结果
ECM相关细胞中非门控整合素的表达导致细胞死亡
很明显，细胞粘附发生在体内其他ECM粘附的细胞之间。为了评估整合素连接状态对粘附细胞存活的影响，我们在三维胶原ECM中检测了αvβ3表达的癌T24E(Ilan等人，1998年). 胶原蛋白为特定的β1整合素提供配体，例如α1β1、α2β1和α3β1(Takada等人，1988年)但不适用于αvβ3(Filardo等人，1995年)在这些细胞上表达。胶原培养48-72小时内，T24E细胞发生凋亡，表现出广泛的气泡、膜联蛋白V染色和核塌陷。相反，T24E细胞因整合素αvβ3（T24E-L；A） 基质中的存活率增加（72小时存活率增加约两倍；B） ●●●●。为了评估αvβ3表达水平是否与这些事件有关，T24E-L细胞用αvβ2（T24E-Lβ3）进行基因重组。这导致细胞加速死亡（缺乏αvβ3的T24E-L细胞在24小时内死亡50%，而在72小时内死亡；B、 左），表明αvβ3增强了ECM内这些细胞的死亡。重要的是，αvβ3的表达通常不会对细胞有害。所有T24细胞系以相似的速度增殖，并显示出可比较的基础凋亡率（未发表的数据）。整合素αvβ3的表达一般来说并不有害，因为当去除生长因子时，它具有生存优势(B、 右），导致细胞死亡显著减少。因此，只有在缺乏适当配体的情况下，αvβ3的表达才与细胞死亡相关。
整合素的表达α五β3增加与不结扎的ECM相连的细胞的死亡α五β三。（A） T24E-L细胞来源于T24E细胞，通过连续分选选择β3缺乏人群。来自T24E-L的T24E-Lβ3细胞通过基因重组进行αvβ3表达。通过使用单克隆抗体LM609的流式细胞术（直方图）和使用单克隆抗体AP3的β3整合素亚单位的免疫印迹（插图）显示了这些系中的相对αvβ3整合素表达。（B） 在有血清存在的胶原蛋白凝胶中培养期间，测定了这些细胞变体的存活率（左）。通过凋亡形态学（冷凝、卫星阵列；Cho和Klemke，2000年). 所示细胞存活率代表代表性实验中三个重复微孔的平均值±SE。在血清剥夺后，还评估了T24E、T24E-L和T24E-L-β3细胞的活性（右）。通过免疫荧光显微镜评估PI在进展时间点的排除情况来确定生存能力。所示数据来自一个代表性实验，代表了三个重复井的平均±SE生存能力。（C） 以前已经描述过整合素αvβ3在CS1β3细胞系中的稳定表达(Filardo等人，1995年). 培养CS1亲代细胞（缺乏αvβ3）或CS1β3细胞作为组织培养（对照CS1β2，黑色直方图）、胶原培养（灰色直方图。在完全培养基中培养20小时后，通过annexin-V染色和FACS评估细胞凋亡®分析。显示了两个代表性实验。
为了扩展这些观察结果，我们接下来检查了锚定非依赖性CS1黑色素瘤细胞系，该细胞系在悬浮状态下存活和增殖，因此，不需要整合素介导的信号来维持生存能力。然而，具有整合素αvβ3重组表达的CS1β3细胞(Filardo等人，1995年)在胶原凝胶培养或悬浮培养中，当αvβ3配体被剥夺时，细胞发生凋亡(C） 而亲代CS1细胞没有。在这种情况下，非门控αvβ3的简单表达是促凋亡的，因此克服了这些细胞的锚定非依赖性表型。这些结果表明，在缺乏适当配体的情况下，整合素的表达（在本例中为αvβ3）可以诱导细胞凋亡。
内皮细胞在纤维蛋白（一种连接整合素αvβ3和至少两个β1整合素的ECM）中培养时存活，但在胶原中培养时发生凋亡(A）(Filardo等人，1995年). 同样，内皮细胞在胶原凝胶表面培养时会发生凋亡，而在纤维蛋白凝胶上则不会(A、 开放式酒吧）。死亡的诱导不仅仅是由于无法附着和扩散到胶原蛋白上，因为内皮细胞在胶原蛋白和纤维蛋白上的扩散程度相同，动力学相似(B） ●●●●。然而，在胶原上培养的内皮细胞易于凋亡，导致laemelopod收缩、起泡、核凝结，并最终脱离。
降低内源性整合素的表达α五β3减少胶原培养过程中内皮细胞的凋亡。（A） 内皮细胞在完整培养基存在下培养于三维胶原基质中时发生凋亡。HUVEC用Cell Tracker green（2μM）标记，并在三维胶原凝胶、纤维蛋白凝胶或悬浮液（填充棒）中培养24小时，或者在胶原或纤维蛋白凝胶（开放棒）表面培养24小时。通过数字图像的形态学分析，对ECM相关细胞的凋亡进行评分。显示了一个具有代表性的实验，每个bar是六个低功率场的平均存活率±SE。（B） 捕获细胞跟踪器标记细胞的数字图像（左）后，在胶原（Col）或纤维蛋白（Fb）凝胶表面附着的HUVEC中评估细胞扩散。使用IP Lab软件分割细胞并计算面积。每个点显示的数据是从10个低功率场在每个时间点计算的平均±SE电池面积。（C） 使用LM609 for FACS检测腺病毒（AdASβ3）或无义腺病毒（AdNS）介导的人特异性β3整合素反义基因治疗对HUVEC中天然αvβ3表达的影响®免疫印迹分析和AP3A.（D）如上所述，在三维胶原凝胶（左）或纤维蛋白凝胶（右）中培养24小时后，评估AdASβ3处理（或AdNS处理）的HUVEC的存活细胞百分比。结果显示为两种纤维蛋白或四种胶原蛋白实验的平均值±SE。（E） β3反义处理的HUVEC表现出正常水平的ECM附着。对经AdASβ3处理的HUVEC（填充棒）与ECM组分卵黄凝集素（VN）、纤维连接蛋白（FN）、层粘连蛋白（LN）和胶原（COL）涂层的微孔的粘附性进行评估。附着细胞用结晶紫染色，然后洗涤、重新提取和定量结合染料，以此定量粘附(Filardo等人，1995年)与未经处理的HUVEC相关。AdNS-处理的HUVEC（开放栏）显示为控件。显示了两个独立实验的平均值±SE。（F） 如上所述，在胶原蛋白（左）或纤维蛋白（右）凝胶中，在30μg/ml单克隆抗体P4C10（抗β1整合素）、单克隆抗体LM609（抗αvβ3整合素，两种抗体或对照单克隆抗体7G7B6（抗CD25）的存在下，检测HUVEC存活率。24小时存活率显著下降(P（P）<0.05）。显示了两个类似实验中的一个。
为了确定这些细胞上内源性αvβ3的存在是否与这种凋亡事件有关，采用反义策略抑制内源性αvβ3整合素的表达(Dallabrida等人，2000年). 降低这些细胞上的αvβ3水平（40–60%；C） 导致胶原蛋白存活率显著增加（两倍）(D、 左），不显著影响纤维蛋白的存活率(D、 右）或细胞粘附到纤维连接蛋白、层粘连蛋白、玻璃体凝集素，重要的是，胶原蛋白(E） ●●●●。作为评估整合素在细胞生存中作用的第二种方法，针对整合素αvβ3或β1的单克隆抗体被用作整合素功能的拮抗剂。在这种情况下，干扰β1整合素功能会加速胶原凝胶中的细胞凋亡(F、 左），而阻断β1或αvβ3可降低纤维蛋白凝胶的存活率(F、 右侧）。该结果与之前的观察结果一致，即αvβ3和α5β1都结合纤维蛋白(Yee等人，2001年). 总之，这些结果表明，内源性非门控整合素表达的减少可以抑制ECM粘附细胞的凋亡，而整合素的表达增加则积极促进凋亡。连接时能促进存活，但未连接时能诱导细胞凋亡，这是依赖性受体的标志，如神经生长因子受体p75NGFR和网红蛋白受体DCC(Bredesen等人，1998年;Mehlen等人，1998年). 我们的研究结果表明，整合素也可以被视为依赖性受体。
整合素β亚基的细胞质域是促凋亡的
整合素介导的信号主要依赖于α和β亚单位的细胞质域。为了确定整合素胞质域是否足以诱导死亡，由CD25胞外域（IL2Ra，Tac）和整合素α5、β1或β3胞质域组成的嵌合蛋白(LaFlamem等人，1992年)在COS7细胞中表达。Tac-β1或Tac-α3结构体的表达导致死亡增加，而α5嵌合体的表达没有导致死亡增加(A） ，尽管表达水平相似(B） ●●●●。Tac-β3表达在附着细胞中产生剂量依赖性死亡(B） ●●●●。重要的是，这些整合素的表达与天然整合素的表达相似，或小于天然整合素的表达。如膜联蛋白-V反应所示，死亡是通过细胞凋亡发生的(C、 top），并通过将caspase底物聚ADP-核糖聚合酶（PARP）加工成特征性85-kD凋亡片段(C、 底部）。Tacβ3或Tacβ1可有效诱导IMD，但Tacβ5仅能微弱诱导IMD(D） ●●●●。
整合素胞质域足以诱导细胞凋亡。（A） 在COS7细胞中表达由整合素α5、β1或β3的细胞质域和CD25（Tac）的细胞外和跨膜区域组成的嵌合结构，36小时后通过PI排除法测定Tac表达阳性细胞（FITC-7G7B6阳性）的存活率。（B） 分析增加Tac-β3或对照Tac-α5表达对细胞活力的影响。如图所示，约25–35%的所有细胞表达Tac升高（顶部、MED和HI人群）。为了量化死亡，根据平均荧光强度（LO、MED和HI；顶部）分离转染细胞。通过PI排除法（底部）确定这些种群的生存能力。大约30-50%的Tac-β3表达细胞（MED和HI）在检测过程中死亡，或约8-16%的COS7细胞总数死亡。（C） 表达Tac-β3的COS7细胞表现出典型的凋亡标志物。转染后18h，去除非粘附细胞并丢弃；通过annexin-V–FITC染色（上图），仅对那些仍然附着的细胞进行凋亡开始的评估。每个条形代表三个独立实验中膜联蛋白阳性细胞的平均百分比（±SE）。转染36小时后，通过细胞总裂解物的Western blotting检测执行者caspase底物PARP的裂解。Caspase-leaded PARP被检测为具有凋亡特征的85-kD片段（底部）。将切割片段的相对强度量化为相对于未切割PARP的比率，包括来自非表达细胞的PARP，以给出执行者半胱天冬酶激活的相对指示。导出的PARP比率显示为：脂质体对照，0.004；Tac-β3，0.17。（D） 通过PARP的相对裂解来测定半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性，并将其作为pCI-NeoTac转染的剂量依赖性数量。用编码整合素尾部构建体的cDNA转染COS7细胞。大约25-40%的细胞表达Tac，并且在每个转染剂量的构建体之间观察到类似的表达。表达Tacβ1、Tacβ3、对照Tacα5以及表达β5胞质结构域（Tacβ5）的嵌合体的效果被确定为caspase活性的平均值±SE（如上文所述，用三个独立实验中的p85/p115强度测量）。
整合素尾部的膜近端序列足以诱导附着细胞的凋亡
作为解决IMD所需的β整合素尾部区域的初始方法，在Tac-β3的细胞质域中进行连续截断(A） ●●●●。通过碘化丙啶（PI）排除法分析表达每个截断结构的细胞的细胞死亡情况(B） 以及PARP裂解所示的执行器半胱天冬酶的激活(C） ●●●●。在β3 718–727的膜近端序列KLLITIHDRKEF中发现了诱导凋亡所需的最小序列(). 有趣的是，该区域不足以通过先前特征化的生存途径介导信号传导，包括通过Src、Shc或黏着斑激酶(Wary等人，1996年;Tahiliani等人，1997年;Hauck等人，2001年). 因此，IMD不太可能通过破坏已知的生存信号通路来进行。
IMD需要整合素细胞质域的膜定位区域。（A） 在pCI-Neo中构建了一系列具有天然整合素β3胞质结构域（残基715-762）和Tac胞外结构域截短的突变整合素嵌合体，并在COS7细胞中表达。（B） 整合素尾部突变体结构的表达导致细胞死亡。表达整合素结构的COS7细胞通过流式细胞术基于PI排除法评估生存能力。在每个实验中，每个结构体诱导死亡的相对能力被归一化为全长尾巴诱导的死亡（在这些研究中，表达细胞的范围为20%到40%）。（C） 执行子caspase活性由整合素截断突变体诱导。对于每个突变体，评估相对caspase激活（通过p85/p115比率评估），并将其归一化为完整Tac-β3诱导的caspase活化。结果显示为三个实验的归一化PARP比率的平均值±SD。（D） 整合素β3尾部NPXY基序的突变阻止αvβ3定向细胞迁移，但不抑制IMD。重组T24-EL细胞以表达野生型β3（T24-ELβ3）或NPXY基序中的点突变（T24-ELN744A；以粗体显示，A） 以类似水平评估它们在卵黄凝集素上的迁移（左）或在胶原ECM内的存活（右）。在显微镜下测量移行情况，绘制平均伤口闭合图，24小时后，用玻璃体凝集素涂层板上六个部位的平均±SE。通过直接细胞计数在显微镜下评估胶原蛋白存活率，以评估PI的排除情况（每个凝胶五个区域，三个凝胶）。显示了三个实验的平均值±SE。（E） 膜锚定形式的整合素细胞溶质域诱导细胞凋亡。用三种不同的β3胞质结构域转染COS7细胞；Tac-β3，以及第二个膜锚定的GFP-β3和一个非锚定的His-β3变异的β3细胞质结构域。对这些细胞的洗涤剂裂解物进行免疫印迹，以评估PARP裂解（顶部）并确认单个结构的表达（GFP，顶部；Tac/His，底部）。显示了两个类似实验中的一个。（F） 通过对表达GFP-β3或GFP-TM的细胞（对照组，带有信号序列的GFP和来自CD25的跨膜结构域）的数字图像进行分析来评估细胞扩散，如上所述(B） 转染后12、24和48小时。（G） β3结构物的连接抑制IMD。表达次最高水平整合素尾部的COS7细胞被允许附着在涂有抗Tac单克隆抗体（连接酶+）的底物上，或保持为正常的粘附组织培养物（连接蛋白-）。对粘附细胞进行裂解并评估死亡诱导结构的相对表达，即存在的整合素，并通过免疫印迹分析确定执行者caspase激活（通过定量p85/p115比率）。条形图表示三个实验的平均值±SE。
整合素尾部的许多区域与整合素诱导信号传导有关。特别是，NPXY位点，β3 744–747，已被确定为与整合素β3下游信号传递有关的关键基序(Filardo等人，1995年;刘等人，2000). 一致的是，在T24E-L细胞（T24E-L744）中表达的突变β3整合素在该区域（N744A）发生功能缺失突变，导致αvβ3介导的迁移完全丧失(D、 左）。然而，这种突变仍然可以诱导三维胶原基质中细胞的IMD(D、 右侧）。总之，结果表明，IMD和“经典”整合素信号需要不同的机制。β3尾部的膜定位似乎是启动IMD所必需的，因为没有跨膜结构域的整合素尾部（His-β3）的表达不能导致死亡(E） 而第二个膜锚定整合素结构（绿色荧光蛋白[GFP]-β3）的表达导致PARP断裂(E） 以及细胞凋亡。这一发现进一步证明了整合素表达不会以简单的“显性负性”方式导致死亡。
GFP-β3的表达也允许对整合素转染细胞进行监测，以评估细胞扩散是否受到影响。与之前的内皮细胞扩散研究一致(B） 在细胞凋亡明显之前，GFP-β3和对照GFP-表达细胞之间的细胞扩散没有差异(F） ●●●●。因此，细胞凋亡的开始可以启动细胞收缩并最终脱落(Harrington等人，2001年).
整合素介导的底物附着，通过粘附ECM蛋白实现(Ilic等人，1998年;Scatena等人，1998年)或通过整合素与底物固定化抗体结合(Stromblad等人，1996年)，抑制凋亡。相反，被对抗(Brassard等人，1999年)和/或非编码整合素(Stromblad等人，1996年; 以及这份手稿）促进其他粘附细胞的凋亡。为了评估当底物固定化时，将表达Tac-β3的COS7细胞重新放置在涂有抗Tac单克隆抗体的表面上，整合素嵌合体是否会促进死亡。这种附着和细胞扩散丰富了整合素嵌合体表达细胞的数量(G、 然而，与粘附的对照组相比，这些细胞的凋亡显著减少（PARP裂解减少60%(G、 底部）。在其他实验中，我们还测试了用可溶性抗Tac或抗Tac微球处理的细胞是否可以预防IMD，但两者都不影响这一事件（未公布的数据）。我们的结果表明，只有亚表位整合素“聚集”才能抑制β3尾部的致死活性。
IMD需要启动子半胱天冬酶
为了解决IMD的分子机制，在接受IMD的COS7细胞中表达了caspase激活的检查点特异性抑制剂。显性阴性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9或bcl的表达xl公司抑制应激介导的caspase级联(Finucane等人，1999年;Soengas等人，1999年;《狼与绿》，1999年)，不能阻止IMD，但可以阻止应激诱导的这些细胞凋亡(A） ●●●●。相反，crmA是一种抑制死亡受体激活半胱天冬酶激活的蛇蛋白(Zhou等人，1997年)，保护细胞免受IMD影响(). 令人惊讶的是，死亡受体适配器的一种负作用变体，FADD（Fas-associating protein with death domain），抑制由死亡受体介导的Fas-initiated凋亡(Chinnaiyan等人，1996年)，不具有保护性()尽管它有效地阻止了Fas介导的这些细胞的死亡(A） ●●●●。用启动子和执行子半胱天冬酶的肽抑制剂治疗整合素尾部表达细胞也可以防止细胞凋亡(C）(Thornberry等人，1997年)但不受应激半胱天冬酶选择性抑制剂（zLEHDfmk）的影响。
IMD取决于引发剂半胱天冬酶活性。（A） 执行子caspase活性被crmA阻断，但不被应激抑制剂或Fas介导的凋亡所阻断。crmA、DN-FADD、Bcl的共表达xl（xl）用促凋亡Tac-β3构建物（2μg）或催化失活的caspase-9、DN Casp9（4μg）来确定这些检查点特异性凋亡抑制剂是否可以抑制IMD。36小时后，使用执行者半胱天冬酶活性的激活（PARP裂解免疫印迹分析）作为指标对细胞进行评估。数据表示为在（Tac-β3+抑制剂）转染细胞中发现的PARP裂解与在（Tacβ3+对照载体）转染的细胞中观察到的PARP分解的比率，并表示三到四个独立实验的标准化结果。为了证实IMD中无活性的构建物具有功能，还通过Fas过度表达（2μg；阴影条）或Bad表达（1μg；灰色条）诱导凋亡。（B） 细胞活性由crmA维持。允许细胞表达构建物（如上文A所示），但在这种情况下，细胞凋亡通过FACS定量®转染36小时后收集的细胞用Alexa染料偶联抗CD25（7G7B6-Alexa488）标记，以标记Tac表达细胞。通过摄取PI（500 ng/ml）鉴定死细胞。结果表示为各组死亡的Tac-表达细胞的百分比，并表示两个实验的平均值±SE。（C） 抑制应激诱导凋亡的肽在IMD中不活跃。转染后12 h，通过表达Tac-β3诱导COS7细胞死亡，用40μM caspase抑制肽（zIETDfmk、zDEVDfmk或zLEHDfmk）作为单剂量处理，24 h后监测执行者caspase激活，即PARP裂解。数据是相对于单独使用稀释液（DMSO）处理的细胞表示的，代表两个实验的平均值±SD。（D） 内源性整合素诱导的IMD被crmA阻断。如上所述，COS7细胞共表达Ds-RED荧光蛋白（一种转染标记物）和检查点特异性凋亡抑制剂，通过形态学评分在完整生长介质中的胶原蛋白凝胶上培养48小时后评估其存活率(). 显示的数据是平均生存率±SE。显示了两个代表性实验。
为了证实整合素嵌合体启动的凋亡途径与内源性整合素诱导的凋亡途径相同，检测表达这些检查点特异性抑制剂的COS7细胞在胶原凝胶上的存活率。与我们之前的发现类似()，crmA表达抑制IMD，而DN–FADD、DN–caspase-9和bclxl（xl）无法阻止这种形式的凋亡(D） ●●●●。总之，这些发现表明，IMD的启动并不需要应激caspase级联的组成部分，但确实依赖于启动caspase的激活，其方式独立于死亡受体。
未激活的整合素激活caspase-8样活性
为了探讨非门控整合素激活caspase并诱导IMD的机制，我们接下来研究了IMD期间激活caspases的亚细胞定位。通过FAM-VAD标记显示整合素激活的半胱天冬酶活性fmk公司，其共价和荧光标记活化的胱天蛋白酶。接受IMD的细胞的视觉评估显示，caspase相关荧光呈点状分布，与细胞表面的非门控β3整合素尾部共定位(A） ●●●●。相反，不诱导IMD的Tac-α5广泛出现在细胞表面，并且与caspase活性没有共定位(A） ●●●●。值得注意的是，在附着于底物固定化Tac抗体的Tac-β3表达细胞中也发现caspase活性降低或缺失(A、 左）。在这些细胞中，通过共聚焦z截面分析发现Tac-β3的表达重新分布，并且主要分布在细胞-底物界面。收集的一系列含整合素的z切片由盲眼观察者进行数字图像分析，以评估整合素和活性半胱天冬酶之间可能的共定位(B） ●●●●。只有在诱导IMD的条件下（非门控Tac-β3），caspase和整合素之间才能观察到显著的共定位（共定位系数=0.49±0.07；P（P）< 0.01).
半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8被招募到膜上，并在IMD期间被激活。（A） 整合素尾部在IMD期间与caspase活性共定位。使用1024生物共振共焦显微镜通过免疫荧光评估死亡诱导整合素尾部和活性半胱天冬酶的细胞位置。通过整合素胞质域表达诱导细胞发生凋亡，或通过结扎（如G） ●●●●。在PBS/4%多聚甲醛固定前，细胞在无血清培养基中用FAM-VAD标记60分钟，以标记活性半胱天冬酶（荧光素，绿色通道）。然后检测细胞的Tac表达（单克隆抗体7G7B6，红色通道）。使用488 nm（中排）和566 nm（顶排）激光线连续采集每张图像的信号作为独立扫描。z段内的彩色化显示为黄色/橙色信号（底行）。（B） 盲眼观察者获得了表达A中所述Tac–整合素嵌合体的COS7细胞的共聚焦图像。测定了含有整合素的z截面内488 nm和566 nm信号之间的共定位系数（Bio-Rad Lasershar软件）。绘制每组10个随机场的平均值±SE。（C） 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8和-3在IMD期间被标记。通过表达整合素尾部诱导COS7细胞死亡，并与生物素VAD孵育以标记活性半胱天冬酶。活性半胱天冬酶用亲和素-脑糖苷酶分离，并在8–16%非还原性梯度凝胶上通过SDS-PAGE进行解析。用多克隆兔抗caspase-3（第2道）或-6（第4道）抗血清（分别为对照组和未检测到的抗血清）或抗caspase-8（第3道）的单克隆抗血清进行免疫印迹。（D） 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-8样活性在IMD期间升高。评估来自表达具有整合素α5细胞质结构域（灰色圆圈）、整合素β3细胞质结构域（开放圆圈）或模拟转染子（开放正方形）的Tac构建体的COS7细胞的裂解物切割胱天蛋白酶-8底物IETD pNA的相对能力。表达Tac-β3的细胞中诱导的IETDase活性被嵌合体的底物连接抑制（如G） ，如图所示（黑色圆圈）。（E） 在接受IMD的细胞中，caspase-8的亚细胞分布和主要形式发生变化。表达GFP-β3（诱导IMD）或GFP-Δ717在转染单个构建物（4μg）36 h后进行（非活性截短）。通过免疫印迹分析细胞溶质（Csol）、膜（Mem）和细胞骨架/核（Cskn）组分来评估caspase-8的相对分布和形式。指示被检测物种的相对分子质量（kD）。棒，10μm。
为了确定在这一过程中激活的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶，接受IMD的COS7细胞被生物素化半胱氨酸蛋白酶抑制剂（生物素-VADfmk）标记，裂解并分析是否存在生物素化产物。生物素-VAD标记揭示了几种可识别的caspase形式，包括酶原和活化形式的caspase-3和caspase-8(C） ●●●●。对接受IMD的细胞中存在的caspase活性的表征证实了一种caspase-8样（“IETDase”）活性，该活性被整合素嵌合体的底物连接所抑制(D） ●●●●。表达对照α5整合素嵌合体的细胞中Caspase活性没有升高(D） ●●●●。然而，IETDase活性并不是caspase-8的绝对特异性，可能由caspase-3介导。因此，后续的细胞分离研究(Chen等人，2000年)以证实caspase-8在这些细胞中被加工成活性形式。有趣的是，在表达β3整合素尾部的细胞中，caspase-8的加工形式在细胞膜和细胞骨架/核部分高度富集，但在表达不能诱导凋亡的截断突变GFP-β3的细胞中没有富集Δ717(E） ●●●●。
整合素β亚单位尾部对caspase-8的招募
死亡受体（如Fas）的外部聚集导致形成死亡诱导信号复合物（DISC），该复合物招募并激活caspase-8(Scaffidi等人，1999年). 为了确定整合素是否以类似死亡受体的方式诱导凋亡，将COS7细胞悬浮并用抗αvβ3整合素拮抗剂抗体处理。对细胞进行裂解，然后从所得裂解产物中免疫沉淀整合素复合物，并对DISC成分进行分析。虽然在整合素免疫沉淀物中观察到caspase-8的酶原和活性形式(A） ，未检测到FADD（未发布数据）。对照跨膜蛋白LDL-like receptor protein（LRP）在COS7细胞上的表达水平类似于整合素αvβ3，其聚集没有招募任何形式的caspase-8(A） ●●●●。
半胱氨酸蛋白酶-8在IMD期间与整合素相关。（A） Caspase-8与天然整合素αvβ3相关。整合素αvβ3和LRP复合物在COS7细胞上以相似的水平表达（未发表的数据），并进行聚集和免疫沉淀，然后进行caspase-8的免疫印迹分析，以确定caspase-9是否被征募到整合素DISC样复合物中(Scaffidi等人，1999年). （B） 整合素胞质域足以招募半胱氨酸蛋白酶-8。表达GFP-β3（促凋亡）或GFP-Δ717用GFP-Sepharose进行免疫沉淀，然后进行免疫印迹分析，以确定是否存在相关的caspase-8（顶部）或GFP嵌合体（底部）。（C） 整合素的连接破坏了半胱天冬酶的结合。表达整合素的COS7细胞（Tac-β1，未连接的Tac-β3，Tac-α5）和表达Tac-β3的细胞复制到抗Tac底物上（连接的Tac-β3）（如F） 裂解并用抗-Tac单克隆抗体进行免疫沉淀。沉淀物通过SDS-PAGE溶解，并通过免疫印迹分析相关caspase-8（顶部）或Tac（底部）的存在。（D） 在三维ECM中，αvβ3整合素配体拯救细胞凋亡并阻断caspase-8向整合素的募集。HUVEC在三维纤维蛋白或胶原凝胶中培养，或悬浮（凋亡阳性对照）16 h。然后从凝胶中回收内皮细胞，进行裂解，并使用LM609（抗αvβ3）进行免疫沉淀。如上所述，通过免疫印迹法解析沉淀物并分析是否存在caspase-8。
由于整合素的细胞质域足以诱导细胞凋亡()以及caspase-8在细胞膜上的募集和激活()接下来，我们确定β3整合素的跨膜结构域和胞质尾部是否足以介导与caspase-8的关联。COS7细胞表达的GFP-β3免疫沉淀显示与caspase-8相关(B） 在表达非活性GFP-β3的细胞的免疫沉淀物中未观察到Δ717突变体。此外，整合素尾部与caspase-8的关联在功能上很重要，因为未观察到与非凋亡整合素α5的关联，并且阻断凋亡的整合素连接事件也破坏了caspase-8-与整合素β3的关联(C） ●●●●。最后，免疫印迹分析检测到的整合素和含有caspase-8的复合物不包括caspases-1、-3、-6、-7和-10（未发表的数据）。
为了确定内源性整合素是否通过招募caspase-8诱导IMD，从胶原凝胶中经历凋亡的内皮细胞中分离出天然αvβ3复合物，并评估是否存在caspase-8。胶原或悬浮培养的内皮细胞（阳性凋亡控制）富含caspase-8(D） 而从纤维蛋白凝胶中培养的内皮细胞中分离出的复合物显示caspase-8和caspase-6均显著降低(D） 和凋亡(A） ●●●●。因此，在不适当的ECM中表达高水平内源性αvβ3的细胞可被死亡受体非依赖性，也可能是FADD诱导的依赖性、caspase-8的招募和激活诱导死亡。相反，如果存在与整合素相关的ECM，则可以阻止此过程。
讨论
已知整合素可促进培养中各种类型细胞的存活，并已证明其足以介导细胞生长的“锚定依赖”成分(施瓦茨，1997年). 最近，整合素介导的黏附也被证明可以促进细胞存活，以应对与应激相关的凋亡触发因素，如饥饿、生长因子撤退和化学介质(Ilic等人，1998年;Moro等人，1998年;Bonfoco等人，2000年). 在这些情况下，整合素信号通过黏着斑激酶传递到细胞核，使细胞在可能导致死亡的条件下持续存活，即存活信号(Ilic等人，1998年). 相反，这里提供的数据表明，整合素本身在没有门控的情况下，可以在没有任何其他死亡诱导刺激的情况下触发粘附细胞的凋亡。这种形式的凋亡，被称为IMD，在生物学和生化上与失巢凋亡不同，失巢凋亡被定义为细胞从底物上脱落导致的死亡(Frisch和Francis，1994年).
IMD公司
IMD依赖于整合素β亚单位以FADD诱导依赖的方式向细胞表面募集caspase-8的能力。这些发现可能解释了我们之前在体内的观察结果，即在用αvβ3整合素拮抗剂治疗的组织中，由于血管生成内皮细胞的凋亡诱导，血管生成受到抑制(Brooks等人，1994年b;Stromblad等人，1996年;Storgard等人，1999年). 在最近的研究中，我们观察到胱天蛋白酶-8的抑制剂，而不是胱天蛋白酶-9的抑制剂，恢复了αvβ3拮抗剂治疗的血管生成组织中的新生血管形成（未发表的数据）。因此，与不适当的ECM相互作用的细胞，或暴露于整合素拮抗剂的细胞，可能会屈服于IMD。有趣的是，虽然β1和β3整合素可以促进这一过程，但β5显然不能(D） ●●●●。因此，不同的整合素可能具有不同的诱导凋亡的能力，这是因为整合素异二聚体的其他部位存在调节区域。
在多个细胞系中观察到IMD，包括COS7、CS1、HEK、HTB和HUVEC。然而，值得注意的是，一些被检测的细胞，包括CHO-K1和HeLa，对IMD具有耐药性（未发表的观察结果）。体内或体外可能会出现对IMD的耐药性，原因如下。显然，细胞类型特异性或克隆性变异导致培养细胞具有不同的分泌或重塑其直接ECM的能力。此外，并非所有细胞都表达适当的caspase，如caspase-8，或可能表达抑制剂，如c-flip(Aoudjit和Vuori，2001年). 在这些情况下，整合素拮抗可能通过其他途径诱导细胞凋亡。例如，整合素拮抗也导致肿瘤抑制因子p53的激活(Stromblad等人，1996年). 因为p53与caspase-8复合(Ding等人，2000年)，它可能在IMD中发挥直接作用。然而，p53的转录激活也通过caspase-9的激活引起应激介导的死亡(Soengas等人，1999年). 因此，表达少量或不表达caspase-8的神经元最终会通过应激-caspase-9途径对整合素拮抗反应进行凋亡(Bonfoco等人，2000年).
此外，还发现了多种其他在诱导凋亡或抵抗凋亡中起关键调节作用的蛋白质。例如，不依赖锚定的肿瘤细胞可能对IMD产生耐药性。然而，CS1β3细胞上整合素αvβ3的表达能够在其他非锚定细胞中诱导IMD(D） ●●●●。这些发现表明，如其他人所建议的那样，特异性整合素拮抗剂可能作为抗肿瘤药物有用(Ruoslahti，1997年;Curley等人，1999年).
caspase-8在IMD中的作用
我们的研究结果表明，半胱天冬酶在IMD诱导中发挥非门控整合素下游的作用。因此，通过肽或蛋白质（crmA）拮抗剂抑制胱天蛋白酶-8导致IMD降低，而未门控整合素的表达增加增加了胱天蛋白酶的激活和凋亡。有证据表明，caspase-8可以直接或间接与整合素β亚单位胞质结构域相互作用，这种相互作用有助于caspase的激活。未点燃的整合素倾向于以依赖于整合素表达水平的方式聚集在细胞表面，然而，这些整合素与黏着斑激酶无关或被细胞骨架束缚（未发表的数据）。这些未捆绑的整合素簇可能有助于招募足够数量的caspase-8酶原，以促进近距离诱导启动子caspase级联的激活（诱导近距离模型；Salvesen和Dixit，1999年)以死亡受体独立的方式。尽管整合素在这方面可能不如死亡受体有效，但值得注意的是，其他“聚集”caspase-8的方法可以激活它，包括突变，以增加多重聚合域(MacCorkle等人，1998年;Memon等人，1998年;Muzio等人，1998年;Fan等人，1999年)和过度表达策略(Stennicke和Salvesen，1999年). 支持这一观点的是，不提供定位信号的整合素胞质结构域构建物，例如His-β3，也不能诱导IMD，然而，增加了非门控整合素的数量(B和3B）或阻断多个整合素（αvβ3和β1整合素；F） 增加了IMD的发病率。因此，胶原蛋白凝胶中联合抗αvβ3/抗β1治疗可提高细胞凋亡率(F） 可能是由于非门控整合素的总量增加（在这种情况下，β3和β1都会增加）。
整合素或半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶缺乏小鼠经常表现出发育缺陷和/或致死性(Fassler等人，1996年;Zheng和Flavell，2000年). 尽管αvβ3在非门控或拮抗时促凋亡(Brooks等人，1994年b;Brassard等人，1999年;Storgard等人，1999年)尽管如此，它对人类的生存能力来说并不重要(Coller等人，1991年)或老鼠(海恩斯和霍迪瓦拉·迪尔克，1999年). 那么，为什么αvβ3应该继续在广泛观察到的物种的侵袭组织中表达？整合素αvβ3在侵袭过程中可能作为生物传感器发挥作用，在“生产性”相互作用期间，即在允许的ECM中，向细胞提供正反馈(Ilic等人，1998年)同时通过在进入不适当微环境的细胞中触发caspase募集/激活来诱导死亡。因此，阻断整合素αvβ3的表达只会消除几个可能的凋亡触发因素中的一个。这种选择性抑制或促进凋亡的能力将整合素与死亡受体区分开来，并强调凋亡途径，这表明整合素可能属于第三类新兴的凋亡触发因素，即依赖性受体(Bredesen等人，1998年).
目前尚不清楚辅助分子是否参与这种相互作用的调节。然而，并不是所有的细胞都受到IMD的影响，也不是所有的整合素都是促凋亡的。因此，扩展的研究可能会揭示控制这种级联反应诱导的细胞和整合素特异性因子。然而，这种由整合素库和局部ECM组成调节的新型凋亡触发因子提供了一种新的方法来解释与组织重塑和体内平衡相关的细胞死亡和存活。
材料和方法
细胞系和三维细胞培养
对T24-E癌细胞（以前命名为ECV-304）（目录号1998；美国类型培养物收集）进行连续分类，以分离稳定的β3整合素缺乏（T24-EL）人群。通过转染pcDNA-Neoβ3或pcDNA-Neoβ3（N744A），然后用FACS选择新霉素（500μg/ml），重建β3整合素的表达®像我们之前对CS1细胞系所做的那样，从人群中筛选出新粘蛋白耐药但不表达的细胞(Filardo等人，1995年). 整合素功能也通过跨阱迁移进行评估(Cho和Klemke，2000年)，伤口化验(Hauck等人，2001年)，或粘附分析(Filardo等人，1995年)，如上所述。T24E、T24EL、T24-ELβ3、COS7或HUVE细胞在三维胶原内的完整培养基中进行微培养（玻璃体原；凝聚技术）(Cho和Klemke，2000年)或凝血酶诱导纤维蛋白凝胶（美国诊断学会）（500个细胞/10μl），或用完全培养基洗涤/平衡30分钟后在这些固定化凝胶的表面。随后在完整培养基中培养细胞（M199，20%FBS，HUVEC内皮细胞生长补充剂，RPMI 1640，CS1系5%FCS，DME，所有其他细胞系5%FBS，均补充庆大霉素和谷氨酰胺，最小氨基酸和丙酮酸；Sigma-Aldrich）。使用三种方法来证实凝胶中的死亡是通过细胞凋亡发生的。使用核染料（PI）识别死亡或正在死亡的细胞，以观察细胞核塌陷。形态学评分（卫星/冷凝）分析(Cho和Klemke，2000年)使用Cell Tracker-Green标记细胞（分子探针）进行。在分析之前，用2μM Cell Tracker在无血清培养基中孵育10分钟，进行Cell Tracer标记。Annexin-V（CLONTECH Laboratories，Inc.）反应性被用作细胞凋亡的早期标志物，并在扩散消失之前识别出死亡细胞。这些方法产生了可比较的结果。在放大的凝胶（250000个细胞/5ml×10100mm平板）中进行PARP切割的生化分析；通过用PBS/0.25%细菌胶原酶（Sigma-Aldrich）短暂处理从胶原中提取细胞，或通过在37°C下短暂纤溶酶（Sigma-Aldrich）处理从纤维蛋白中提取细胞，然后在PBS和免疫沉淀研究中洗涤两次，如下所述。
构建物和基因传递
通过重组U293（E1互补）细胞中的pAdCI/pJM17质粒，生成了缺失的腺病毒反义结构体，该结构体包含CMV-驱动的ORF，与前508 bp的β3互补或无义（空读通）结构体。HUVEC感染的多重感染率为～100 pfu/cell，通过感染编码Ad-βgal报告基因的腺病毒评估，感染率为100%。如最初报道的那样，通过将整合素细胞质结构域连接到Tac/CD25的细胞外和跨膜结构域，构建了pCI-NeoTac-β3、pCI-NoTac-(LaFlamme等人，1992年). 如前所述，截短嵌合体是通过在整合素编码序列中引入下部终止密码子而产生的(Filardo等人，1995年). His-β3结构体是通过在pcDNA3.1/V5/His A载体（Invitrogen）中His标签后的β3细胞质结构域的框架内表达构建的。GFP-β3嵌合体的构建基本上与β1的描述一致(Smilenov等人，1999年)但包括在pEGFP-C3载体（CLONTECH Laboratories，Inc.）中表达的整合素β3而不是β1的信号序列和跨膜/细胞质结构域。bclxl（xl）pCMV5中的、bad和crmA结构是S.Huang（加利福尼亚州拉霍亚斯克里普斯研究所）的礼物，缺少DED域的独立DN-FADD结构是从H.Duan（密歇根大学，密歇根州安娜堡）和E.Li（加州拉霍亚斯科里普斯研究所）获得的。DN–caspase-9和Fas由G.Salvesen（加州拉霍亚伯纳姆研究所）提供。为了通过嵌合体诱导死亡，根据制造商的说明（Invitrogen），通过脂质体或脂质体+转染亚融合（～30%融合）细胞培养物，并在所述时间点收获。对于PARP切割研究，细胞在完整RIPA平板上进行裂解。对于PI研究，对细胞进行短暂的胰蛋白酶化处理并收集。用Alexa-488结合的抗CD25（7G7B6）标记细胞，并添加PI以评估生存能力的丧失。为了避免在共表达实验中误解DNA毒性，如共转染/拯救研究所述，仅2μg pCI-NeoTac-β3与4μg特异性凋亡抑制剂共转染。FACS证实了这些结构的表达®和/或免疫印迹，如图例所述。
凋亡指标的评估
对于FACS®细胞凋亡分析，在膜联蛋白V染色和FACScan评估之前，仅用PBS冲洗后仍粘附在组织培养塑料上的细胞被短暂胰蛋白酶化，在完全培养基中淬火，再在PBS中冲洗®流式细胞仪（Becton Dickinson）。转氨酶表达细胞（Alexa 594，FL3）经膜联蛋白染色（FITC，FL1）鉴定为凋亡细胞。在PARP切割研究中，细胞在RIPA中裂解(Filardo等人，1995年)，细胞碎片在16000处被造粒克通过免疫印迹（2μg/ml PARP；目录号66391A；PharMinen）、5μg/ml Tac mAb 7G7B6（美国型培养物收集）、GFP兔抗血清（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）以及物种特异性二级HRP结合抗血清（Jackson ImmunoResearch Laboratories）对裂解产物进行分析和Lumigen PS-3改良化学发光基底（Lumigen.）。在每个实验中对115和85 kD半胱天冬酶处理形式进行量化（IP Lab Spectrum Software）。数据以车道p85/p115的比率表示（结构表达细胞和非表达细胞，包括在内）。根据制造商的方案（Chemicon），还使用LEHD-pNA（未公布的数据）和IETD-pNA比色分析评估了从总细胞群中分离的半胱氨酸天冬氨酸酶活性。
细胞扩散
在扩散过程中使用普林斯顿仪器Micromax CCD相机（Roper Scientific，Inc.）连续拍摄细胞的数字图像。通过使用IP Lab Spectrum Software（Scanalytics）自动计算面积，对表达GFP或GFP-β3的细胞（COS7）或细胞跟踪器绿色标记细胞（HUVEC）进行分割，对细胞扩散进行量化。平均细胞扩散是根据每个时间点10个随机场上的细胞面积确定的。
与抗体涂层基底的附着力
允许在4°C下将抗Tac（PBS中5μg/ml，pH 8.1）涂在非问题培养皿或盖玻片上过夜。细胞粘附前用PBS清洗表面两次。转染40 ng Tac-β3 pCI-Neo/cm后12 h COS7细胞表达Tac2将其胰蛋白酶化、淬火，然后在无血清培养基中接种抗Tac涂层板。在37°C下放置1小时后，用无血清培养基清洗去除未附着的细胞，并添加完整的培养基。24小时后，对裂解并分析整合素表达和PARP裂解（如所述）的细胞进行比较，以控制仍粘附在其原始100 mm培养皿上的群体。
膜分离和免疫沉淀
如前所述进行细胞分馏(Chen等人，2000年). 将颗粒膜在莱姆利缓冲液中再溶解以进行凝胶分析，或在1×蛋白酶抑制剂混合物（1%Triton X-100，25mM Hepes，pH 7.4；Boehringer）中用抗GFP琼脂糖进行免疫沉淀（Santa Cruz Biotechnology Inc.）。或者，通过添加沉淀抗血清（多克隆抗β3、多克隆抗GFP或多克隆抗LRP）形成DISC样结构，然后在1%氚中的冰上溶解，免疫沉淀整合素-半胱氨酸蛋白酶复合物(Scaffidi等人，1999年). 用抗痉挛-8多克隆（Chemicon；StressGen Biotechnologies）或单克隆（Calbiochem；mAb3）抗体进行Caspase免疫印迹。这些抗体识别半胱天冬酶的酶原和活性形式。使用识别半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶酶原和活性形式的特异性兔多克隆抗血清（Chemicon；StressGen Biotechnologies），通过免疫印迹法排除其他半胱氨酸蛋白酶的潜在存在，以检测半胱氨酸水解酶-1、-3、-6、-7、-9和-10的存在。尽管caspase-3、-8和-9是COS7细胞中主要的caspase，但除caspase-1和-10外，其余均被检测到。
半胱氨酸天冬氨酸酶标记和多肽抑制
将甲酯衍生肽抑制剂zIETDfmk、zDEVDfmk和zLEHDfmk（Calbiochem）或zVADfmmk（Bachem）在DMSO（50 mM）中进行重组并适当稀释。使用40-80μM肽（或二甲基亚砜稀释剂），通过目测计分（未显示）和执行者半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶底物PARP的裂解，在亚融合的33-mm培养皿中评估凋亡，这些COS7细胞表达亚最大数量的死亡诱导结构（1-2μg Tac-β3/pCI-NEO）。根据制造商的规范对Tac表达细胞中的caspase进行荧光FAM-VAD（InterGen）标记，然后在37°C下固定（PBS/1%多聚甲醛）和封闭（PBS/3%BSA）1h，并用Alexa-594共轭（分子探针）mAb 7G7B6（0.5μg/ml）检测Tac 1h。细胞用PBS清洗三次，并用Bio-Read Laboratories 1024共焦显微镜检查。活性半胱天冬酶与生物素-VADfmk的生物素化是通过首先去除含血清的培养基，清洗细胞一次，然后在DME中以最终浓度10μM生物素-VAD培养最后一小时来完成的。用抗生物素辣根过氧化物酶结合单克隆抗体（Sigma-Aldrich）对生物素化复合物进行检测，并用CDP-star试剂（Applied Biosystems）进行开发。随后用caspase特异性抗血清（-3，-6，-7，-8，-9）对细胞膜进行重复培养。
