Twinfilin是肌动蛋白依赖性发育过程所必需的果蝇属

隔离双丝蛋白突变体

梅宝尼伯克利酒店果蝇属基因组项目（加利福尼亚州伯克利）已确定P元件插入(图3A） 映射到的双丝蛋白的第一个介绍。Southern印迹实验表明，该菌株只有一个P元素（未发表的数据）。在该菌株EP（3）3701中，几乎没有观察到纯合子。这种半致死性并不是由于P元素的插入，因为在EP（3）3701菌株的杂交中出现了正常数量的跨异卵体，其中几个菌株携带大的缺失，揭示了双丝蛋白基因。这种假定的第二位点突变来自EP（3）3701菌株，产生了一个活的纯合子株。我们将此露头应变指定为twf公司 ³⁷⁰¹。除此之外双丝蛋白，编码果蝇属Abelson相互作用蛋白（dAbi）^*(Juang和Hoffmann，1999年)靠近P元素插入位置(图3A） ●●●●。Northern杂交分析显示阿布转录在twf公司 ³⁷⁰¹应变，而双丝蛋白mRNA表达显著降低(图3B） ●●●●。这表明P元素插入线，twf公司 ³⁷⁰¹，代表一种特殊的强烈的亚形态双丝蛋白突变体。

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图3。

鉴定 双丝蛋白 轨迹。（A） 基因组组织twf公司及其周围的位点。箭头代表转录的方向。的四个外显子双丝蛋白如图所示；空框表示5′和3′UTR，黑框表示编码区域。倒三角形显示EP（3）3701插入部位的位置(twf公司 ³⁷⁰¹). （B） Northern印迹包含40μg从野生型和双丝蛋白突变蛹与阿布,twf公司、和第49页（装载控制）探头。的级别twf公司成绩单在twf公司 ³⁷⁰¹突变体。（C） Western blot含有60 ng细菌表达的twinfilin和等量的野生型和twf公司 ³⁷⁰¹用抗双丝蛋白抗血清探测突变幼虫。在突变幼虫提取物中未检测到twinfilin蛋白。在过度接触印迹后可以检测到少量（未公布的数据）。（D） 含有所有发育阶段总RNA的Northern杂交双丝蛋白：以小时为单位的指定年龄的胚胎（1-4道）、三个幼虫龄期（5-7道）、蛹（8道）、成年雄性（9道）、雌性（10道）和无卵巢的雌性（11道）。用同样的斑点探测第49页加载控制如下所示。

Twinfilin广泛表达

我们制备了兔抗纯化重组抗体果蝇属为了研究其在发育过程中的表达。在幼虫提取物中，twinfilin抗血清识别出一个单一的～40-kD带，表明抗血清是特异性的，并且果蝇属twinfilin没有任何翻译后修饰。此外，在twf公司 ³⁷⁰¹突变幼虫提取物(图3C） ●●●●。不同发育阶段总RNA的Northern杂交双丝蛋白探针显示双丝蛋白无处不在(图3D） ●●●●。

我们还将抗血清用于野生型全山免疫染色(图4A） 和twf公司 ³⁷⁰¹胚胎(图4B） ●●●●。免疫前血清没有染色整批(图4C） 突变体胚胎中的twinfilin数量显著减少。在野生型胚胎中，twinfilin蛋白在整个胚胎发生过程中均匀分布(图4、A、D和E)而且也是母体提供的，因为在合子转录开始之前，早期胚胎中已经存在这种蛋白质(图4D） ●●●●。

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图4。

Twinfilin在胚胎和卵巢中广泛表达。野生型（A和C–E）和twf公司 ³⁷⁰¹突变（B）胚胎用抗文氏蛋白抗血清或免疫前血清染色。（D） Twinfilin在野生型10期胚胎中高度普遍表达（侧视图）。（B） 染色在twf公司 ³⁷⁰¹突变体。（C） 免疫前血清未见染色。（D） 早期5期胚胎具有大量母体提供的双子精。（E） Twinfilin在整个胚胎发生过程中大量存在，如14晚期胚胎（背视图）所示。（F和G）野生型10期（F）和9期（G）卵泡的共聚焦切片，用抗winfilin抗血清染色，显示twinfilin定位于细胞质和细胞膜。Twinfilin也在边界细胞中强烈表达（G中的箭头）。棒材，50μm。

Twinfilin存在于所有卵巢细胞的细胞质和质膜中(图4F） ，并且在边界细胞中含量丰富(图4G） ●●●●。这个双星基因，编码果蝇属的ADF/cofilin对卵巢边界细胞迁移至关重要(Chen等人，2001年). 这让我们研究了这一过程是否也受到影响twf公司 ³⁷⁰¹变异卵子室。然而，我们没有检测到边界细胞迁移中的任何缺陷（未发表的数据），这表明与ADF/cofilin相比，边界细胞的迁移并不依赖于高水平的twinfilin。

形态和发育缺陷双丝蛋白变种苍蝇

这个twf公司 ³⁷⁰¹突变果蝇可以保持纯合子。然而，变种果蝇的体型略小，似乎比野生型果蝇活动较少。飞行测试中，年龄较大twf公司 ³⁷⁰¹突变体苍蝇表现出飞行能力下降或完全丧失。年孵化率也略有下降twf公司 ³⁷⁰¹突变体。这个twf公司 ³⁷⁰¹与野生型苍蝇相比，突变体的幼虫期也显著延长，但蛹期的持续时间相同（未公布的数据）。

这个twf公司 ³⁷⁰¹突变体具有粗糙的眼睛表型，并通过扫描电子显微镜（SEM）进行了仔细检查(图5，J–M）表明，公系间鬃毛通常是簇状的(图5M） 而在野生型眼睛中，刚毛在小眼之间呈规则排列(图5K） ●●●●。中的小马twf公司 ³⁷⁰¹突变体有时有核，有时融合。有趣的是，以前曾报道过类似的表型双焦点果蝇突变体眼睛，这也是由于肌动蛋白细胞骨架的改变引起的(Bahri等人，1997年).

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图5。

twf公司突变体在鬃毛形态和眼睛中有缺陷，并且在遗传上与双星（tsr）突变体。鬃毛（A-I和N-Q）和眼睛（J-M）的扫描电子显微照片。（A） 野生型和（B）的整个胸部twf公司 ³⁷⁰¹突变成虫。注意弯曲和开裂的猪鬃。（C） 野生型和（D）twf公司 ³⁷⁰¹突变体。注意表面上排列不规则的纹路和比野生型短的毛发。（E） 野生型大棘类的表面，有直的纵向脊。（F） 突变体增稠twf公司 ³⁷⁰¹具有与鬃毛长轴垂直排列的脊的大毛动物。（G） 高倍图像twf公司 ³⁷⁰¹长有高度不规则脊的大毛茛。（H） 野生型刚毛的尖端和（I）twf公司 ³⁷⁰¹变异鬃毛。注意，与野生型鬃毛相比，表面光滑。（J） 野生型眼睛和（L）twf公司 ³⁷⁰¹变异眼。（K） 高倍放大野生型小眼和小眼间鬃毛。（M） 在twf公司 ³⁷⁰¹突变体间的刚毛通常丛生，小眼有时融合（箭头）或麻点（箭头）。（N和O）后脑盾鬃毛坦桑尼亚先令/+;twf公司/+双杂合子显示钩状（N）或裂尖（O）。（P和Q）正常尖端坦桑尼亚先令/+; +/+ （P） 和a/+；twf公司/+（Q）鬃毛。棒材：（A、B、J和L）100μm；（C–F、K和M）10μM；和（G-I和N-Q）5μm。

特温菲林突变体有缺陷的鬃毛形态

最明显的外部表型twf公司 ³⁷⁰¹苍蝇是猪鬃形态的缺陷。成人鬃毛果蝇属是沿着鬃毛延伸的具有脊和凹槽的几丁质结构，向尖端逐渐变细。刚毛轴由单个细胞形成，肌动蛋白纤维束沿着发育中的刚毛的长度分布在质膜上，决定了成年刚毛的外部形状(奥弗顿，1967年;Appel等人，1993年;Tilney等人，2000a). 在twf公司 ³⁷⁰¹突变体，所有鬃毛都受到影响(图5，A–I），大花科(图5，E–G）比微血管更严重(图5、C和D). 头发也比正常稍短(图5、C和D). 中的大毛虫twf公司 ³⁷⁰¹突变体苍蝇比野生型苍蝇矮，表面粗糙。SEM显示twf公司 ³⁷⁰¹突变体的大毛类高度不规则(图5、F和G)与野生型猪鬃中看到的完全笔直的脊和槽相比(图5E） ●●●●。刷毛通常在轴的某个地方有一个较厚的部分(图5F） 在加厚处，脊垂直于长轴。刚毛的尖端也不像野生型苍蝇那么薄，表面光滑，只有短而随意排列的脊(图5、H和I). 大毛类而非小毛类通常弯曲、分裂或分支(图5B） ●●●●。所描述的鬃毛表型在twf公司 ³⁷⁰¹/Df（3R）SuHw公司 ⁷杂合子，携带一个大的缺失，揭示了twf公司基因（未发表的数据）。这表明twf公司 ³⁷⁰¹在鬃毛发育方面，等位基因接近于零。

特温菲林显示与双星

在酵母中，缺乏twinfilin不会导致可检测的表型，除了轻微增大的皮层肌动蛋白斑块。与温度敏感的cofilin等位基因结合，twinfilin在允许的温度下导致死亡(Goode等人，1998年). 在果蝇属，cofilin由双星(坦桑尼亚先令)基因(Edwards等人，1994年;Gunsalus等人，1995年). 为了研究双丝蛋白和双星，我们越过了P元素线坦桑尼亚先令 ^k05633电话，它有致命的插入双星，使用twf公司 ³⁷⁰¹纯合子，并检查产生的双杂合子的鬃毛表型。几乎所有的苍蝇都至少有一个毛状毛有缺陷(图5，N–Q）。到目前为止，胸部的双侧后盾状刷毛和前背穿刺刷毛最常受到影响。我们在高倍镜下对这四根鬃毛进行异常评分。在坦桑尼亚先令 ^k05633电话/+;twf公司 ³⁷⁰¹/+苍蝇，66%的鬃毛分裂、分叉或表面粗糙，而只有2%的鬃毛坦桑尼亚先令 ^k05633电话/+; +/+ 苍蝇，+/+上没有刚毛；twf公司 ³⁷⁰¹/+苍蝇具有这种表型。单身汉的存在坦桑尼亚先令 ^k05633电话等位基因twf公司 ³⁷⁰¹纯合子背景导致更严重的眼部缺陷，而鬃毛表型的严重程度似乎与twf公司 ³⁷⁰¹仅突变体（未公布的数据）。这些结果表明双丝蛋白与ADF/cofilin编码基因发生遗传相互作用双星在刚毛和眼睛形态发生期间。

肌动蛋白束在发育中严重定向错误双丝蛋白变异鬃毛

为了观察发育中的突变大毛类的肌动蛋白束，我们对来自twf公司 ³⁷⁰¹/twf公司 ³⁷⁰¹和twf公司 ³⁷⁰¹/Df（3R）SuHw公司 ⁷蛹与德克萨斯红结合的卵磷脂，并使用共焦显微镜进行检查。在野生型刚毛中，肌动蛋白束位于发育中刚毛的外围(图6A） 在伸长阶段，鬃毛尖端形成新的肌动蛋白丝。这些新形成的丝状物在尖端以及肌动蛋白束之间可见为卵磷脂阳性斑点。细丝被聚集成微小的肌动蛋白束，这些肌动蛋白束被添加到先前存在的较厚的肌动蛋白束中。在完全拉长的48小时龄猪鬃中，含肌动蛋白的斑点不再可见，只能看到肌动蛋白束(Tilney等人，1996年).

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图6。

缺乏孪生纤维蛋白会导致发育中的刚毛中肌动蛋白纤维束紊乱。共焦截面通过野生型（A和F）的投影，twf公司 ³⁷⁰¹/twf公司³⁷⁰¹（B–D）和twf公司 ³⁷⁰¹/Df（3R）上限⁷（E和G–I）蛹鬃毛。从48小时龄的蛹上解剖了鬃毛，但C除外，C取自41小时龄的蚕蛹。（A） 野生型刚毛的中部显示出直的肌动蛋白束。（B） 突变体鬃毛，束之间含有F-actin斑点。注意管束厚度的变化。（C） 变异猪鬃具有垂直于猪鬃长轴的细束。（D） 束方向错误，垂直于长轴，并在鬃毛上形成一个旋钮。（E） 弱荧光束缠绕在刚毛周围，而直的强荧光束似乎位于内部。（F） 野生型鬃毛的尖端。（G） 在变异猪鬃尖端，许多微小的束与主束垂直。（H） 突变体鬃毛尖端的表面视图，在细小的鬃毛束中可以看到一些较厚的鬃毛。（一） 有两个弯曲的变异鬃毛。在弯曲点处，刚毛末端基底部分的主要束。棒材，10μm。

最引人注目的观察结果是在48小时大的婴儿中存在大量含有F-肌动蛋白的小斑点或微小的肌动蛋白束twf公司 ³⁷⁰¹突变大毛类。斑点位于主束之间的鬃毛表面(图6B） 这些小束似乎垂直于鬃毛的长轴(图6、C和G). 鬃毛尖端有少量随机定向脊的平坦表面(图5一） 这与许多短而薄的管束与一些较厚的管束混杂在一起有关(图6、G和H). 此外，大毛类中的主要束通常严重紊乱。我们看到弱荧光束向猪鬃周围偏移，然后似乎围绕猪鬃扭转，而剩下的直的强荧光束似乎位于猪鬃内部(图6、D和E). 扫描电镜观察到的一些成年猪鬃的增厚(图5F） 对应于从表面垂直突出的松散束(图6D） ●●●●。

随机定向的纤维束最终会重组成主纤维束，使鬃毛向新的方向延伸。图6我展示了一只弯了两次的大鲨鱼。最初从底部延伸的方向正确的主束似乎在弯曲点结束，而另一组束则朝着新的方向生长。

蛋白质和抗体

果蝇属twinfilin被纯化为谷胱甘肽S公司-与小鼠twinfilin相似的转移酶融合(Vartiainen等人，2000年). 用丙酮粉末制备兔肌肉肌动蛋白(帕迪和斯普迪奇，1982年). 芘肌动蛋白和人血小板肌动蛋白来源于细胞骨架。我们用纯化的重组蛋白免疫了一只新西兰白兔果蝇属弗氏佐剂中的twinfilin，四次免疫后收集血清。从同一只兔子身上采集免疫前血清，并在我们的试验中用作对照。

肌动蛋白丝共沉淀分析

将40μl等分肌动蛋白在G缓冲液中稀释至所需浓度（20 mM Tris，pH 7.5，0.2 mM ATP，0.2 mM DTT，0.2 mM-CaCl₂)并通过添加5μl 10×起始混合物（20 mM MgCl）聚合30分钟₂，10mM ATP，1M KCl）。将G缓冲液中的5μl twinfilin添加到细丝中并孵育30分钟。我们通过在217000℃的Beckman Optima MAX超离心机中离心样品30分钟来沉淀肌动蛋白细丝克使用TLA100转子。所有步骤均在室温下进行。将等比例的上清液和颗粒加载在12%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，凝胶用考马斯蓝染色并用荧光扫描^TM（TM）-成像仪（生物实验室）。肌动蛋白和孪生蛋白带的强度通过QuantityOne程序（Bio-Rad Laboratories）进行量化。

肌动蛋白丝组装分析

用芘荧光监测肌动蛋白丝的组装和拆卸动力学，荧光激发波长为365nm，发射波长为407nm，使用BioLogic MOS-250荧光分光光度计。对于组装分析，64μl G缓冲液（5 mM Tris，pH 7.5，0.2 mM ATP，0.2 mM-DTT，0.2 mM/CaCl₂)将含有3.75μM肌动蛋白（1:6芘肌动蛋白：人类血小板肌动蛋白）的混合物与8μl G缓冲液或15/30μM双氟灵混合。通过添加8μl 10×引发混合物诱导聚合。对于拆卸试验，通过添加1/10 vol的10×起始混合物1 h聚合G缓冲液中的3.3μM肌动蛋白（1:6芘肌动蛋白：人类血小板肌动蛋白）。通过将72μl细丝与8μl G缓冲液或15/30μM双子蛋白混合，诱导细丝解聚。

蛋白质印迹

野生型和突变型幼虫用含有溶解的蛋白酶抑制剂鸡尾酒片剂（Roche）的PBS洗涤。幼虫用Dounce均质器均质，所得细胞用1%Triton X-100溶解。细胞裂解液中的蛋白质在12%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶上分离，电印迹在硝化纤维素膜上，并用1:2000稀释的抗温蛋白抗血清进行免疫印迹。

扫描电镜

用一氧化碳麻醉整只成年苍蝇₂然后在分级乙醇系列中通过24h培养脱水。将脱水苍蝇进行临界点干燥，安装在SEM存根上，溅射铂涂层，并用SEM进行检查。

蝇种和遗传学

菌株Df（3R）SuHw公司 ⁷/TM6Tb型和tsr公司 ^k05633电话/青色从布鲁明顿库存中心（印第安纳州布鲁明顿）获得。伯克利大学鉴定了EP（3）3701菌株果蝇属基因组项目（加利福尼亚州伯克利），从塞格德库存中心（匈牙利塞格德）获得。原始EP（3）3701菌株（结果）中假定的半致死性元素与w个应变。露头纯合子砧木有-w个结果部分描述了眼睛颜色标记和鬃毛表型。之间的遗传相互作用双丝蛋白和双星在以下杂交后代中进行检测坦桑尼亚先令 ^k05633电话/循环氧男性和twf公司 ³⁷⁰¹纯合子女性。用光学显微镜和扫描电镜以及坦桑尼亚先令 ^k05633电话/+和twf公司 ³⁷⁰¹/+控制飞行。S州，或w个在所有实验中，菌株被用作野生型对照。苍蝇被保存在25°C的标准食物上。

刷毛的Phalloidin染色

在蛹化后32–48小时，收集白色预蛹并在PBS中解剖。我们从胸部解剖了头部和腹部，并切除了内脏。在腹部切开后，上皮组织被压平，然后转移到含有4%多聚甲醛的PBS Eppendorf管中，并放置在冰上。按照中所述对试样进行进一步处理Tilney等人（1996年）丝状肌动蛋白用浓度为2 U/ml的得克萨斯红结合指骨肽染色。样品安装在Vectashield（Vector Laboratories）中，并用Biorad MRC 1024共聚焦显微镜进行检查。使用共焦助手4.02程序组合光学部分。

免疫染色

野生型和行波管 ³⁷⁰¹根据标准方案收集、固定和染色胚胎。将抗winfilin抗血清和免疫前血清稀释至1:20000，并在相同条件下进行所有染色。对于猪鬃的抗体染色，按照上述方法固定和清洗材料，然后在1%BSA、0.1%Triton X-100和PBS中封闭1h。使用1:10000稀释度的抗winfilin抗血清，以及1:1000稀释度的FITC-结合二级抗体。按照上述方法解剖、固定卵巢，并用twinfilin抗血清染色，但在0.5%BSA和0.1%Triton X-100 PBS中阻断。卵巢安装在含有0.5μg/ml Hoechst 33258的Vectashield中。

我们感谢塞格德库存中心（匈牙利塞格德）提供EP（3）3701菌株，并感谢布鲁明顿库存中心（印第安纳州布鲁明顿）提供其他菌株果蝇属菌株。

这项研究得到了维多利亚基金会（G.Wahlström）、芬兰科学院（P.Lappalainen）和赫尔辛基生物中心（P.RappalainEN和T.I.Heino）的资助。