Notch调节新生齿状回新生神经元的细胞命运和树突形态

Notch1基因调控Gfap增殖⁺祖细胞在体内。

由于γ-分泌酶抑制剂（GSIs）给药后肠道中Notch相关副作用的高毒性，以及GSIs可能干扰许多信号通路，注射GSIs仅允许急性观察化学抑制Notch信号的作用(16,17). 因此，我们以更精确的遗传方式进一步研究了Notch信号通路。在人类Gfap启动子（GCE）下表达三苯氧胺诱导型Cre重组酶的小鼠(18)与任一loxP-侧翼Notch1小鼠杂交(19)或者相反，使用条件NICD转基因小鼠(20)有条件烧蚀（GCE；Notch1fl/fl，以下简称“槽口1cKO“小鼠）或Gfap中过度表达激活的Notch1（GCE；NICD以下简称“NICD Tg”小鼠）⁺诱导Cre重组的胶质细胞及其所有子代(图2 A类和B类). 在出生后第10天（P）、第12天和第14天服用1mg三苯氧胺以诱导重组。之所以选择这种给药模式，是因为它限制了毒性的外部迹象，允许小鼠正常增重，并允许动物100%存活，同时允许报告者在大量Gfap中表达所确定的重组⁺单元格(图2C类). 在所有实验中，对照组由接受他莫昔芬治疗的GCE的同窝婴儿组成⁺; 槽口1^+/+GCE；新生儿重症监护室⁻，普通教育证书⁻; 新生儿重症监护室/⁺或GCE⁻; 槽口1^{飞行/飞行}小鼠或车辆处理的Notch1 cKO或NICD Tg小鼠(图2 A类和B类). 在检查的时间点，这些组之间的增殖或神经元分化没有显著差异（数据未显示），这表明Cre毒性得到了适当控制(21). 通过Hes5的RT-PCR评估Notch1 cKO和NICD Tg小鼠的重组效率。与对照小鼠相比，海马Hes5 mRNA水平显示出相同而相反的变化(SI图10). 这与Hes5作为Notch信号主要效应器之一的作用一致，并显示了这些诱导小鼠在重组非报告、漂浮等位基因方面的有效性。同样，NICD的免疫染色通常显示当与Notch1 cKO中的GFP报告染色结合使用时，Notch蛋白水平的预期细胞自主变化；GFP和NICD Tg；GFP小鼠(SI图10).

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图2。

Cre介导的Notch1操作。(A类和B类)小鼠繁殖和配体诱导Cre重组示意图。(A类)GCE小鼠与loxP-侧翼（“floxed”）Notch1小鼠杂交。GCE；缺口1^{飞行/飞行}给小鼠服用三苯氧胺，导致Cre-ERT2融合蛋白，该融合蛋白与细胞质中的热休克蛋白90结合，因此不活动-易位到细胞核，在那里重组成对的loxP位点，消融Notch1蛋白。(B类)GCE小鼠与NICD转基因小鼠杂交。GCE；给NICD小鼠服用三苯氧胺，导致重组loxP位点的CreER蛋白发生核移位，激活“STOP”密码子并诱导NICD蛋白转录和翻译。(C类)三种剂量的三苯氧胺在大量SGZ细胞中诱导重组，这由报告基因表达（GFP，绿色）决定。（比例尺：C类，50微米）

与对照组相比，槽口1在最后一次三苯氧胺治疗后1周处死的cKO小鼠肝门部的增殖显示出适度但显著的下降(图3 B、 C类、和E类). 这与体内γ分泌酶抑制剂的结果(SI图11). 值得注意的是，Ki67的增长幅度大幅度增加了3到4倍⁺NICD-Tg小鼠的细胞，包括增殖模式的整体改变，因为标记阳性细胞广泛存在于门和分子层，在这个年龄段没有发现如此高的增殖水平(图3 D类和E类). 然后，我们使用Ki67/碘脱氧尿苷（IdU）双标记方法进行细胞周期分析，该方法允许在注射IdU后24小时存活期内进行细胞周期退出分析，允许一些细胞进入G₀在将胸腺嘧啶类似物纳入其DNA中而其他人重新进入后(22). 退出循环的单元格应为IdU⁺/Ki67号机组⁻，而重新进入的细胞将是IdU⁺/Ki67号机组⁺SGZ中退出细胞周期的细胞百分比（细胞数IdU⁺/Ki67号机组⁻除以单元数IdU⁺)对照组为42±2%，而对照组为73±6%槽口1在NICD-Tg小鼠中cKO或4±2%(图3F类). 此外，与对照组和NICD-Tg小鼠相比，Gfap更少⁺细胞增殖于缺口1重组后一周给予IdU的cKO小鼠（9±1%槽口1cKO小鼠vs.对照组20±1%；P（P）< 0.001;图3G公司).

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图3。

Notch基因操纵影响细胞增殖和细胞周期退出。(A类)他莫昔芬、CldU和IdU注射范式示意图。(B–D类)对照组（Ctrl）齿状回Ki67（红色）/IdU（绿色）免疫染色、NICD过度表达（NICD Tg）和Notch1消融(缺口1cKO）动物。(B′–D′)Ki67信号来自B–D类以增强的对比度显示。(E类)与对照组和对照组相比，NICD过度表达显著增加了颗粒下区（SGZ）、门和分子层的增殖细胞数量槽口1cKO组。每毫米Ki67阳性细胞的平均数量^三对照组动物用于正常化。(F类)当比较NICD Tg和槽口1cKO动物与对照。大量细胞离开细胞周期槽口1cKO动物比对照组或NICD-Tg动物只有7%的细胞离开细胞周期。(G公司)增殖细胞的表型在槽口1cKO动物中Gfap较少⁺细胞增殖速度减慢。（为了清晰起见，未显示Dcx/Gfap的免疫染色。）(H–J型)DG组织切片上的CldU（红色）/IdU（绿色）免疫组织化学。(H′-J′)来自的CldU信号H–J型以增强的对比度显示，SGZ的上限用红色虚线标记。(K（K）)NICD-Tg组中CldU和IdU标记的细胞数量增加。每毫米CldU或IdU阳性细胞的平均数量^三对照组动物用于正常化。(L（左）)NICD Tg小鼠的CldU/IdU双阳性细胞数比对照组增加了近三倍缺口1cKO动物。每毫米CldU/IdU双阳性细胞的平均数量^三对照组动物用于正常化。(M（M）)氯丁橡胶⁺灌注前一周合成DNA的细胞在NICD-Tg动物中优先保留在颗粒下区，而在槽口1cKO动物CldU⁺细胞优先分布于颗粒细胞层。每毫米CldU阳性细胞的平均数量^三对照组动物用于正常化。注释n个=每个实验组6个。星号表示实验组之间的统计差异（*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.001; 学生的吨测试：E–G公司,K–M公司). 误差条代表SEM。（比例尺：B–D′和H–J′，100微米）

接下来，用另一种DNA合成标记物氯脱氧尿苷（CldU）对IdU进行双重免疫标记，该标记物在P16注射，在IdU前一周注射（P23注射），以及在P14进行最后一次他莫昔芬注射后两天注射。这两种胸腺嘧啶类似物的特异性单克隆抗体可对组织中的任一化合物进行特异性识别，从而鉴定两组S期细胞(23). 同样，单标记的CldU增加了两倍多⁺或IdU⁺与对照组和槽口1cKO小鼠。当计算CldU和IdU双阳性细胞时（这表明P16和P23处都有细胞增殖），对照动物和槽口1cKO小鼠，但CldU增加了3倍⁺/识别码⁺NICD-Tg小鼠的细胞与其他两组的比较(图3K（K）). 此外，标记细胞的模式槽口1cKO小鼠在大多数CldU中发生改变⁺与对照组相比，SGZ和GCL中的细胞比例更加平衡，表明CldU的迁移增加⁺中的单元格槽口1cKO小鼠(图3 我和M（M）). 相反，在NICD Tg动物中，很少有细胞迁移到GCL，这与观察到的细胞周期退出的缺乏一致(图3 J型和M（M）). 这些结果表明，切除海马中的Notch1会增加离开细胞周期的祖细胞数量，而过度表达NICD会减少细胞周期退出。

Notch1基因操作后新生神经元数量的变化。

由于这些群体是遗传嵌合体，我们培育了Rosa26(53)和CAG-CAT-GFP(24,25)记者分成每组。通过使用与中所示相同的TM给药方案和灌注时间图3A类，检查每组动物中单独表达GFP（各种细胞类型）或与Gfap/Sox2（星形胶质细胞/祖细胞）或Dcx（新神经元）组合表达GFP的SGZ/GCL细胞的百分比。与细胞周期退出数据一致，Notch1缺失导致新神经元数量显著增加，但牺牲了祖细胞和其他细胞类型(图4B类). 相反，NICD-Tg动物中的GFP细胞绝大多数与Gfap和Sox2共定位，表明NICD具有维持SGZ/GCL中胶质祖细胞的功能(图4B类). 各组或报告菌株之间重组细胞的平均重组率或密度没有明显差异（数据未显示）。Cre+对照组的总体细胞死亡增加，槽口1cKO和NICD-Tg动物，但对濒死细胞的表型进行检查并没有得出一种模式，表明凋亡是细胞命运转变的重要原因(SI图12). 与Cre−动物相比，Cre+对照组的死亡率增加，表明Cre毒性是本试验中的一个重要因素，因此在解释此类Cre品系的存活数据时需要谨慎(21). 细胞命运的这种相互改变在可比较的成年幼鼠中也可以看到，但百分比低于在幼鼠中看到的百分比(图4C类). 这些结果表明，Notch1的细胞自主操作导致Gfap阳性干细胞与新生神经元的比率发生动态变化。

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图4。

DG中细胞命运的细胞自主变化。(A类)在组织免疫染色Dcx（红色）、Sox2（蓝色）和Gfap（洋红色）的SGZ中诱导GFP（绿色）报告基因表达。GFP+胶质细胞示例(A′)显示Sox2和Gfap的表达。(A〃)GCL中的GFP+/Dcx+神经元。(B类)Notch1 cKO动物表现出优先生成神经元，但NICD Tg小鼠表现出以神经元为代价的胶质细胞的戏剧性维持。(C类)在处死前1周给予三苯氧胺的4-6个月大的小鼠中，细胞命运也发生了同样的相互改变。注释n个=每个实验组4个。星号表示实验组之间的统计差异（*，P（P）< 0.05; **,P（P）< 0.001; 学生的吨测试；B类和E类). 误差条代表SEM。（比例尺：A-A〃,C-C′，10微米；D类，50微米）

出生后大脑中的反应性神经发生。

值得注意的是，过度增殖和形态可塑性的模式与创伤后神经发生的改变相似，表明Notch1可能是体内创伤后神经原反应调节剂(37–40). 与这一观点一致，癫痫持续状态后SGZ中Hes5和Ascl1 mRNA水平显著改变(41)和缺血(42). 众所周知，癫痫是齿状回神经发生最深刻的刺激因素之一。不同的实验模型显示出不同程度的神经发生。令人惊讶的是，在新生儿群体中，神经发生增加的同时，树突也发生了显著变化(40). 此外，由于我们观察到神经发生的短暂增加，可以想象，Notch信号被其他成年神经发生的有力刺激物（如跑步）以分级方式激活(43)，缺血(44)和病灶(45). 特别是，最近已经观察到Notch信号传导介导深刻的缺血后反应(46)Notch相关分子表达模式的动态变化表明Notch参与了损伤后(47)和缺血后神经原性反应(42,44).

新生神经元的树突改变。

我们还发现，新生海马神经元中Notch的基因操作改变了树突的形态。体外，Notch被发现对皮层神经元的树状化有深远的影响(26–28). 我们的结果与此一致，表明新生神经元的树突树状结构受到调节体内以基于Notch受体裂解的剂量依赖性方式。然而，由于Notch信号水平随癫痫发作而变化(41)，缺血(46)以及潜在的许多其他刺激因素，树突树枝化的这种变化可能不完全是人为的，并且可以反映出生理上的挑战。例如，最近有研究表明，自愿运动可以显著改变齿状回的树突形态和复杂性(48,49)除了在神经发生中的已知功能外(43).

我们的数据揭示了Notch信号在从祖细胞向成熟神经元过渡过程中的整体复杂性，显示了其在出生后神经发生过程中的中心作用，并提高了其在创伤或环境刺激导致的可塑性中发挥作用的可能性。Notch在一种情况下刺激内源性祖细胞的增殖，但在成熟神经元中调节结构可塑性和生存途径，表明对Notch的不同临床操作可以在疾病、创伤或病理老化后的多方面帮助功能恢复。

我们感谢C.Anderson、J.Bao和M.Pappy的出色实验协助；D.Anderson、J.Aster、M.Colbert、A.Israel、J.Johnson、W.Pear、F.Radtke和J.Shen用于小鼠和试剂；以及J.Arellano、K.Burns、R.Duman、M.Givogri、K.Hashimoto-torii、K.Herrup、C.Y.Kuan、J.Loturco、R.Rasin、M.Sarkisian、T.Town以及P.R.和N.Š的成员。实验室进行有益的讨论、技术支持和评论。这项工作得到了美国国立卫生研究院R01 MH067715、HD045481、AG019394和NS047200的支持；一角硬币出生缺陷基金会拨款FY05-73；以及卡夫利研究所。