果蝇属非典型蛋白激酶C与Bazooka相关并控制上皮细胞和成神经细胞的极性

摘要

引言

极性是许多不同细胞类型的共同特征，是各种过程的先决条件，包括分子的矢量运输、定向细胞迁移和不对称细胞分裂。例如，上皮细胞具有顶端和基底外侧的质膜结构域，这些结构域通过其不同的脂质和蛋白质组成相互区别(罗德里格斯-博兰和纳尔逊1989;Drubin和Nelson，1996年)。神经元的轴突膜域和躯体软骨膜域之间也存在类似的差异(Foletti等人，1999年;温克勒和梅尔曼1999)。极性不仅限于质膜，还可以在下面的细胞皮层中观察到。具有明显皮层极性的细胞类型的例子是早期的卵裂球秀丽隐杆线虫胚胎(鲍尔曼和谢尔顿1999)和果蝇属成神经细胞(Lu等人，1998年).

导致细胞极性产生的机制才刚刚开始出现。膜蛋白和脂质在反式高尔基网络中分类，随后通过囊泡运输传递到质膜的不同区域(Ikonen和Simons 1998)。细胞皮层可能通过皮层蛋白与某些膜脂的相互作用获得极性；例如，通过将含有百合蛋白同源结构域的蛋白质与磷脂酰肌醇（3,4,5）三磷酸结合或与跨膜蛋白的细胞质尾部结合。反之亦然，许多跨膜蛋白的正确定位取决于与皮层蛋白的结合。到目前为止，尚不清楚是否可以在没有皮层极性的情况下建立膜极性，或者这两个过程是否严格依赖于彼此。

极化细胞中不同的膜域是如何相互分离的？在脊椎动物上皮中，紧密连接（TJ）被认为是顶端和基底外侧质膜域之间的边界(史蒂文森和科恩1998;Tsukita等人，1999年)。此外，TJ创造了一种细胞旁密封，防止大分子在细胞间的细胞外空间自由扩散。在超微结构水平上，TJ的特征是相邻细胞质膜的外叶融合。TJ的形成依赖于克劳丁家族的跨膜蛋白(Furuse等人，1998年;Tsukita and Furuse 1999年)。Claudins和闭塞素（TJ的另一种跨膜蛋白）与几种皮质蛋白（ZO-1、ZO-2、ZO-3和扣带蛋白）结合，与肌动蛋白细胞骨架形成联系(史蒂文森和科恩1998;Tsukita and Furuse 1999年;Tsukita等人，1999年).

与脊椎动物上皮细胞相比，神经元不具有TJ，但建立并维持单独的轴突和体细胞质膜域。这些膜域之间的边界位于最初的轴突段(温克勒和梅尔曼1999)。测量跨膜蛋白和GPI-连接蛋白在膜平面内移动所需的力表明，这两类蛋白在初始段的横向迁移率都大大降低(Winckler等人，1999年)。肌动蛋白解聚药物latrunculin B的治疗破坏了该区域的扩散屏障(Winckler等人，1999年)表明膜下细胞骨架在维持神经元细胞表面极性方面起着重要作用。

与神经元一样，节肢动物的大多数上皮组织缺乏TJ，尽管高度极化(Tepass和Hartenstein 1994;米勒2000)。有人提出，节肢动物的分隔连接（SJ）可能是TJ的功能等价物。至少在某些情况下，对于细胞旁间隙的密封来说，这可能是正确的(Skaer等人，1987年;Baumgartner等人，1996年)但SJ可能不负责在质膜中形成扩散屏障。在果蝇属，在原肠胚形成时（产卵后3h）可以观察到顶端和基底外侧膜域的分离(缪勒和维肖1996)而SJ形成较晚（产卵后11小时）(Tepass和Hartenstein 1994)。此外，粘连小带（ZA）的基底形成分隔连接，这是一个围绕上皮细胞顶端的带状粘连连接，而顶端和基底外侧质膜域之间的边界位于ZA的顶端(Tepass 1996年)。那么，在果蝇属上皮细胞？

缺乏基因合子表达的双突变体星尘(特别提款权)和火箭筒(巴兹)细胞化后未能建立质膜极性果蝇属胚胎(缪勒和维肖1996)。这种表型的特征是基底外侧标记神经战术素（Nrt）在整个细胞表面的表达和ZA成分犰狳（Arm）的定位错误。此外，在sdt、baz双突变体，胚层上皮的单层组织丢失，细胞获得不规则形状。这些形态学变化让人想起上皮-间充质转化过程中出现的变化。本质上，与sdt、baz在中观察到双突变体巴兹缺少母体和合子Bazooka（Baz）的突变体，而合子特别提款权和巴兹单个突变体在发育后期表现出较弱的表型(Tepass和Knust 1993;Grawe等人，1996年;缪勒和维肖1996;Kuchinke等人，1998年)。这些数据表明巴兹是建立质膜极性和上皮形态所必需的，而特别提款权可能与以下部分冗余巴兹.

巴兹还需要在发育中的中枢神经系统（CNS）中建立成神经细胞的顶-基底极性和不对称分裂。成神经细胞从神经外胚层上皮剥离，经历几轮不对称细胞分裂，在每一次分裂中产生一个神经节母细胞和另一个成神经细胞。分裂前，有丝分裂纺锤体旋转90°，细胞命运决定因子Prospero和Numb的定位局限于成神经细胞的基底皮层。这些事件是将Prospero和Numb正确分离到神经节母细胞中的先决条件。从分层到早期后期，Baz定位于成神经细胞的顶端皮层，在那里与Inscutable（Insc）形成复合物(Schober等人，1999年;Wodarz等人，1999年)是有丝分裂纺锤体旋转和Prospero和Numb正确定位所需的蛋白质(Kraut和Campos-Ortega，1996年;Kraut等人，1996年;Kaltschmidt等人，2000年; 已在中审阅2000年1月和1月)。在没有Baz的情况下，Insc的不对称皮层定位被废除，导致细胞命运决定因素的随机纺锤取向和定位错误(Schober等人，1999年;Wodarz等人，1999年)。这些数据得出结论，成神经细胞的顶-基底极性依赖于顶端Baz表达的维持，因此从神经外胚层上皮遗传而来。

巴兹编码一个具有三个PDZ结构域的蛋白质，该结构域在其整个长度上与Par-3具有显著的序列相似性(秀丽隐杆线虫)和ASIP（大鼠）(Etemad-Moghadam等人，1995年;Izumi等人，1998年;Kuchinke等人，1998年)。在早期C类.雅致胚胎中，Par-3不对称地定位于受精卵和进行不对称细胞分裂的卵裂球的前皮质(Etemad-Moghadam等人，1995年)。在这些细胞中，Par-3控制细胞命运决定因子的纺锤取向和不对称定位(Etemad-Moghadam等人，1995年; 已在中审阅1998年罗斯和坎普斯)。随后，Par-3也在胚胎肠道上皮的顶部皮层表达（O.Bossinger，个人交流）。Par-3与一种非典型蛋白激酶C（aPKC）亚型PKC-3结合(Tabuse等人，1998年;Wu等人，1998年)。这两种蛋白质在正确的皮层定位方面相互依赖。此外，通过RNA干扰去除PKC-3的胚胎表现出与第3段突变胚胎(Tabuse等人，1998年)。ASIP被分离为哺乳动物aPKC亚型PKCλ和PKCζ的结合伴侣(Izumi等人，1998年)。有趣的是，ASIP和PKCλ在脊椎动物上皮细胞的TJ共定位(Izumi等人，1998年)。这些观察结果表明，ASIP/Par-3与aPKC的关联在功能上是重要的，并且在进化上是保守的。

我们已经从果蝇属（DaPKC）与脊椎动物的PKCλ和PKCζ以及C类.雅致在酵母双杂交试验中，DaPKC和Baz共免疫沉淀并直接相互结合。在胚胎中，这两种蛋白都位于几乎所有上皮组织和成神经细胞的顶端皮层。DaPKC在上皮细胞和神经母细胞中的顶端定位在巴兹突变体，反之亦然，Baz在DaPKC公司突变体。我们发现DaPKC公司功能丧失突变体类似于巴兹突变体，与这两种蛋白质的密切功能相互依赖一致。总之，我们的数据为非典型蛋白激酶C亚型在建立和维持上皮和神经元极性中的重要作用提供了第一个体内证据。

材料和方法

酵母双杂交相互作用分析

全长DaPKC公司在pACT2（CLONTECH Laboratories，Inc.）的GAL4事务激活域框架中克隆。对于诱饵构建体的生成，图中所示的Baz区域图2b（如下）在pGBT9（CLONTECH Laboratories，Inc.）的GAL4 DNA结合域框架中克隆。根据制造商的说明进行了两次混合分析。如有要求，将提供有关生成双混合结构的详细信息。

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图2

DaPKC和Baz直接相互绑定。（a） 抗-Baz抗体（COOH末端，小鼠）用于免疫沉淀（IP）S2细胞过度表达Baz的提取物。使用抗Nrt抗体作为阴性对照。免疫沉淀物用抗aPKC抗体C20进行SDS-PAGE和Western分析。用于免疫沉淀（输入）的细胞裂解物的Western blot显示在右侧。抗体C20检测到的单条带迁移分子量为～75 kD。（b） DaPKC直接与Baz结合。顶部示意性地显示了Baz的结构和三个PDZ域的位置。诱饵构造中与GAL4 DNA结合域融合的Baz区域用Baz示意图下方的条表示。在右边的列中：（+）诱饵结构与全长DaPKC的相互作用，（-）缺乏相互作用。氨基酸残基的编号依据Kuchinke等人，1998年.

结果

DaPKC基因的分子特征

鉴定非典型蛋白激酶C亚型果蝇属，我们筛选了伯克利果蝇属基因组数据库(网址：http://www.ruitfly.org)带有小鼠PKCλ和C类.雅致PKC-3型(Tabuse等人，1998年)使用BLAST算法(Altschul等人，1997年)。一个EST克隆（HL05754）显示出与NH的显著序列相似性₂λ和PKC-3的末端。HL05754的进一步测序表明，它包含了DaPKC公司，除了在3′端缺失的几百个碱基对。用HL05754 cDNA片段进行BLAST搜索表明DaPKC公司该基因位于第2染色体右臂的基因组区域51D，该区域已由伯克利大学测序果蝇属基因组计划(Adams等人，2000年)。基于与鼠标和C类.雅致aPKC和序列分析工具预测外显子-内含子边界，我们确定了HL05754中缺失的另外三个假定的3′外显子。胚胎信使核糖核酸的3′RACE分析证实了预测转录物的存在DaPKC公司基因组序列的cDNA序列DaPKC公司基因座显示至少存在10个外显子(图1a） ●●●●。第一外显子和最后一外显子都是非编码的，最后一个外显子包含典型的多聚腺苷酸化信号（AATAAA）。cDNA的概念翻译产生606个氨基酸的蛋白质，预测分子量为69.5 kD。DaPKC与小鼠PKCλ（68%同一性）、大鼠PKCζ（63%同一性）和C类.雅致PKC-3（58%身份）(图1b） ●●●●。相比之下，DaPKC与来自果蝇属(Schaeffer等人，1989年)PKC 53E（29%身份）和PKC 98F（36%身份）。完整基因组序列的BLAST搜索果蝇属(Adams等人，2000年)透露DaPKC是果蝇属.

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图1

的结构DaPKC公司轨迹。（a） DaPKC公司该基因位于第二条染色体的右臂51D位。该基因包含10个外显子（框）。平移区域用黑色填充，未平移区域用灰色填充。ATG和TGA分别标记翻译起始密码子和终止密码子。在致命的P元素插入线中l（2）k06403PlacW元件（阴影框）被插入第三内含子，这导致功能丧失表型。（b） DaPKC与小鼠、大鼠和C类.雅致DaPKC氨基酸序列（aPKC-Dm）显示出与小鼠PKCλ（PKC∧Mm）的68%同源性，与大鼠PKCζ（PKC-ζRn）的63%同源性和与小鼠PKC-λMm的58%同源性C类.雅致PKC-3（PKC-3 Ce）。四种激酶中至少有两种具有相同的氨基酸残基，以反面字体显示。包含激酶结构域的区域下划线。这些序列数据可从GenBank/EMBL/DDBJ获得，注册号为{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“AF288482”，“term_id”：“9885775”，“term_text”：“AF288482”}}AF288482型.

为了在Western blots和整体免疫荧光染色中检测DaPKC，我们测试了针对与大鼠PKCζ（C20）的COOH末端20氨基酸对应的肽产生的抗体与DaPKC的交叉反应性。在COOH末端，DaPKC和大鼠PKCζ在氨基酸水平上表现出75%的一致性和95%的相似性(图1b） 。抗体C20可识别西斑中约75 kD的蛋白质果蝇属胚胎和施耐德S2细胞(图2a） 与预测的DaPKC分子量吻合良好。在胚胎的整体免疫荧光染色中，抗体C20识别一个表位，该表位与DaPKC公司mRNA（见下文）。在纯合的胚胎中，染色强度降低到背景水平，以消除缺陷DaPKC公司基因座（数据未显示）和胚胎中致命P元件插入的纯合子l（2）k06403，位于DaPKC公司轨迹(图1a、 9 a）。从这些观察结果中，我们得出结论，抗体C20特异性地识别DaPKC蛋白。

DaPKC的表达模式

查看位置DaPKC公司在胚胎发育期间表达，我们通过RNA原位杂交分析了mRNA的分布。DaPKC公司在合子转录开始之前，新产卵中已经检测到mRNA(图3a） 因此必须在卵子发生过程中沉积在卵子中。在细胞胚层阶段，DaPKC公司mRNA存在于除极性细胞外的所有细胞中(图3b） ●●●●。原肠胚形成期间DaPKC公司在经历形态发生运动的组织中可检测到；例如，内陷中胚层、直肠和头沟(图3c） ●●●●。在扩展生殖带阶段的胚胎中DaPKC公司在成神经细胞中可检测到表达(图3d和图e)。在一些上皮组织中，特别是在前肠和后肠以及马尔皮基亚小管中，DaPKC公司mRNA在顶端细胞皮层高度富集(图3d和图f)，让人联想到巴兹和面包屑(crb（放射性核素）)mRNA(Tepass等人，1990年;Kuchinke等人，1998年).

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图3

mRNA表达模式DaPKC公司在野生型胚胎中。（a）大蛋白激酶C在合子转录开始之前，mRNA已经存在于新产卵和早期胚胎中，因此必须在卵子发生期间沉积在卵中。（b） 在细胞胚层阶段的胚胎中，DaPKC公司在除极性单元外的所有单元中表示（箭头）。（c） 原肠胚形成期间，DaPKC公司在外胚层和中胚层可检测到表达，在经历形态发生运动的细胞中表达增强；例如，在头沟（cf）、直肠（pr）、口（st）内陷和中胚层（ms）。（d） 在扩展生殖带阶段（阶段11），DaPKC公司在神经母细胞（nb，箭头）和除羊膜浆膜外的大多数外胚层上皮中强烈表达。请注意DaPKC公司mRNA在包括前肠（fg）和后肠（hg）原基在内的几种上皮组织的顶端细胞皮层中高度富集。（e） 11期胚胎的高倍放大显示DaPKC公司在成神经细胞中（箭头）。（f） 11期胚胎的高倍镜显示大蛋白激酶C前肠（左）和后肠（右）的mRNA表达。前肠和后肠的顶端细胞表面分别用箭头标记，基底细胞表面用箭头标记。除了f是背视图外，所有胚胎都是侧视图。背部朝上，位于左侧前方。a–d中的棒材=100μm；e和f中的bar=50μm。

用抗PKCζ抗体C20分析DaPKC蛋白的分布。在胚胎细胞化过程中，DaPKC定位于除极性细胞外的所有细胞的顶端细胞皮层，极性细胞不含检测到的DaPKC(图4、a和b）。在这个阶段，DaPKC在顶端-外侧细胞边界富集，在胚层的正面视图中形成蜂窝状图案(图4c） ●●●●。细胞化完成后，DaPKC高度集中在顶端外侧皮层(图4d和图e)与基底侧标记Nrt几乎没有重叠(图4d′和d〃）(de la Escalera等人，1990年;Hortsch等人，1990年)。在胚胎发育过程中，大多数来源于外胚层（如表皮、前肠和后肠）、马尔皮基亚小管和气管系统的上皮细胞都保持着顶端定位(图4，f–i）。唯一不表达DaPKC的外胚层上皮是羊膜。

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图4

野生型胚胎中DaPKC蛋白的表达模式和亚细胞定位。（a–c）在细胞化过程中（细胞周期14），DaPKC已经在新形成的胚层细胞（a）的顶端细胞皮层中富集，但在极细胞（pc）（b）中检测不到。DaPKC的皮层染色集中在细胞边界（c）。在此阶段，尚未完全确定质膜极性，如Nrt的非极性分布所示，Nrt是一种完整的膜蛋白，后来局限于基底外侧膜（a′）。（d–e）在原肠胚形成期的胚胎中，DaPKC定位局限于外侧皮质的近顶端区域，在较低水平上，局限于自由顶面下方的皮质（d）。这种定位模式与Nrt（d′）的定位模式是互补的，后者在细胞化完成后严格为基底外侧（d〃中的合并图像）。在正面视图中，DaPKC在每个胚层细胞的顶端周围形成一条连续的带（e）。（f和g）在扩展生殖带期（12期），除羊膜浆膜外，所有来自外胚层的上皮细胞的顶皮层中都可以检测到DaPKC。（h和i）生殖带收缩（14期）后，DaPKC的上皮表达保持不变，并且仍局限于顶端细胞皮层。sns、口胃神经系统；前景，前肠；hg，后肠；表皮；tp、气管窝；tr，气管；mt，马尔皮基亚小管。在所有面板中，DaPKC为红色，Nrt为绿色。a和a′、d、d′和d〃分别是同一胚胎的双标。f和g显示同一胚胎的不同焦平面。所有面板的前部位于左侧，背部朝上。a–e和i中的棒材=10μm。以f–h为单位的棒材=100μm。

DaPKC在神经母细胞（胚胎中枢神经系统的干细胞）中也有强表达。在成神经细胞脱层过程中，DaPKC定位于顶柄，顶柄楔入神经外胚层上皮相邻细胞之间(图5，a–c）。在前期和中期，DaPKC形成顶端皮层新月体(图5，d–i）。在后期，DaPKC染色强烈减弱，并在成神经细胞皮层的更广泛区域扩张，但明显被排除在萌芽的神经节母细胞之外(图5，j–l）。因此，从分层到前中期，DaPKC在成神经细胞中的定位与Baz和Insc非常相似(Kraut和Campos-Ortega，1996年;Kraut等人，1996年;Schober等人，1999年;Wodarz等人，1999年)。与DaPKC同时，用Nrt抗体显示上皮细胞和成神经细胞的细胞轮廓(图5b,图e,图h、和图k)。与上皮细胞类似，神经母细胞中的Nrt表达明显极化。在成神经细胞的基底膜和侧膜中可以检测到Nrt的强染色，而在DaPKC表达的顶端区域染色则明显减少(图5，箭头）。

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图5

神经母细胞中DaPKC的表达。扩展生殖带阶段（阶段10）的野生型胚胎被三重标记为DaPKC（红色）、Nrt（蓝色）和DNA（YoYo-1，绿色）。（a–c）在成神经细胞分层过程中，DaPKC表达于楔入相邻上皮细胞之间的顶端柄。在早期（d–f）和中期（g–i），DaPKC在成神经细胞的顶部皮层形成新月形。在后期（j–l），神经母细胞中的DaPKC染色强烈减少，但在顶端皮层的扩大区域仍然可以检测到。在出芽的神经节母细胞（GMC）中未检测到染色。注意，在质膜上DaPKC存在于皮层的区域（b和e中箭头之间的区域），Nrt染色减少。成神经细胞以星号标记，在j和k中发芽的GMC以圆圈标记。所有三种染色的合并图像显示在右栏中。所有面板上都有尖顶。棒材=10μm。

为了测试DaPKC和Baz是否共定位，我们对胚胎进行了双重标记免疫荧光染色(图6，a–c）。DaPKC公司(图6a、 红色）和Baz(图6b、 绿色）明显位于表皮(图6c、 黄色）和成神经细胞（数据未显示）。为了确定DaPKC和Baz相对于ZA的精确亚细胞定位，我们用抗ZA成分Arm的抗体进行了双标记免疫荧光染色(图6d、 红色）和Baz(图6e、 绿色）。合并的图像(图6f） 显示Baz位于Arm的顶部。DaPKC也是如此（未显示数据）。根据共焦显微镜的分辨率，我们不能排除Baz和DaPKC的定位与ZA中Arm部分重叠的可能性。

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图6

DaPKC的顶端定位依赖于Baz。（a–c）DaPKC和Baz在上皮细胞中共定位。对14期的野生型胚胎进行DaPKC（A，红色）和Baz（b，绿色）双重染色。这两种蛋白质都显示出广泛的共定位（c）。（d–f）Baz位于ZA标记臂的顶部。对14期的野生型胚胎进行Arm（d，红色）和Baz（e，绿色）双重染色。在合并的图像（f）中，几乎没有重叠，并且Baz以Arm的顶部表示。a–f中的表皮凹痕代表节段边界。（g–i）DaPKC定位丢失，Nrt定位不局限于基底外侧膜巴兹突变胚胎。在一个巴兹^西106原肠胚形成时胚胎为空，DaPKC未定位于皮层（g），Nrt出现在整个细胞表面（h），合并图像见i。还请注意，胚层上皮是多层的，细胞呈非常不规则的形状（相比之下图4d,图d和d〃）。（j–l）Baz的过度表达足以使DaPKC异位定位。当GAL4系统过度表达时，Baz不仅局限于上皮细胞和成神经细胞的顶部皮层，而且局限于皮层的异位部位（k，箭头）。同时，在皮层的异位部位（j，箭头）也可以检测到DaPKC，在那里它与Baz（l，箭头）共定位。所有面板上都有尖顶。棒材=10μm。

DaPKC的本地化依赖于Baz

DaPKC和Baz的结合和共定位表明这两种蛋白可能在功能上相互作用。在染色中巴兹从生殖系克隆获得的突变胚胎(巴兹使用抗aPKC抗体，我们无法检测到DaPKC在上皮细胞中的任何顶端定位(图6g和图i)和在神经母细胞中(图7g和图h)。相反，DaPKC在细胞质中呈弥散分布。巴兹空白胚胎也表现出膜极性的丧失，这一点因基底外侧跨膜蛋白Nrt的定位错误而变得明显。与野生型相比(图4d′），Nrt未从心尖质膜中排除(图6h） 。此外，表皮的单层结构消失，细胞相互堆积(图6h） ，如前所述sdt、baz双突变体(缪勒和维肖1996).

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图7

成神经细胞中DaPKC的顶端定位依赖于Baz和Insc。（a和b）杂合子insc公司^第49页/CyO胚胎在第10阶段，DaPKC（红色）在中期成神经细胞中形成顶端新月体，就像野生型一样。（c和d）英寸insc公司^第49页纯合突变胚胎，DaPKC在神经母细胞中的顶端定位丢失，而DaPKC在神经外胚层上皮中的顶端定位不受影响。（e和f）英寸巴兹^西106/+胚胎来源于纯合突变生殖系（具有父系野生型拷贝的生殖系克隆），在成神经细胞中可以检测到不对称的DaPKC新月体，尽管神经外胚层上皮几乎已经完全解体。（g和h）英寸巴兹^西106/从生殖系克隆获得的Y胚胎(巴兹在成神经细胞和上皮细胞中，DaPKC定位是完全弥漫的，既不是皮质的，也不是不对称的。还应注意d、f和h中中期板的异常取向。纯合子突变体insc公司^第49页胚胎通过CyO P[ftz:：lacZ]平衡器（b中的蓝色条纹）中的β-半乳糖苷酶表达缺失进行鉴定。半合子突变体巴兹^西106/Y胚胎通过缺乏性致死表达进行鉴定（未显示）。DNA用YoYo-1（绿色）染色。所有面板上都有尖顶。棒材=10μm。

为了测试Baz的错误定位是否足以导致DaPKC的错误定位，我们通过GAL4系统过度表达Baz(布兰德和佩里蒙1993;Wodarz等人，1999年)。在这些条件下，Baz不再局限于顶端细胞皮层，而是在上皮细胞和成神经细胞的更多侧面和基底位置发现(图6k） ●●●●。同时，DaPKC也定位错误(图6j） 与异位Baz共同定位于异位部位(图6l） 证实异位Baz可以将DaPKC募集到细胞皮层的异位部位。

以前已经证明，Baz是神经母细胞中Insc顶端定位所必需的，Insc是分层后神经母细胞Baz稳定所必需的(Schober等人，1999年;Wodarz等人，1999年;Yu等人，2000年)。我们测试了在成神经细胞中定位DaPKC是否也需要Baz和Insc。DaPKC在成神经细胞中的定位与野生型没有区别insc公司^第49页/CyO杂合胚胎(图7，a和b），但在insc公司^第49页纯合突变胚胎(图7c和图d)。在缺乏母体Baz但携带父系野生型等位基因的胚胎中巴兹（部分父亲拯救），在大多数成神经细胞中期检测到DaPKC的不对称皮质定位(图7e和图f)。然而，DaPKC新月体和中期板往往相对于胚胎表面方向错误(图7e和图f)，在缺乏Baz合子表达的低外显率胚胎中也观察到这种表型(Kuchinke等人，1998年)。在缺乏Baz母体和合子表达的胚胎中(巴兹null），DaPKC在成神经细胞和上皮组织中完全游离(图6g和7，g和h）。这些结果表明，在成神经细胞和上皮组织中，Baz是DaPKC根尖定位所必需的，而Insc仅在成神经组织中定位DaPKC。

DaPKC功能缺失突变体的遗传分析

研究大蛋白激酶C上皮极性丧失和成神经细胞不对称分裂，我们分析了DaPKC公司轨迹。使用的基因组序列进行BLAST搜索DaPKC公司基因显示P元素插入l（2）k06403位于DaPKC公司基因(图1a） ●●●●。该插入线是纯合致死性的，包含单个PlacW P元件，并且不补充Df（2R）Jp1，后者删除细胞学间隔51C3；52楼5-9。抗PKCζ抗体C20在胚胎纯合子突变体中的染色强度降低至背景水平l（2）k06403(图9a、 （见下文）。我们使用转座酶源P[Δ2-3]动员P元件(Robertson等人，1988年)并回收了一些缺乏w个 ⁺原始P元素插入的标记。在我们测试的七个回复系中，有三个是纯合的活的，表明P元件插入到DaPKC公司该基因座是致死原因和观察到的表型（见下文）。因此，我们得出结论：l（2）k06403是的等位基因DaPKC公司并将其重命名DaPKC公司^k06403.

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图9

DaPKC公司突变体在上皮极性和形态上存在缺陷。（a和b）纯合子DaPKC公司^k06403型突变胚胎不会被抗PKCζ抗体C20染色。用抗PKCζ抗体C20（A）和抗Nrt（b）双重标记原肠胚形成时的突变胚胎。注意a中没有特异染色，b（c–f）纯合子中胚层上皮有多层大蛋白激酶C^k06403型原肠胚形成时的突变胚胎显示Baz和Nrt的异常定位。Baz（c和e）不局限于胚层细胞的顶端皮层，而是呈弥漫的非极化皮层染色。除了最外层的一些细胞外，Nrt（d和f）定位在整个质膜上，并不局限于基底外侧膜，如野生型。注意上皮的多层结构和极不规则的细胞形状。e和f是d中框状区域的高倍视图。由于细胞死亡而缺乏细胞的区域用c和d中的箭头标记。（g和h）来自杂合子的胚胎大蛋白激酶C^k06403型/携带合子野生型等位基因的CyO母亲DaPKC公司经常出现典型的头部缺陷。在前端（箭头之间的区域），上皮是多层的，显示非极化Baz染色（g）和整个细胞表面Nrt的表达[h，Nrt（绿色）和Baz（红色）的合并通道]。（i和j）半合子DaPKC公司^k06403型来自C（2）的胚胎v（v）母亲表现出腹侧神经外胚层Baz（i）和Arm（j）染色缺失。g和h中的胚胎处于第8阶段，i和j中的胚胎位于第10阶段。a–h是光学横截面，i和j是胚胎腹表面的视图。在所有面板中，前部位于左侧。a–d中的棒材=100μm。e–j中的棒材=20μm。

纯合子突变体DaPKC公司^k06403型胚胎不产生任何角质层(图8b） 。这种表型的原因是角质层分泌开始前的早期胚胎致死。转杂合子DaPKC公司^k06403型/Df（2R）Jp1胚胎表现出完全相同的角质层表型(图8c） ，表明DaPKC公司^k06403型是一个强的低形态或空等位基因。分析大蛋白激酶C功能丧失表型因以下事实而变得复杂DaPKC公司突变体显示母体单倍体不足，外显率不完全。这一结论的证据来自以下观察结果：我们注意到，从DaPKC公司^k06403型/显著超过50%的胚胎（包括CyO/CyO纯合子）未能孵化（63.2%，n个=644），这意味着即使是带有合子野生型等位基因的胚胎DaPKC公司经常表现出发育缺陷(图8e和9，g和h）。这一发现在杂合子杂交中得到了证实DaPKC公司^k06403型/CyO雌性到野生型雄性，我们也观察到相当多的胚胎致死率（25%，n个= 244). 与野生型对照组相比，反交组的胚胎死亡率没有增加。因此，我们得出结论DaPKC公司^k06403型/CyO母亲是由卵子发生期间母亲DaPKC水平降低引起的。

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图8

表皮表型DaPKC公司和巴兹突变体非常相似。（a） 野生型角质层。（b） 纯合子突变体DaPKC公司^k06403型胚胎来源于DaPKC公司^k06403型/CyO母亲不会形成角质层，因为她们在角质层分泌开始之前死亡。（c） 在来自DaPKC公司^k06403型/跨异卵细胞的CyO母亲DaPKC公司^k06403型和Df（2R）Jp1，删除整个DaPKC公司编码区域。（d） 许多巴兹^西106空胚也不产生角质层，类似于缺乏角质层的胚胎DaPKC公司（e）杂合子胚胎DaPKC公司^k06403型/具有合子野生型等位基因的CyO母亲DaPKC公司模具经常带有典型的头部缺陷。（f和g）来源于C的胚胎（2）v（v）半合子的母亲DaPKC公司^k06403型形成具有严重头部缺陷和大腹面洞的角质层（f）或完全缺乏腹面角质层的角质膜（g）。（h） 合子的巴兹^西106突变体还形成具有大的腹孔和头部缺陷的角质层，使人想起f中所示的角质膜。所有面板中的前部都位于左侧。背侧在a–e和g中向上，而f和h是腹侧视图。棒材=100μm。

生产具有DaPKC野生型母体贡献但缺乏合子的胚胎大蛋白激酶C表达式，我们跨越C（2）v（v）女性(Merrill等人，1988年)至DaPKC公司^k06403型/CyO雄性并分析其后代的角质层表型（有关详细信息，请参阅材料和方法）。四分之一来自该杂交的胚胎完全缺乏DaPKC公司并产生具有特征性缺陷的角质层。在大多数情况下，头部结构缺失，腹部角质层出现大洞(图8f） 或完全缺失（g）。这些表型与巴兹突变体。巴兹来自生殖系克隆的空胚只产生很少或没有角质层(图8d） 和相似DaPKC公司^k06403型来自杂合母亲（b和c）的突变胚胎。巴兹仅缺乏合子表达的突变胚胎产生具有特征性头部缺陷和腹孔的角质层(图8h） 非常类似于DaPKC公司^k06403型来自C（2）的突变胚胎v（v）母亲（f和g）。

DaPKC突变体在上皮细胞和成神经细胞中显示极性丢失

为了研究DaPKC在上皮组织和极性控制中的作用，我们将其染色DaPKC公司^k06403型具有抗Baz、Nrt和Arm抗体的突变胚胎果蝇属β-catenin同源物。最纯合子DaPKC公司^k06403型杂合子母亲的胚胎在发育早期就停止发育，并在细胞化之前或期间死亡（数据未显示）。那些进一步发育的细胞在上皮组织和极性方面表现出明显的缺陷。这些胚胎的胚层上皮是多层的，细胞形状极不规则，上皮的顶基极性丢失(图9，a–f）。Baz并非局限于顶端皮层，而是在随机分散的聚集物中发现(图9c和图e)。基底外侧标记物Nrt定位于大多数细胞的全细胞表面(图9d和图f; 比较图4d′）。

很大一部分胚胎来源于DaPKC公司^k06403型/CyO杂合母亲至少拥有一个合子野生型等位基因DaPKC公司在头部区域显示出特征性缺陷(图9g和图h)。虽然Baz和Nrt的上皮结构和分布在这些胚胎的躯干区是正常的，但胚胎前端的上皮是多层的，显示出Baz的离域分布(图9g和图h)Nrt在整个细胞表面的表达（h）。因此，在这些胚胎的头部区域观察到的缺陷与在纯合胚胎的整个胚泡上皮中观察到的缺陷非常相似DaPKC公司^k06403型杂合母亲的胚胎(图9，a–f）。最有可能的是，这些缺陷反映了在合子转录开始之前对DaPKC的早期需求，并且是由母体DaPKC供应不足引起的。与这个解释一致，纯合子DaPKC公司^k06403型具有野生型母体DaPKC贡献的胚胎（见材料和方法）比来自杂合母体的纯合子突变胚胎发育得更远，并且在生殖带延伸之前未显示出明显缺陷。在这个阶段，没有顶端Baz的斑块(图9i） Arm（j）染色，尤其在腹神经外胚层和头部。这些区域的光学横截面显示出上皮组织和极性的缺陷，与图9，a–h（未显示数据）。

研究DaPKC公司我们对胚胎中枢神经系统成神经细胞不对称分裂功能丧失进行染色DaPKC公司^k06403型携带Baz和Insc抗体的母体剂量的DaPKC突变胚胎(图10)。在这些胚胎的大多数中期神经母细胞中，未检测到Baz(图10Insc染色呈弥漫性，而不是形成紧密的顶端新月体(图10c和图d)。此外，中期板的取向经常偏离平行于胚胎表面的正常取向(图10b和图d)反映了有丝分裂纺锤体的异常取向。

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图10

DaPKC是Baz和Insc定位以及成神经细胞中期板正确定位所必需的。半合子的DaPKC公司^k06403型来自C（2）的胚胎v（v）对母亲进行Baz和DNA（a和b）或Insc和DNA（c和d）染色。Baz染色强烈减少，并且不局限于成神经细胞中期的顶端皮层DaPKC公司^k06403型半合子胚胎（a和b），而Insc仍能在细胞质中检测到，但不能形成紧密的顶端新月体（c和d）。还请注意，中期板相对于胚胎表面的方向在大蛋白激酶C^k06403型突变体（b和d）。成神经细胞以星号标记。所有面板上都有尖顶。b和d是Baz和DNA通道（b）或Insc和DNA通道的合并图像（d）。棒材=10μm。

讨论

我们已经确定了编码唯一非典型PKC亚型的基因果蝇属并显示DaPKC直接与Baz结合，在上皮细胞和成神经细胞中与Baz共定位。DaPKC的顶端定位丢失于巴兹突变体，反之亦然，证明这两种蛋白质在正确定位方面相互依赖。在成神经细胞中，DaPKC的定位不仅依赖于Baz，还依赖于Insc。Baz水平在以下神经母细胞中强烈降低insc公司突变胚胎，很可能是因为稳定Baz需要Insc(Schober等人，1999年;Wodarz等人，1999年;Yu等人，2000年)。因此，Insc对DaPKC定位的影响可能是间接的，可以用Baz的丢失来解释insc公司突变神经母细胞。另一种蛋白质，Insc（Pins）的伴侣，最近被鉴定为Insc的结合伴侣(Schaefer等人，2000年;Yu等人，2000年)。引脚、Baz和Insc相互依赖，以实现正确定位和/或稳定性(Schaefer等人，2000年;Yu等人，2000年)这表明，这种复合物中任何已知成分的丢失都会损害成神经细胞顶端皮层中其他成分的稳定性和/或定位。

这些发现让人想起早期的情况C类.雅致胚胎中，PKC-3、Par-3和另一个PDZ结构域蛋白Par-6相互依赖，以在前细胞皮层中正确定位(Watts等人，1996年;Tabuse等人，1998年;1999年洪和坎普)。与这些结果一致，RNA干扰导致PKC-3缺失的胚胎的表型与第3段和第6段突变体(Etemad-Moghadam等人，1995年;Watts等人，1996年;Tabuse等人，1998年;1999年洪和坎普)。有趣的是果蝇属同系物第6部分确实存在(Tabuse等人，1998年)提出了Par-3/Baz、PKC-3/DaPKC和Par-6的相互作用在进化上保守的可能性。

PDZ结构域蛋白和蛋白激酶C之间紧密功能相互作用的另一个例子最近在果蝇属多PDZ结构域蛋白InaD与PKC的眼特异性、传统亚型结合，是其在光感受器中正确定位所必需的(Tsunoda等人，1997年;Xu等人，1998年)。InaD包含五个PDZ域，并为每个域确定了不同的绑定伙伴。有趣的是，所有与InaD结合的蛋白质都是果蝇属眼睛(Tsunoda等人，1997年;Xu等人，1998年)。因此，有人提出，InaD为组装信号复合体，即所谓的“转导子”提供了一个支架

就DaPKC和Baz而言，情况更为复杂。Baz作为支架的功能与信号蛋白DaPKC的定位是一致的。然而，在没有DaPKC的情况下，Baz本身并没有正确本地化。很容易想象像InaD或Baz这样的结构型多PDZ域蛋白如何定位蛋白激酶，但DaPKC如何负责Baz的定位和稳定？Baz具有一个在Baz、Par-3和ASIP之间保守的PKC共识磷酸化位点。DaPKC对该位点的磷酸化可能对调节Baz与其他蛋白质的结合或保护Baz免受蛋白水解降解很重要。DaPKC也可能同时与Baz和Baz定位所需的另一种蛋白质结合。有必要对Baz和DaPKC进行详细的结构-功能分析，以澄清这一问题。

分析DaPKC公司功能丧失表型显示大蛋白激酶C在胚胎发生的早期，即合子转录开始之前，已经需要。最纯合子DaPKC公司^k06403型母体剂量减少的DaPKC胚胎在细胞化完成之前死亡。这起早逝的原因是什么？aPKC与脊椎动物组织培养细胞中凋亡细胞死亡的控制有关。抑制aPKC诱导细胞凋亡(Diaz-Meco等人，1996年)。紫外线照射细胞也会引发凋亡，并迅速抑制aPKC激酶活性，这表明aPKC的抑制是凋亡信号级联中的早期事件(Berra等人，1997年)。根据这些数据，aPKCs与生长因子受体下游生存信号的转导有关。与传统和新型PKC亚型相比，aPKC可以被磷脂酰肌醇（3,4,5）三磷酸和神经酰胺激活，这两种第二信使是在对炎症细胞因子和生长因子的反应中产生的(Nakanishi等人，1993年;Lozano等人，1994年;Akimoto等人，1996年)。我们的观察结果是DaPKC公司突变胚胎显示细胞过早死亡，TUNEL标记显著增加（A.Wodarz，未发表的观察结果），这是细胞凋亡的标志，与DaPKC在传递生存信号中的功能一致。DaPKC在细胞死亡控制中的作用的详细分析果蝇属超出了本文的范围，将在未来的出版物中讨论。

功能丧失表型DaPKC公司上皮细胞中的突变与描述的表型非常相似巴兹空突变体和合子sdt、baz双突变体(缪勒和维肖1996)。这些突变体中最显著的异常是单层上皮组织丢失、细胞形状不规则和质膜极性丢失。上皮的多层化和异常的细胞形状很可能是由细胞粘附缺陷引起的。事实上，ZA是一个钙粘附素介导的细胞紧密接触的区域，其形成在DaPKC公司,巴兹、和特别提款权突变体(Grawe等人，1996年;缪勒和维肖1996)。另一个基因，crb（放射性核素）也是正确定位和维护ZA所必需的(Wodarz等人，1995年;Grawe等人，1996;Tepass 1996年; 已在中审阅米勒2000)。DaPKC、Baz和Crb都位于ZA的顶部(Tepass 1996年; 这项工作），那么他们如何控制ZA的形成？Crb，一种跨膜蛋白(Tepass等人，1990年)通过其细胞质尾部与皮质多PDZ域蛋白Discs Lost结合(Bhat等人，1999年;Klebes和Knust 2000)可能与其他蛋白质有关。这种复合物可能参与顶端细胞皮层中蛋白质支架的形成，阻止ZA成分在顶端进一步移动。Baz也具有类似的功能，因为它也是一种多PDZ域蛋白，能够同时与多个伙伴相互作用。

DaPKC如何适应这种模式？如上所述，DaPKC是Baz定位和稳定所必需的，但这可能不是其在ZA形成中的唯一功能。一些报告显示PKC参与粘附连接和TJ的组装(Lewis等人，1994年;Citi和Denisenko 1995;Stuart和Nigam 1995年;van Hengel等人，1997年)。这些研究大多使用培养的细胞系，并分析了PKC的不同抑制剂和激动剂对连接蛋白定位和磷酸化、细胞粘附和细胞形态的影响。尽管这些研究提供了令人信服的证据证明PKC参与连接形成，但在大多数情况下，负责观察到的表型的特定PKC亚型和这些PKC的靶点都没有明确确定。在一项有趣的研究中，aPKCs的抑制在鹌鹑神经管外植体中诱导上皮间质转化，而传统或新型PKCs抑制剂在该试验中几乎没有影响(Minichiello等人，1999年).

除了对上皮组织和细胞形状的影响外DaPKC公司,baz、sdt、，和crb（放射性核素）也影响质膜极性(Wodarz等人，1993年,Wodarz等人，1995年;缪勒和维肖1996;Klebes和Knust 2000)。正如引言中所讨论的，质膜极性的建立和维持需要通过膜平面上的扩散屏障分离顶端和基底外侧膜域。在脊椎动物的上皮细胞中，这种扩散屏障是由TJ造成的。在节肢动物的上皮中，超微结构分析没有发现TJ(Tepass和Hartenstein 1994)。然而，我们注意到，DaPKC和Baz、PKCλ、PKCζ和ASIP的脊椎动物同源物定位于上皮细胞的TJ(Izumi等人，1998年)。此外，DaPKC和Baz在ZA的顶部定位果蝇属上皮，对应于脊椎动物上皮中TJ的位置。因此，基于它们的定位和突变表型，我们认为DaPKC和Baz是进化上保守的蛋白质复合体的组成部分，可能与脊椎动物中的TJ具有类似的功能。

成神经细胞不具有精细的细胞连接，但可以清楚地显示皮层，至少在一定程度上可以显示质膜极性。DaPKC和Baz是将Insc锚定在顶端成神经细胞皮层所必需的(Schober等人，1999年;Wodarz等人，1999年; 可以想象，DaPKC和Baz也可能参与形成类似于我们提出的上皮模型的膜下蛋白支架。与这一观点一致的是，在神经母细胞质膜上DaPKC和Baz位于膜下的那些区域，Nrt染色被精确地减少。因此，DaPKC和Baz通常通过阻止基底外侧蛋白扩散到顶端结构域来负责膜结构域的分离。

从现有数据来看，无法确定DaPKC在成神经细胞中的主要功能是稳定Baz还是磷酸化参与成神经细胞不对称分裂的其他靶点。DaPKC磷酸化的一个候选蛋白是Miranda，它是一种具有六个共有PKC磷酸化位点的衔接蛋白，与Prospero和Insc结合(Ikeshima-Kataoka等人，1997年;Shen等人，1997年,Shen等人，1998年;Schuldt等人，1998年)。米兰达仅在间期晚期与Insc短暂共定位，然后在前期与普洛斯佩罗一起移动到成神经细胞的基底皮层(Shen等人，1998年)。DaPKC对Miranda的磷酸化调节Miranda与Insc的结合及其在细胞周期后期从顶端复合体中释放，这是一种有吸引力的可能性。

总之，我们已经证明DaPKC是上皮细胞和成神经细胞中Baz的重要结合伙伴。令人惊讶的是，Baz不仅作为支架将DaPKC锚定在顶端细胞皮层中，而且自身依赖于DaPKC以实现适当的定位和稳定性。这种相互依赖性表明Baz等结构蛋白和信号蛋白DaPKC之间存在密切的相互作用。信号转导成分和细胞皮层结构成分之间的联系对于快速重排细胞连接和细胞形状变化（如神经母细胞分层期间发生的变化）可能很重要。为了充分了解DaPKC在细胞不对称性产生中的作用，有必要确定这种重要蛋白激酶的生理激活物、抑制剂和下游靶点。

致谢

脚注

参考文献