Rho-GTP酶在细胞运动过程中控制极性、突起和粘附

细胞培养

初级REF细胞由Durward Lawson博士（英国伦敦大学学院）提供。细胞在Dulbecco改良Eagle培养基中生长，该培养基补充了10%胎牛血清、链霉素和青霉素，温度为37°C，含10%CO₂对第3代和第7代之间的次生细胞进行创伤诱导细胞迁移试验。

蛋白质、抗体和试剂

重组V14Rho（RhoA同种）、V12Rac（Rac1同种）、V2Cdc42（G25K同种）、C3转移酶、N17Rac、N17Cdc42和WASp（包含氨基酸201–321的Cdc42结合片段）表达为谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白大肠杆菌并在谷胱甘肽-淀粉珠上纯化，基本上如赛尔夫和霍尔（1995）通过凝血酶裂解从小球中释放蛋白质，并在微注射缓冲液（50 mM Tris，pH 7.5，50 mM NaCl，5 mM MgCl）中透析₂0.1 mM DTT），并按要求进行浓缩。对于GTP-结合蛋白，活性蛋白浓度通过使用[^三H] 的GDP[^三H] 如上所述的GTP(Self和Hall，1995年). N17Cdc42对[^三H] 国内生产总值(赛尔夫和霍尔，1995年)因此，使用蛋白质检测试剂盒（Bio-Rad Laboratories）估算N17Cdc42的蛋白质浓度。用该方法还测定了C3转移酶和WASp片段的蛋白浓度。Ras的纯化中和抗体Y13-259是Hugh Paterson博士（英国伦敦Chester Beatty实验室）赠送的礼物。

创伤、微量注射和抑制剂治疗

伤口分析用REF以12×10的高密度播种⁴细胞在13mm玻璃盖玻片上，1d后细胞形成融合单层时受伤。伤口是通过将一根微注射针（断到其轴上并火焰抛光）刮过/穿过细胞单层造成的。伤口宽度始终在100至130μm之间，伤口愈合时间为5至6小时。细胞在损伤前用抑制剂预处理20分钟，如果是Y-27632，则预处理1小时。由于大多数伤口边缘细胞在受伤后立即聚集起来，因此很难注射，因此伤口留有1小时，以便细胞重新呼吸和促进微量注射。将蛋白质与标记蛋白（FITC或德克萨斯红共轭赖氨酸右旋糖酐，浓度为2 mg/ml）一起注入细胞细胞质。按照文中所示的浓度微量注射重组蛋白。将中和抗Ras抗体Y13-259以8-9 mg/ml的浓度微量注射到PBSA中。将编码N17Rac1、N17Cdc42（G25K亚型）、WASp片段和V12HaRas的表达载体（pRK5-myc）以200μg/ml的浓度注射到细胞核中，并使用抗myc抗体（9E10）观察表达蛋白或者在Ras患者中使用大鼠单克隆抗体Y13-238。之前我们已经证明至少90%的DNA注射细胞表达pRK5结构(Lamarche等人，1996年)细胞注射后30min内可检测到myc标记蛋白。

免疫荧光染色方案

在每次实验中，在伤口形成后（用于抑制剂实验）、伤口形成后1小时（用于微注射实验）以及伤口边缘接触后立即修复对照伤口，并使用相位控制光学进行频繁观察。实验伤口在控制伤口愈合时修复。对于伤口闭合测量，如前所述，对细胞进行丝状肌动蛋白染色(Nobes and Hall，1995年). 简言之，将细胞固定在4%多聚甲醛/1%戊二醛/PBS中（以保留精细的肌动蛋白结构，如丝状伪足），在0.2%Triton X-100/PBS中透化，用PBS中的硼氢化钠（0.5mg/ml）封闭，并用PBS中的罗丹明缀合的鬼笔肽（0.1μg/ml）染色。用4%多聚甲醛/PBS固定用于免疫染色的细胞，使其透化，用硼氢化钠封闭，并与在PBS中稀释的初级抗体在室温下孵育1小时。如前所述，对细胞进行免疫染色以显示病毒素、磷酸酪氨酸和myc-tag(Nobes and Hall，1995年;Lamarche等人，1996年). 为了揭示c-fos，我们使用了稀释为1:100的兔多克隆fos抗体（癌基因科学公司），然后是FITC-结合的山羊抗兔抗体（1:200；Pierce and Warriner）和FITC-接合的驴抗羊抗体的第三层（1:200，Jackson ImmunoResearch Labs，Inc.）。使用活化的单克隆抗MAP激酶检测双磷酸化ERK-1和-2(西格玛化学公司。; M8159）和1:50稀释，然后是FITC-结合的山羊抗鼠抗体（1:200；Pierce和Warriner）和第三层FITC-接合的驴抗羊抗体。使用亲和纯化的兔抗人血小板非肌肌球蛋白II抗体（Biomedical Technologies，Inc.）稀释至1:100，对细胞进行肌球蛋白Ⅱ染色。为了检测表达的Ras蛋白，使用0.1%皂苷/80 mM钾管（pH 6.8）/1 mM MgCl渗透细胞₂/5 mM EGTA 2分钟，然后用4%多聚甲醛固定，并用大鼠单克隆抗体Y13-238（切斯特比蒂实验室Mike Olson的礼物）孵育，然后用Cy3-结合驴抗鼠抗体孵育（Jackson ImmunoResearch Labs，Inc.）。用与Ras表达载体共注入的生物素葡聚糖级联蓝色亲和素检测注入细胞。通过将盖玻片倒置到5μl移动安装剂上安装盖玻片第页-苯二胺（几格令/5ml）作为防臭剂。在一个蔡司公理照相显微镜蔡司10×和20×空气透镜，以及40×和63×1.4浸油透镜。荧光图像记录在柯达T-MAX 400 ASA薄膜。

伤口闭合测量

对对照伤口进行了半定量测量(t吨=0）和对照和抑制剂处理的伤口（在对照伤口闭合后）。在放大20倍的条件下，用罗丹明结合的卵磷脂对单个伤口的三个随机选择的区域（每个700μm长）进行染色。确定了平均伤口宽度（以微米为单位）（通过平均每30μm的宽度），并计算了平均伤口闭合百分比。

在微注射实验中，随机选择一个伤口区域，在伤口相对侧连续注射10-15个前沿细胞。由于不仅前排细胞参与伤口反应，我们还在伤口两侧的第2、3和4排注射细胞。对于微注射伤口，伤口宽度测量为微注射细胞之间的距离（伤口两侧），通过共射荧光葡聚糖或抗myc染色观察，因为一些未注射细胞通常在注入伤口的细胞之间爬行。在这种情况下，在约300–400μm的伤口长度上，每15μm进行一次测量。根据每次注射的平均值，计算伤口闭合百分比。

高尔基体定向测量

为了记录高尔基体在迁移的伤口边缘细胞中的位置，将较宽的伤口（～200μm宽）制作成单层REF，并在创伤后2、4和6小时固定细胞。如上所述，使用识别β-COP的大鼠单克隆抗体（23C）通过免疫标记定位高尔基体。免疫标记高尔基体在每个细胞中的位置记录如下Kupfer等人（1982年）伤口边缘细胞被分成三个以细胞核为中心的120°扇区，其中一个面向伤口边缘（见图。​图55A） ●●●●。高尔基体（即荧光图像的50%或更多）位于面向伤口的扇区内的细胞得分为阳性，每个时间点至少检查100个细胞。对于零时间点，给出了33.3%的细胞在前向扇区显示高尔基体的随机值。为了检测突变型GTP酶对高尔基体再定向的影响，在伤口形成1小时后，用编码myc标记的N17Rac、N17Cdc42、WASp和V12Cdc42的表达载体注射伤口。1小时后，当50%的细胞将其高尔基体重新定位到前向区时，检测到表达的myc标记蛋白。5小时后固定细胞，记录创面边缘表达myc-tag的细胞高尔基体的位置。

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图5

高尔基体装置的重新定向需要Cdc42。（A） REF固定并用间接免疫荧光染色，显示伤后4h高尔基体的分布。在受伤后2、4和6小时，测量前向120°区域内高尔基体细胞的百分比（B）。高尔基体相对于伤口边缘的随机方向对应于0 h时的33%（B）。创伤后1h，将编码myc标记的V12Cdc42、N17Cdc42、WASp片段或N17Rac的表达载体微量注射到创伤边缘细胞。1小时后可首次检测到myc标记蛋白的表达，此时49%的第一排对照伤口边缘细胞的高尔基体朝向伤口。伤后6 h固定细胞并进行双重标记，以显示myc标记蛋白和高尔基体的表达（显示为C中myc标记的WASp片段和D中相应的高尔基体）。计算每种情况下高尔基体朝向伤口的细胞百分比（E）。对于每个时间点和/或实验条件，对来自三个不同实验的至少100个细胞进行评分。数值代表平均值±SEM.Bar，20μm。

赛车活动对突出活动和运动至关重要

细胞运动通常与两种富含肌动蛋白结构的突起有关，这两种结构分别由Rac和Cdc42控制，即位于细胞前缘的跛足和丝状足，以及在瑞士3T3成纤维细胞中(Ridley等人，1992年;Kozma等人，1995年;Nobes and Hall，1995年). 为了确定Rac是否在创伤诱导的细胞运动中发挥作用，对伤口两侧的细胞斑块进行微注射显性负Rac（N17Rac）蛋白或编码N17Rac的表达载体。罗丹明结合的卵磷脂染色显示，Rac的抑制阻断了所有的跛足活动（图。​（图2，2，将B与A进行比较）。细胞呈“扇形”，但仍能看到丝状伪足（图。​（图22B、 箭头）。抑制Rac对细胞运动有严重影响（图。​（图2，2、C和D）和定量分析（图。​（图3）三)结果表明，注射N17Rac蛋白的细胞中伤口闭合被阻断了约80%，而注射N17Rac表达结构的细胞中细胞运动被抑制了98%。这些值的差异可能反映了N17Rac蛋白的不稳定性（半衰期～3小时；Ridley等人，1992年). 微量注射组分活性Rac蛋白（V12Rac）对细胞运动没有抑制作用（图。​（图3）。三). 我们得出结论，Rac在受伤时被激活，Rac活性对细胞运动至关重要。

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图2

跛足性突起需要Rac。对照伤口（A）和N17Rac（1 mg/ml）注射伤口（B–D）被固定，肌动蛋白丝被罗丹明结合的指骨样肽可视化。B中的箭头表示丝状伪足从N17Rac注入细胞延伸。A中的棒材，20μm。伤口闭合测量的伤口分析如C和D所示。受伤后1小时，伤口边缘细胞被注入N17Rac和注射标记物（荧光葡聚糖，C）。约5-6小时后，当对照注射伤口闭合时，伤口得到修复。棒在C中，200μm。

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图3

激活或抑制Rac和Cdc42对伤口闭合的影响。REF单分子膜受到损伤，伤口边缘细胞中Rac和Cdc42的活性通过微量注射N17Rac（1 mg/ml）、N17Cdc42（2 mg/ml），WASp片段（2 mg/ml）、V12Rac（1mg/ml），V12Cdc42（1mg/ml）蛋白或编码相同蛋白的表达载体（括号中的DNA表示）进行调节。按照材料和方法中的描述计算伤口闭合百分比。实验创面在对照创面闭合的同时固定，并用罗丹明结合的指骨样肽染色，以观察肌动蛋白丝和创面间隙。细胞与荧光右旋糖酐共注射，以可视化注射的伤口边缘细胞的位置。值表示至少三个独立实验的平均值±SEM。

Cdc42活动需要在运动期间建立极性

为了确定Cdc42是否也在伤口闭合中发挥作用，在伤口对侧的细胞斑块中注射显性阴性Cdc42（N17Cdc42）蛋白或编码N17Cd42的表达载体。从图中可以看出。​图3三抑制Cdc42导致50%的细胞运动抑制。微注射具有Cdc42靶蛋白WASp的Cdc42结合结构域的细胞导致类似水平的抑制（图。​（图3），三)确认Cdc42是有效移动所必需的，但并非绝对必要。

为了研究Cdc42在伤口闭合过程中的作用，我们更仔细地观察了缺乏Cdc42活性的迁移细胞。图。​图44A显示了伤口边缘细胞的典型极化形态（用注入的荧光右旋糖酐显示），皱褶活动仅限于前缘。相反，图。​图44B显示了Cdc42被抑制的伤口边缘细胞的形态。细胞极性完全丧失且突起，细胞周围可见跛足活动。组成活性Cdc42（V12Cdc42）蛋白的表达对细胞极性没有影响（图。​（图44C） 或向前移动（图。​（图3）。三).

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图4

前缘细胞的形态极化需要Cdc42。伤后1 h，用荧光右旋糖酐（2 mg/ml）（A）或编码WASp片段的myc标记表达载体微量注射伤口边缘REF，以抑制Cdc42活性（B）或编码V12Cdc42（C）的myc标签表达载体。3小时后，当伤口仍然开放时，细胞被固定，通过间接免疫荧光观察myc标记蛋白。A–C中缠绕边缘的位置由箭头指示。棒材，20μm。

迁移细胞的极化形态还包括微管网络的重组和高尔基体在运动方向上的排列(Gotlieb等人，1981年,1983;Kupfer等人，1982年;Euteneuer和Schliwa，1992年;Bershadsky和Futerman，1994年). 尽管在REF伤口愈合试验期间未发现微管网络的重大重组（数据未显示），但诺可唑对微管的破坏确实抑制了伤口闭合60±6%(n个= 3). 另一方面，在分析过程中可以清楚地观察到高尔基体的重新排列。如图所示。​图5，5在实验过程中，高尔基体朝向运动方向的细胞百分比从33%（基本上是随机的）上升到>80%。虽然相对较长的时间过程表明，这种重新排列对运动来说并不必要，但它可能有助于运动，并且可以清楚地读出发展中的极化形态。为了确定细胞极性的这一方面是否需要Cdc42活性，在注射显性阴性Cdc42或WASp片段后，在伤口边缘细胞中测量高尔基体的重新定向。图。​图55（C–E）表明，Cdc42的抑制作用完全阻止了高尔基体的重新排列。组成型活性Cdc42（V12Cdc42）或显性阴性Rac（N17Rac）不抑制伤口诱导的高尔基体重新定向（图。​（图55E） ●●●●。

Rho和细胞运动

在瑞士3T3成纤维细胞中，Rho对肌动蛋白应激纤维和局灶性粘连的形成和维持都是必需的(雷德利和霍尔，1992年;霍钦和霍尔，1995年). REF单分子膜有丰富的应力纤维，在受伤后，活动边缘细胞继续显示许多肌动蛋白应力纤维朝向伤口和径向穿过细胞（图。​（图66A） ●●●●。为了确定细胞运动是否需要这些结构，以65–75μg/ml的浓度向细胞微量注射Rho抑制剂C3转移酶。​图6，6在这种浓度的C3转移酶下，细胞缺乏所有可见的应力纤维和局灶性粘连，但它们继续正常伸展跛足和丝状足，伤口闭合（图。​（图66D） ●●●●。

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图6

Rho是细胞基质粘附所必需的，但局灶性粘附和应力纤维抑制运动。伤后1h未经处理（A）或注射C3转移酶（0.07 mg/ml）的REF在伤后2h固定（B和C），用罗丹明结合的指骨肽（A和B）和间接免疫荧光（C）观察肌动蛋白丝。（D） 计算注射右旋糖酐（对照）、C3转移酶（0.07和0.3 mg/ml）和V14Rho蛋白（0.4 mg/ml）的伤口闭合百分比。值表示至少三个不同实验的平均值±SEM。棒材，20μm。在有或无Y-27632（20μm）的情况下，受伤REF在受伤后15分钟（E）和受伤后4小时的相控图像。棒材，100μm。

虽然伤口闭合不需要Rho活性，如应力纤维形成所示，但微量注射高四倍浓度（300μg/ml）的C3转移酶会导致底物粘附丧失和细胞严重回缩（数据未显示）在这些条件下，伤口闭合被显著抑制（80%抑制，见图。​图66D） ●●●●。因此，使用这种实验方法，我们无法评估肌动蛋白应激纤维/局部粘连的缺失是否可以增强细胞运动，因为C3转移酶抑制Rho至少有两种不同的作用。然而，通过阻断Rho，p160ROCK下游靶点之一的活性，可以更直接地抑制应力纤维和局部粘连(Uehata等人，1997年)，含化合物Y-27632。在20μM Y-27632的存在下，伤口边缘细胞含有少量肌动蛋白应力纤维（数据未显示），但仍附着在盖玻片上（图。​（图66F） ●●●●。在这些分析条件下，伤口闭合速度显著增加～30%，如伤口边缘的位置所示（图。​（图66F） 和缺失（图。​（图66G） 第Y-27632页。

最后，微量注射组分活性Rho蛋白（V14RhoA），该蛋白无法循环通过非活性GDP-结合状态，严重抑制伤口闭合（95%抑制；见图。​图66D） ●●●●。注射V14Rho并没有明显增加创伤边缘细胞中肌动蛋白应力纤维的数量，虽然在某些情况下，应力纤维和局部粘连似乎比对照细胞厚（数据未显示），但这些细胞已经大量存在。

我们的结论是，细胞运动不需要依赖于Rho的应力纤维和局部粘附，但如前所述，维持细胞基底粘附需要基本的Rho活性(Takaishi等人，1993年;Ridley等人，1995年;Santos等人，1997年). 此外，局部粘连和应力纤维在运动过程中必须进行动态翻转，这一要求会对运动速度产生抑制作用。

我们感谢Toshio Hamasaki（Yoshitomi Pharmaceutical Industries，Ltd.，Japan）提供Y-27632化合物，Tina Bridges和Anne Ridley提供重组蛋白，Hugh Paterson提供Ras抗体，Colin Hopkins提供高尔基抗体，Durward Lawson提供初级REF细胞。我们感谢保罗·马丁（Paul Martin）和路易斯·克莱默（Louise Cramer）对手稿的批判性阅读，感谢科林·霍普金斯（Colin Hopkins）和理查德·兰姆（Richard Lamb）的有益讨论。