.55 |
| 斯米德5 | SET和MYND域名5 | 0.63 |
| 二氧化硫 | 七同系物2之子(果蝇属) | 0.66 |
| Sox4系统* | SRY-box-containing基因4 | 0.41 |
| 提姆1 | T细胞淋巴瘤侵袭转移1 | 0.66 |
| 毒素 | 胸腺细胞选择相关HMG-box基因 | 0.52 |
| 第12周* | WD重复结构域12 | 0.59 |
| Zfp62型 | 锌指蛋白62 | 0.59 |
| Zfp148型 | 锌指蛋白148 | 0.61 |
| Zfp191型 | 锌指蛋白191 | 0.42 |
| Zfp277型 | 锌指蛋白277 | 0.56 |
讨论
肠上皮的平衡依赖于细胞增殖、细胞周期阻滞、迁移、分化和细胞死亡之间的平衡。通过灭活成年小鼠肠上皮中的β-连环蛋白，我们证明Wnt/β-连环蛋白信号传导在许多细胞过程中起着关键作用。事实上，β-catenin缺失可诱导隐窝祖细胞室的快速表型改变并阻止增殖。随着越来越多的分化细胞进入绒毛，窝到绒毛的持续迁移导致窝消失。由于肠细胞寿命短，β-catenin消融后6天内，总细胞数逐渐减少，肠上皮细胞丢失。重要的是，我们证明Wnt信号是维持肠干细胞的干细胞和未分化状态所必需的。基于我们对肠隐窝中Wnt信号活性定位的分析，我们认为维持干细胞比防止细胞周期阻滞需要更高水平的Wnt信号。Wnt信号消融导致干细胞分化可能是缺乏修复和恢复机制的原因，否则在肠上皮损伤后会迅速发生。这种缺乏修复导致肠功能衰竭和死亡。
以前研究Wnt信号在肠上皮中作用的方法包括敲除或过度表达信号级联的不同成分。总的来说，这些研究只诱导了微小的瞬时表型，使得很难区分Wnt信号改变的后果和再生机制。此外，先前的研究并没有涉及Wnt/β-catenin消融后干细胞的命运。两组报告分泌型Wnt抑制剂Dickkopf1（Dkk1）过度表达。在一项研究中，Kuhnert等人用表达Dkk1的腺病毒感染小鼠(17). 在病毒给药1周后，观察到罕见的隐窝丢失并伴有增殖减少。然而，在随后的时间点，Dkk1表达降低，随后出现上皮再生。在第二项研究中，Pinto等人在绒毛启动子的控制下生成了表达Dkk1的转基因小鼠(27). 这些小鼠表现出轻微的表型，上皮细胞增殖减少，部分隐窝丢失，肠细胞分化增加。与我们的突变体相比，这些小鼠存活了下来，可能是因为Wnt信号传导的不完全阻断，以及转基因的镶嵌表达导致未受影响的隐窝的分散区域(27). 爱尔兰等采用Ah启动子驱动的cre重组酶对β-catenin进行条件消融(14). 再次，这只诱导了β-catenin的短暂（24小时）缺失，几天内观察到完全再生。在隐窝细胞数量部分减少后，野生型细胞的增殖增加得到了恢复，这使得很难与我们的结果进行比较。其他几项研究使用了一种互补的方法，即Wnt/β-catenin途径的过度激活(35,39,40). 正如预期的那样，这些实验诱导的表型与我们的基因消融模型中的表型相反：β-catenin过度表达的隐窝显示出增殖增加，导致隐窝扩张和肠细胞分化减少(35). 基于我们的新结果，我们认为这种表型可能反映了这些突变动物肠道干细胞库的扩大。
c-Myc是体外Wnt途径的已知靶点(8,37)最近被证实是控制体内肠道增殖的关键下游信号(34). 几个组有条件地删除了c-myc公司在肠上皮中(三,21,34). 令人惊讶的是，在所有这些研究中，肠道功能只在c-myc公司-通过隐窝裂变过程，阴性隐窝被逃逸细胞取代，这让人联想到放射后的修复(6). 与我们的数据一致的是，Wnt/β-catenin信号在祖细胞增殖中的基本要求，这种再增殖机制涉及Wnt/α-catenin活性的增加。然而，这些突变体中修复机制的保留表明c-myc公司很可能不是维持肠干细胞功能的重要Wnt靶点之一。
为了确定肠干细胞和癌症干细胞的新标记物，我们进行了转录谱分析，然后与其他干细胞群体和肠肿瘤研究进行了广泛的比较。这允许识别新的标记候选。在最近的一种互补方法中，将人类肠道肿瘤中上调的基因与人类结直肠癌细胞系中Wnt信号传导阻断后被抑制的基因进行了比较(36). 我们注意到，我们的小鼠基因列表和这个人类基因列表之间存在着显著的重叠，这两个列表共同定义了人类和小鼠常见的肠道Wnt靶点。重要的是，本研究显示许多基因在肠干细胞中特异表达，例如apex1、ascl2、gemin4、rhobtb3、sox4、和12瓦，也在我们的阵列中解除了管制。在这两项研究中，编码锌指家族成员的几个基因也显示了干细胞特异性表达。此外，我们还发现了其他小鼠干细胞标记物，如msi2型，与建议的标记属于同一家族msi1型(28)，尤其是透明3(底辟3). 有趣的是，已经确定透明基因家族影响生殖细胞的形成黑腹果蝇以及人类，并参与调节微管与动粒的连接(41).
Wnt/β-catenin途径的激活突变是众所周知的肠道癌前病变的遗传改变(8). 这引入了异常Wnt/β-catenin信号传导启动转化过程的概念。基于这些结果，已经开始了各种努力，以确定用于结直肠癌治疗的小分子药物，这些药物作为Wnt信号转导的抑制剂。虽然这些抑制剂的临床试验尚未发表，但我们的结果对这种方法提出了挑战，并预测了此类药物的严重副作用。
