营养因子介导的蛋白质降解与蛋白质合成耦合对神经元大小平衡的控制

细胞培养

从胚胎第21天的大鼠上颈神经节进行解剖。如前所述，在24孔组织培养皿中用酶和机械方法将细胞从神经节中分离出来，并将其镀在胶原蛋白基质上(约翰逊和阿吉罗，1983年;富兰克林等人，1995年). 简而言之，解剖后，在35°C下用胶原酶（1 mg/ml）处理神经节30分钟，然后用胰蛋白酶（2.5 mg/ml）在Lebovitz的L-15培养基中处理30分钟。将神经节置于培养基中（Eagle培养基加厄尔盐，补充10%FBS，100μg/ml青霉素，100μg/ml链霉素，20μM脱氧尿苷，20μM尿苷，1.4 mM我-谷氨酰胺和50 ng/ml 2.5S NGF），研磨，然后通过尺寸为3–20/14的Nitex过滤器（密苏里州堪萨斯城Tetko）过滤，从分离的细胞中分离出碎片。在所有实验中，每个孔大约植入0.5-1个神经节。神经细胞培养物保存在研磨和电镀所用的相同培养基中。纯非神经元培养物（非神经元细胞占电镀细胞总数的～20%）是通过在缺乏NGF且含有多克隆NGF中和抗体（山羊或兔抗鼠NGF）的相同培养基中电镀细胞制备的。没有神经元存活下来。这些培养物包含的非神经元细胞数量与神经元培养物相同。通过将培养基改为不含NGF且含有多克隆NGF中和抗体的培养基，神经细胞培养物也被剥夺了NGF。在实验中使用之前，通过在含NGF的培养基中滴定来确定阻断NGF促进存活所需的每批NGF抗血清或抗体的稀释度。

蛋白质降解

细胞蛋白的代谢标记在电镀后7天进行。除非另有说明，培养物在含有10μCi/ml TRAN的培养基中培养³⁵S标签（70%我-蛋氨酸，15%我-半胱氨酸）或10μCi/ml[^三H] 亮氨酸。使用任一标签都获得了相同的结果。除了标记的氨基酸和FBS中包含的氨基酸外，标记介质中只包含正常量的10%的蛋氨酸、半胱氨酸或亮氨酸。另外，标记培养基与标准培养基相同。为了研究短寿命蛋白质的降解，培养物在标记培养基中暴露1 h，然后进行两次洗涤和1 h冷追踪，然后再进行初始时间点。将短期池与长期池分开标记是不可能的。为了富集长寿命蛋白质，将神经元暴露于标记介质中24小时。由于标记期间短寿命池的持续周转，这种处理导致标记池长寿命的百分比更大。然后用标准培养基清洗细胞两次，并在此培养基中培养6小时，然后取初始时间点。用含0.5%的缓冲液溶解培养物N个-月桂酰肌氨酸、1 mM EDTA和10 mM Tris HCl，pH 7.5。蛋白质用10%冰镇TCA溶液沉淀，并通过0.45μm硝化纤维过滤器过滤保留。用液体闪烁计数法测量放射性。放射性标记的损失归一化为实验开始时测量的TCA可沉淀计数。姐妹非神经元培养物（不含NGF）与神经元培养物同时接受与神经元培养液相同的处理。然后从神经元培养物的TCA可沉淀计数中减去这些培养物中的TCA沉淀计数，以校正放射性标记物在非神经元细胞中的掺入和周转。非神经元培养物中TCA可沉淀计数为神经元培养物计数的～20%。该协议的微小变化如图图例所示。

细胞蛋白的TCA沉淀是研究总细胞蛋白降解或合成的唯一可用技术，多年来已成功用于此功能(普尔和维博，1973年;Deckwerth and Johnson，1993年;Rock等人，1994年). 除蛋白质外，核酸也通过这种方法沉淀。由于本研究中使用的放射性标记氨基酸未并入核酸，因此本文报告的大部分或全部TCA沉淀放射性来自蛋白质。

抑制剂对蛋白质合成的影响

在4小时的时间点内，细胞暴露于降解实验中使用的相同标记介质中，但含有大分子合成抑制剂。在24小时和72小时的时间点，将细胞分别在含有NGF和大分子合成抑制剂的标准培养基中孵育20或68小时。在实验的最后4小时内，将细胞暴露于含有抑制剂的标记培养基中。该培养基在实验开始时制作，并保存在培养箱中，直到用于补偿可能发生的任何抑制剂降解。在标记期间，TCA可沉淀计数与蛋白质的结合呈线性。以类似于蛋白质降解研究的方式，从每个数据点中减去适当的非神经元背景。

总细胞蛋白

用纳米橙蛋白定量试剂盒或BCA蛋白分析法测定培养物的总蛋白含量。用Eagle培养基或PBS（pH 7.2）清洗培养物三次，以去除血清。对于NanoOrange测定，使用试剂盒提供的200μl稀释剂对细胞进行裂解。用200μl该溶液清洗培养物，然后与裂解液混合。将50-μl小份裂解液添加到200μl纳米橙定量试剂中，并在95°C下加热10 min。冷却至室温后，使用微孔板阅读器分别使用485 nm和590 nm的激发和发射波长测量200μl处理混合物的荧光发射。对于BCA蛋白质分析，用试剂盒中的200μl溶液A冷冻溶解培养物。Cu的吸光度⁺-用Bio-Rad 96 well平板读取器读取二寸铜酸复合物。蛋白质浓度由不同浓度的BSA产生的标准曲线确定。

蛋白质凝胶和放射自显影

用于测定单个蛋白质物种降解的培养物被标记24小时，用于研究长寿命蛋白质总库的降解。然而，为了增加放射自显影的可视性，28μCi/ml TRAN³⁵使用S标记代替10μCi/ml。然后用200μl 1%Triton X-100在PBS（pH 7.2）中溶解细胞，每个培养物含有1 mM EDTA。将Laemmli样品缓冲液中等量的煮沸裂解物添加到8%三甘氨酸凝胶（Bio-Rad Laboratories）的每个孔中，并通过SDS-PAGE分离蛋白质。然后对放射性标记蛋白的干凝胶进行放射自显影。使用惠普ScanJet 4c扫描仪扫描自动射线照片，并由SigmaGel（加利福尼亚州圣拉斐尔Jandel Scientific）进行量化。

CHX对单个蛋白质物种降解的影响

为了进一步研究SCG神经元中蛋白质合成和蛋白质降解之间的关系，我们测定了CHX抑制合成对单个蛋白质物种降解的影响。用24小时热脉冲/6小时冷切方案对细胞进行放射标记。在标记细胞被裂解后的不同时间，用SDS-PAGE分离蛋白质，然后通过定量干凝胶的放射自显影图来测定蛋白带中残留的标记量（图。​（图22 A类). 准确量化了九条分离蛋白带的降解时间过程。正如预期的那样，标记最重的蛋白质是肌动蛋白和微管蛋白（图。​（图2，2,B类和C类). 这个t吨 _1/2在不含CHX的含有NGF的培养基中，神经元中肌动蛋白的降解时间为212小时，微管蛋白的降解速度为359小时。在含有NGF培养基中的培养物中，CHX（1μg/ml）抑制蛋白质合成导致肌动蛋白和微管蛋白降解在72小时内完全受阻。在不含NGF的培养物中，这两种蛋白质的降解率均与不含CHX的NGF培养物中的降解率无显著差异，并且通过这种浓度的CHX维持在可存活状态(P（P）< 0.01). 这些结果与图。​图11显示CHX在有NGF的情况下，但在无NGF的条件下，CHX对长寿命蛋白质的降解受阻。对照培养物裂解产物的自射线照片中的所有蛋白带也存在于接触CHX培养物的自射线图中，无论是否存在NGF。当提取NGF或添加CHX时，没有出现新的条带，任何条带的分子量也没有明显变化。因此，抑制蛋白质合成可减少全长蛋白质的降解；蛋白水解片段未被保存。当蛋白质合成在有NGF存在的情况下受到抑制时，所有蛋白质的半衰期都大大增加，但在没有NGF的情况下则没有。然而，并不是所有蛋白质都像肌动蛋白和微管蛋白一样表现出完全的降解抑制（图。​（图22 D类; 表​表I）。我). 这些发现进一步支持了NGF和蛋白质合成在调节交感神经元蛋白质降解速率中的作用。

在单独的窗口中打开

图2

CHX（1μg/ml）抑制蛋白质合成对交感神经元中个别蛋白质物种降解的影响。显示单个蛋白质衰变时间过程的自射线照片。CHX在培养基中存在NGF时抑制降解，但在没有NGF时不抑制降解。蛋白质条带的分子量（kD）显示在右侧。当CHX和NGF同时存在于培养基中时，肌动蛋白的衰变在72小时内被完全阻断。在缺乏NGF的CHX维持培养物中，降解与不含CHX的NGF维持的对照细胞中的降解大致相同。(C类)对保存在含有NGF的培养基中的培养物进行CHX处理也能完全阻断微管蛋白的降解。与肌动蛋白一样，在没有NGF的情况下，衰变与在没有CHX的NGF中维持的对照细胞几乎相同。(D类)分子量为100 kD的蛋白质的降解被抑制，但未被NGF维持培养物中CHX的存在完全阻断。同样，当NGF缺失时，CHX不影响该蛋白的降解。我们之前已经确定了A类如肌动蛋白和微管蛋白（未显示）。所示的每条带可能包含一种以上的蛋白质。例如，微管蛋白带同时包含α和β微管蛋白。n个每个数据点的2到3个单独镀层=3–9。为了量化降解，将所有蛋白带的密度归一化为T时的密度₀在同一张放射自显影上。

CHX和Anisomycin导致蛋白质合成速率的快速、持续钳制：放线菌素D和NGF的退出导致合成抑制减缓，但未维持在稳定水平

为了定量分析大分子合成抑制剂对蛋白质合成和蛋白质降解的影响之间的关系，将神经元暴露于不同浓度的抑制剂中，并评估其对合成和降解的影响。图。​图3三 A类显示IC₅₀CHX合成阻断剂在4h处理时为17 ng/ml，在72h暴露时为32 ng/ml。在连续暴露于标记物和1μg/ml CHX 72 h的细胞中，未发生掺入（未显示），表明蛋白质合成受到完全、持续的抑制。由于这种浓度的CHX也完全阻止了这段时间内长期存在的蛋白质库的降解（图。​（图1，1,C类和D类)这些数据表明，标签的重复使用不能解释抑制蛋白质合成对标签丢失的影响。另一种翻译抑制剂，茴香霉素（ANIS），用IC阻断合成₅₀8 ng/ml，暴露4小时，22 ng/ml（72小时处理）（图。​（图3三 B类). 72小时合成抑制的剂量-反应关系与4小时CHX和ANIS的相似。因此，CHX和ANIS都可以用于以特定的持续速率快速“钳制”蛋白质合成。放线菌素D（ACT D）是一种转录抑制剂，导致蛋白质合成缓慢受到抑制（图。​（图3三 C类). ACT D浓度在1 ng/ml到300 ng/ml之间，在4小时内对蛋白质合成没有影响。到24小时，ACT D导致IC合成的剂量依赖性抑制₅₀7 ng/ml。24 h时抑制尚未完成。然而，72 h后，ACT D浓度>10 ng/ml完全阻止蛋白质合成（IC₅₀为4纳克/毫升）。据推测，ACT D抑制蛋白质合成的缓慢时间过程是mRNA在合成受到影响之前从细胞中清除所需时间的函数。Deckwerth和Johnson（1993）据报道，缺乏NGF也会大大降低SCG培养物中的蛋白质合成速率。我们重复了这个实验，发现在NGF退出后24小时内，蛋白质合成率已降至对照的18%（图。​（图3三 D类). CHX、ANIS、ACT D和NGF去除等每一种处理都通过不同的机制减少蛋白质合成(Reich和Goldberg，1964年;Wettstein等人，1964年; Grollman等人，1967年）：CHX阻断核糖体上的易位反应；ANIS阻断核糖体上的肽基转移酶反应；ACT D与DNA结合并阻止RNA聚合酶的移动；营养因子撤除主要通过复杂信号通路的改变导致合成减少(Lin等人，1994年). 因此，这些实验建立了四种减少SCG神经元蛋白质合成的独立方法。

在单独的窗口中打开

图3

翻译和转录抑制剂以及提取NGF对蛋白质合成速率的剂量和时间依赖性抑制。(A类)神经元暴露于不同浓度的CHX 4小时或72小时后，蛋白质合成速率受到抑制的剂量/反应曲线相似。(B类)翻译抑制剂ANIS也能快速、持续地抑制蛋白质合成速率。(C类)转录抑制剂ACT D导致合成抑制缓慢发展。(D类)NGF停药后蛋白质合成速率下降的时间过程。n个=11–36个培养物，每个数据集2到4个镀层，NGF停药数据除外，其中n个=单个镀层的每个数据点为6至7。曲线是逻辑方程对数据的最佳最小二乘拟合。

CHX、ANIS和ACT D，但非NGF提取，抑制长寿命蛋白质库的降解

环己酰亚胺和ANIS均对蛋白质降解产生剂量依赖性抑制（图。​（图4，4,A类和B类). 两种化合物在72小时内阻止长寿命蛋白质降解的剂量-反应关系与在此期间抑制蛋白质合成的剂量-响应关系相似（图。​（图3，三,A类和B类). IC₅₀CHX和ANIS的降解抑制率分别为59 ng/ml和54 ng/ml。ACT D还阻止降解，1 ng/ml几乎没有影响，100 ng/ml导致90%的降解抑制（图。​（图44 C类). 因为CHX、ANIS和ACT D通过三种不同的方法阻止蛋白质合成(Reich和Goldberg，1964年;Wettstein等人，1964年;格罗尔曼，1967年)这些数据强烈表明，这些抑制剂对降解的影响是由于它们对蛋白质合成的影响，而不是对蛋白质降解的非特异性影响。与NGF存在下抑制剂减少蛋白质合成不同，通过去除NGF抑制蛋白质合成不会阻断蛋白质降解（图。​（图11 B类). 因此，当存在NGF时，蛋白质合成速率保持不变，并调节长期蛋白质库的降解速率；当去除NGF时，蛋白质合成下降，这种调节失去。

在单独的窗口中打开

图4

翻译和转录抑制剂对长寿命蛋白质降解的剂量依赖性抑制。(A类)CHX对蛋白质降解的影响。(B类)ANIS对蛋白质降解的影响。(C类)ACT D对蛋白质降解的影响。(D类)长寿命蛋白质的降解速率是蛋白质合成速率的线性函数。72小时内蛋白质合成速率的抑制导致同一时期蛋白质降解速率几乎相同的百分比降低。降解速率常数(k个 _d日)因此，与蛋白质合成的速率常数类似(k个 _秒). CHX和ANIS在较高浓度下的差异较大（即蛋白质合成和降解较低），这是因为ANIS在完全抑制蛋白质合成的浓度下抑制蛋白质降解的效果不如CHX（图。​（图3，三,A类和B类、和图。​图44 B类). 这种差异可能是由ANIS的轻微毒性引起的，因为ANIS的浓度仅略高于此处所示的浓度，因此产生了严重的毒性效应。CHX在任何测试浓度下均无明显毒性作用。另一种蛋白质合成抑制剂，嘌呤霉素对细胞具有高度毒性（数据未显示）。神经元A–C标签如图所示。​图1，1,B类和D类在初始时间点后72小时测量剩余TCA可沉淀计数。n个=12–31个培养物，每个数据点2到3个单独的镀层A–C.中的曲线A类和B类是logistic方程对数据的最佳最小二乘拟合。蛋白质合成数据D类是图中72小时的数据。​图3，三,A类和B类降解数据来自图。​图4，4,A类和B。直线是CHX和ANIS数据的线性回归或两个数据集的组合(实线).

图。​图44 D类结果表明，蛋白质合成速率与长寿命蛋白质库降解速率之间呈线性关系。CHX处理的细胞中合成和降解之间关系的回归线斜率为-1.22，而ANIS处理的细胞的斜率为-0.75。CHX和ANIS的组合数据斜率为−1.01。这些数据表明蛋白质降解速率和蛋白质合成速率之间接近1:1的耦合。我们强调，这种耦合不是产生和降解蛋白质的绝对数量之间的耦合，而是合成和降解的相对速率之间的耦合。由于蛋白质合成是一个具有零级动力学的过程，P（P） _秒，等于合成的速率常数，k个 _秒(Doyle和Tweto，1975年). 因此，减少P（P） _秒导致同等百分比的减少k个 _秒.图。​图44 D类说明此处给出的数据表示降解的一级速率常数，k个 _d日，几乎是的线性函数k个 _秒因此，减少k个 _秒减少了一定的百分比k个 _d日以大致相等的百分比。

合成-降解耦合与神经元萎缩、生长和凋亡的关系

直到最近，细胞大小的调节还很少受到关注(Schmidt和Schibler，1995年;拉夫，1996;Gao和Raff，1997年). 目前还没有研究旨在了解非循环细胞（如神经元）的大小控制或生长动态平衡，尽管这种调节似乎必须存在。虽然动物的体型由细胞数量决定（Raff，1997），但单个动物细胞的大小在很大程度上取决于总蛋白质含量(拉斯穆森和伯杰，1982年;克拉克等人，1993年). 细胞骨架蛋白形成一个支架，控制基本的细胞形状，而蛋白质浓度对细胞体积有着深刻的影响。后一种效应是由于蛋白质作为细胞内高浓度钾离子的主要膜无氧反阴离子的作用(麦克奈特，1988年). 细胞蛋白质含量增加需要增加钾以中和蛋白质上的负电荷。为了保持与细胞外介质的渗透平衡，钾浓度的增加反过来需要增加细胞水。因此，蛋白质的积累与细胞肥大有关，而蛋白质的减少与细胞萎缩有关(拉斯穆森和伯杰，1982年;克拉克等人，1993年).

长寿蛋白质通常是细胞的结构成分或执行“管家”功能，而短命蛋白质是代谢途径中的转录因子或速率调节酶(戈德堡和圣约翰，1976年;Jentsch和Schlenker，1995年). 为了使细胞能够快速适应不断变化的环境条件，需要在每种蛋白质的基础上快速调节后一种蛋白质的数量。结构蛋白或看家蛋白，尤其是成年神经元，不需要经历如此快速的上调或下调，而是必须支持细胞长期相对不变（人类和一些爬行动物神经元长达一个世纪或更长时间）。然而，在长寿细胞的生命周期中，即使这些蛋白质也会多次转换。因此，蛋白质的生产和降解必须达到精细平衡。如果这种平衡不存在，产生和降解的蛋白质数量的微小差异将随着蛋白质周转而放大，最终影响细胞大小和其他细胞特性。因此，这里描述的蛋白质合成和降解之间的耦合似乎对短期和长期细胞稳定性都至关重要。

我们在这里报告的现象表明，SCG神经元中长寿命蛋白质的相对合成和降解速率（即每单位时间合成或降解的蛋白质数量）几乎是1:1耦合的。例如，当蛋白质合成速率在72小时内降低50%时，长寿命蛋白质的降解速率在同一时期内降低了～50%。我们研究了蛋白质合成过程中蛋白质降解的解耦联与NGF戒断引起的神经元凋亡之前的萎缩的相关性。我们发现萎缩可能是两个过程解耦的直接结果。当从神经元中提取NGF时，蛋白质合成下降，但蛋白质降解没有下降；这导致细胞总蛋白（即。，dP/dt（磅/日）<0），明显导致躯体萎缩（图。​（图66 A类). 这与其他一些已被研究的萎缩类型有些不同，在这些类型的萎缩中，总蛋白的损失主要是由于降解率增加所致。例如，在恶病质或肌肉失神经期间发生的萎缩中，蛋白质降解增加，而合成可能保持不变(Furuno等人，1990年;Temparis等人，1994年;Toomey等人，1995年).

在单独的窗口中打开

图6

概要模型。(A类)蛋白质降解/合成耦合、大小稳态和生长稳态之间可能的关系示意图。(B类)通过一种介质控制蛋白质降解的假设模型，该介质因NGF的存在而变得短暂。

蛋白质降解和合成速率之间耦合的逻辑结果是P（P） _秒可能不会显著改变dP/dt（磅/日）.降解速率，P（P） _d日作为一阶，等于k个 _d日(P（P） ₁−P（P） ₂)其中P（P） ₁是初始蛋白质浓度P（P） ₂是特定时间后测量的最终浓度。自从k个 _秒/k个 _d日长期蛋白质降解的比率似乎是一个常数(C类)（图。​（图44 D类)和P（P） _秒=k个 _秒，蛋白质合成速率与降解速率的比值由下式给出C类/ΔP哪里ΔP=P（P） ₁−P（P） ₂因此，长寿命蛋白质库的积累完全由降解的蛋白质量控制。因此，dP/dt理论上，无论蛋白质合成的实际速率如何，长寿命蛋白质库中的蛋白质应该以近似相同的速率发生（当然，当P（P） _秒接近0）。就长寿命蛋白质的积累对生长的贡献而言，我们的数据表明，神经元的生长速度可能会受到蛋白质合成速度变化的缓冲。因此，似乎NGF介导的蛋白质降解和合成速率之间的耦合不仅可以防止萎缩，还可以调节神经元生长的稳态。我们将在今后的工作中解决这个问题。

在许多情况下，凋亡是一个需要激活蛋白酶caspase家族成员的过程(恒星，1995;怀特，1996年). 一旦被激活，这些蛋白酶就会降解或激活负责细胞死亡的底物。尽管caspase的激活对大多数凋亡死亡（包括NGF缺乏的交感神经元中发生的凋亡）起着重要作用(Martinou等人，1995年;Deshmukh等人，1996年;Troy等人，1996年)在SCG神经元中，这种杀伤活动发生在经历了大量遗传过程的细胞中(Estus等人，1994年;Freeman等人，1994年)代谢和形态变化(Deckwerth and Johnson，1993年). 失去营养因子的交感神经细胞表现出蛋白质合成减少、葡萄糖摄取减少、神经突起断裂(Deckwerth and Johnson，1993年)正如我们在这里所展示的那样，在他们承诺死亡之前就已经萎缩了。一种广谱caspase蛋白酶抑制剂（Boc-天冬氨酰（OMe）-氟甲基酮）；BAF）可防止神经突起断裂和NGF剥夺的SCG神经元死亡，但不能防止蛋白质合成减少或萎缩(Deshmukh等人，1996年). 这里报道的研究结果表明，营养因子剥夺导致的程序性死亡中蛋白质合成减少和萎缩，虽然可能是诱导或“启动”凋亡所必需的，但并不是最终凋亡过程的一部分。我们的观察进一步支持了这一观点（未发表）BAF不会抑制NGF维持细胞中的正常蛋白质周转，并且似乎不会对BAF存在下维持存活状态的NGF缺乏细胞中的蛋白水解产生显著影响。SCG神经元在死亡前数小时内损失了25%的总蛋白含量(Deckwerth and Johnson，1993年). 因此，凋亡死亡过程中发生的大量蛋白质损失是由于蛋白质合成减少以及蛋白质周转率持续正常所致。显然，被半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶降解的导致细胞死亡的蛋白质底物仅占细胞总蛋白的一小部分。因此，半胱天冬酶似乎在萎缩达到一定阶段后才被激活。一旦被激活，半胱天冬酶就会在已经经历了大规模蛋白水解以及其他代谢、遗传和形态变化的细胞环境中导致死亡。

我们感谢P.Lipton博士和P.Osborne女士对手稿的批判性评论。我们还感谢A.L.Schwartz博士审阅了手稿的早期版本；R.Kirkland女士负责技术援助；和D.Creedon博士的宝贵技术建议。

这项工作得到了罗纳德·麦克唐纳基金会（Ronald McDonald Foundation）、美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）拨款NS 24679以及威斯康星大学医学院（University of Wisconsin Medical School）霍华德·休斯医学院（Howard Hughes Medical Institute）医学院研究资源计划（Research Resources Program。