美国国家科学院院刊。2007年12月4日;104(49): 19512–19517.
小分子obatoclax(GX15-070)拮抗MCL-1并克服MCL-1介导的凋亡抵抗
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理查德·马塞卢斯
†Gemin X Biotechnologies,Inc.,加拿大魁北克省蒙特利尔H2X 2H7;
安妮·鲁斯顿
†Gemin X Biotechnologies,Inc.,加拿大魁北克省蒙特利尔H2X 2H7;
马克·沃森
†Gemin X生物技术公司,加拿大魁北克省蒙特利尔市H2X 2H7;
露西尔·塞尔法斯
†Gemin X Biotechnologies,Inc.,加拿大魁北克省蒙特利尔H2X 2H7;
S.R.穆西·马迪拉朱
†Gemin X Biotechnologies,Inc.,加拿大魁北克省蒙特利尔H2X 2H7;
丹尼尔·古莱特
†Gemin X Biotechnologies,Inc.,加拿大魁北克省蒙特利尔H2X 2H7;
让·维亚莱
†Gemin X Biotechnologies,Inc.,加拿大魁北克省蒙特利尔H2X 2H7;
劳伦特·贝莱克
†Gemin X Biotechnologies,Inc.,加拿大魁北克省蒙特利尔H2X 2H7;
泽维尔·比洛特
†Gemin X Biotechnologies,Inc.,加拿大魁北克省蒙特利尔H2X 2H7;
斯蒂芬·阿科卡
*生物化学和
‡加拿大国家研究委员会生物技术研究所计算化学与生物学,加拿大魁北克省蒙特利尔市,H4P 2R2;和
恩里科·普里西马
*生物化学和
‡加拿大国家研究委员会生物技术研究所计算化学与生物学,加拿大魁北克省蒙特利尔市,H4P 2R2;和
阿德里安·维格曼斯
§澳大利亚维多利亚3002东墨尔本Peter MacCallum癌症研究所
利奥尼·克鲁斯
§澳大利亚维多利亚3002东墨尔本Peter MacCallum癌症研究所
里基·约翰斯通
§澳大利亚维多利亚3002东墨尔本Peter MacCallum癌症研究所
皮埃尔·博帕兰特
†Gemin X Biotechnologies,Inc.,加拿大魁北克省蒙特利尔H2X 2H7;
戈登·肖尔
*生物化学和
‖加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学麦吉尔癌症中心H3G 1Y6;
†Gemin X Biotechnologies,Inc.,加拿大魁北克省蒙特利尔H2X 2H7;
*生物化学和
‖加拿大魁北克省蒙特利尔市麦吉尔大学麦吉尔癌症中心H3G 1Y6;
†Gemin X Biotechnologies,Inc.,加拿大魁北克省蒙特利尔H2X 2H7;
‡加拿大国家研究委员会生物技术研究所计算化学与生物学,加拿大魁北克省蒙特利尔市,H4P 2R2;和
§澳大利亚维多利亚3002东墨尔本Peter MacCallum癌症研究所
由王晓东(Xiaodong Wang)在德克萨斯州达拉斯德克萨斯大学西南医学中心(University of Texas Southwestern Medical Center)进行沟通,2007年10月16日。
作者贡献:M.N.、R.C.M.、A.R.和M.W.对本作品的贡献相等;M.N.、R.C.M.、A.R.、M.W.、L.S.、S.R.M.M.、D.G.、J.V.、L.B.、X.B.、S.A.、E.P.、A.W.、L.C.、R.W.J.、P.B.和G.C.S.设计的研究;M.N.、R.C.M.、A.R.、M.W.、L.S.、S.R.M.M.、D.G.、L.B.、X.B.、S.A.、A.W.和L.C.进行研究;M.N.、R.C.M.、A.R.、M.W.、L.S.、S.R.M.M.、D.G.、J.V.、L.B.、X.B.、S.A.、E.P.、A.W.、LLC.、R.W.J.、P.B.和G.C.S.分析数据;G.C.S.写了这篇论文。
除了不受控制的细胞增殖外,恶性细胞表型的转化与细胞凋亡的消除有关,这一发现最初来源于对BCL-2型致癌基因(1,2). 然而,BCL-2已成为一个抗凋亡和促凋亡蛋白家族,其部分功能是调节和执行凋亡的线粒体核心途径(三). 此外,癌细胞的细胞增殖和细胞死亡潜能似乎密切相关,因为c-myc等癌基因是凋亡机制的有效激活剂,并依赖BCL-2等促生存调节因子来减弱这种凋亡反应,从而驱动肿瘤发生(4–7). 再加上BCL-2可以抑制许多抗癌药物诱导凋亡的事实,这一发现已经得出结论,BCL-2通路的治疗调节可能代表了多种癌症环境中的一种新的治疗选择(8,9).
BCL-2机制的一个关键要素是控制线粒体外膜的通透性,允许释放位于膜间空间的调节因子,包括细胞色素c(c)释放后,它们激活半胱天冬酶和核心凋亡途径(10). BCL-2家族的这种控制是通过在促凋亡成员和抗凋亡成员之间发生的二元蛋白质-蛋白质相互作用来实现的,这种相互作用是通过将促凋亡成员的两亲性BH3结构域插入由BH1、BH2、,和生存前成员表面的BH3域(11). 然而,生存前成员BCL-2、BCL-XL、MCL-1、BCL-w或A1是如何拮抗膜渗透的,这是一个相当有争议的话题(12). 然而,无论是直接还是间接通过BH3-only成员,促存活成员必须最终阻止多BH域促凋亡成员BAX和BAK的激活,这两个成员是膜渗透的效应器。这种拮抗作用发生在外膜内,在BCL-2抑制BAX的情况下,可能涉及大量构象变化,并在刺激下进一步渗透到两种蛋白质的膜脂双层,以驱动两种蛋白质之间的相互作用(13,14).
尽管蛋白质-蛋白质相互作用的复杂性以及促生存成员对凋亡的抑制作用,但目前强烈支持BH3模拟物对抗促生存成员作为潜在的治疗干预手段(15,16). 然而,可能有不同的方式来实现这一结果。例如,生存前家族成员之间的非等效功能冗余,个体成员在死亡刺激下可能存在的不同构象状态,以及这些蛋白质进入靶膜的程度,这可能意味着可以开发出具有不同作用机制和选择性的BCL-2蛋白治疗性拮抗剂。MCL-1的独特特性说明了一个例子。它的结构与BCL2/BCL-XL的结构相比具有特殊的差异(17). 再加上蛋白质的其他性质,这可能解释了最近描述的BCL2/BCL-XL小分子抑制剂ABT-737对MCL-1没有表现出效力的事实(16). 此外,目前的证据表明,MCL-1通过与线粒体外膜内的BAK组成性相互作用来调节BAK(18,19). 因此,抑制MCL-1可能需要破坏预先形成的MCL-1/BAK膜复合物。最后,MCL-1在生存前BCL-2成员中是不同的,因为它在稳定状态下迅速翻转,因为26S蛋白酶体降解(18,20). 因此,蛋白酶体的抑制导致MCL-1在许多系统中积累。鉴于MCL-1在癌症环境中赋予细胞凋亡抵抗力的重要性,显然需要在治疗上克服这种抵抗。
在此,我们描述了包括MCL-1在内的促生存BCL-2成员的小分子抑制剂,并说明了这种名为obatoclax(GX15-070)的化合物如何克服MCL-1所赋予的抗凋亡作用。Obatoclax是一种疏水性分子,是作为BCL-2家族拮抗剂开发的。目前正在对多种白血病、淋巴瘤和实体瘤恶性肿瘤的多单药和联合Ib期和II期临床试验进行评估。obatoclax克服MCL-1特异性介导的细胞凋亡抗性的能力为将obatoclax与其他活性受MCL-1抑制的靶向抗癌剂合理组合提供了基础。
结果和讨论
奥巴托克[GX15-070;支持信息(SI)图6]源于一项旨在治疗性调节BCL-2家族的生存前成员的发现和开发计划。最近的一项研究在荧光偏振分析中比较了许多此类小分子抑制BH3肽与BCL-2、BCL-XL、MCL-1、BCL-w、A1和BCL-b胞浆结构域重组片段结合的能力,证实了奥巴曲松抑制了所有6个成员的这种相互作用(K(K)我值≈1–7μM),对控制蛋白质-蛋白质相互作用没有影响(21). 然而,在这种和其他用于测量BCL-2结合活性的水基分析的条件下,疏水性多巴酚丁胺在很大程度上是不溶性的(计算logP>4.0);实验logD测量显示,化合物在pH 7.4时仅分配到辛醇相中。由于这种不溶性,其在这些分析中的活性要么被低估,要么无法测定。这个问题扩展到蛋白质-肽相互作用的抑制和核磁共振。
虽然该化合物有望很容易分割成亲脂环境,如BCL-2家族成员所在的膜,但我们研究了obatoclax与BCL-2嵌合体细胞溶质片段的结合方式生物信息学通过利用结合到小分子BH3肽模拟物(1YSW)的重组片段的NMR结构SI图6;裁判。16). 安生物信息学发展了对接算法(22)准确预测了该肽模拟物在BCL-2 BH3结合槽内的观察方向,该结合槽由NMR获得,是得分最高的姿势。使用此算法将obatoclax对接到BCL-2(参见SI材料和方法)表明该化合物占据BH3结合槽一端的疏水囊(A类;SI图7),这是最近描述的ABT-737的远端(16,23). 因为这种疏水性囊袋与全长BCL-2的正常膜整合形式中的脂质双层非常接近就地,该膜可以增强该囊袋对疏水性分子(如obatoclax)的可及性。
Obatoclax干扰MCL-1/BAK相互作用。(一)BCL-2 BH3结合槽内obatoclax的预测方向(另见SI图7和SI材料和方法). (b条)中断分离线粒体中MCL-1/BAK的组成性相互作用。从SK-Mel5细胞中分离出线粒体,并在37°C下与指示浓度的obatoclax或NOXA BH3肽孵育30分钟,然后与0.1 mM LC-SMCC(+)或载体(DMSO)(-)进行化学交联。阻断过量LC-SMCC后,用洗涤剂溶解线粒体,并用抗MCL-1抗体进行免疫沉淀,用抗MCL-1和抗BAK抗体进行免疫印迹检测沉淀。(c(c))奥巴曲克拮抗细胞中MCL-1/BAK的结合。将SK-Mel5细胞与DMSO或obatoclax在DMSO中孵育5h,然后用抗MCL-1抗体对总细胞裂解物进行免疫沉淀。用SDS/PAGE分离免疫沉淀物和细胞裂解物,并用抗MCL-1和抗BAK抗体进行Western blot分析。
obatoclax与BCL-2细胞溶质结构结合的预测亲和常数,如一和SI图7使用SIE评分函数计算(参考。22;SI材料和方法). 为了控制计算的可靠性,计算了12个小分子配体的训练集与BCL-2的结合亲和力,这些配体的结合亲和力是实验公布的。该组的计算和实验结合亲和力高度相关(SI表1). 结果表明,obatoclax将这种细胞溶质形式的BCL-2与计算的K(K)我≈220 nM。然而,由于生存前BCL成员在细胞膜上或细胞膜内发挥作用,我们的实验分析集中于完整细胞或细胞器中化合物的活性。正如预期的那样,奥巴托拉索的亚细胞分布被异位BCL-2的特异性分布所调控(SI图8).
Obatoclax能有效抑制完整线粒体中MCL-1和BAK之间的组成性相互作用。
由于奥巴托拉索的疏水特性与膜相容,因此该化合物干扰BCL蛋白-蛋白质相互作用的能力是在分离的完整线粒体中确定的。我们利用了MCL-1与线粒体外膜中的BAK组成性相互作用的事实(18,19). 化学交联用于测量这种相互作用,因为它可以在保持膜结构完整性的同时进行。进行潜在交联剂的筛选,并显示LC-SMCC[3-氨基丙基三乙氧基硅烷(APTES),琥珀酰亚胺-4-(N个-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧基-(6-氨基丙酸)](一种共价连接伯胺和硫醇的膜渗透性异双功能化合物)作为最佳试剂。LC-SMCC对obatoclax没有反应。将人SK-Mel5黑色素瘤细胞的线粒体与载体(DMSO)或含有0.1 mM LC-SMCC的载体孵育,然后用洗涤剂溶解线粒体。用抗MCL-1抗体免疫沉淀法回收MCL-1,用免疫印迹法测定与BAK交联的MCL-1沉淀物(MCL-1/BAK二聚体)和单体MCL-1的存在(b条). 用10nM的obatoclax或与人类NOXA BH3结构域相对应的合成25-aa肽(与MCL-1选择性相互作用;参考文献。24)在添加交联剂之前,强烈抑制MCL-1/BAK二聚体的形成(b条). 然而,值得注意的是,在分离的线粒体中添加高达2.0μM的obatoclax并不能刺激细胞色素的释放c体外而相应浓度的BID BH3肽可以激活BAX和BAK(25)耗尽线粒体细胞色素库c(c)(SI图9).
因此,obatoclax似乎破坏了完整线粒体中MCL-1/BAK的相互作用,但在本试验条件下,该位点的BAK对孤立线粒体的激活不是最佳的,或者需要第二个刺激物才能被激活(例如,由癌细胞中的强直信号通路提供),从而导致细胞色素的释放c(c)在表达MCL-1的淋巴瘤细胞中,用奥巴曲松作为单一药物治疗,激活BAX和BAK并释放细胞色素c(c)从线粒体上观察到caspase激活上游(26). 然而,为了证实奥巴托拉索可以抑制细胞内内源性MCL-1/BAK相互作用,用化合物处理SK-Mel5细胞,回收并清洗细胞,细胞颗粒溶解在含有洗涤剂Nonide P-40的过量溶液中,MCL-1通过过夜免疫沉淀回收。免疫印迹法测定免疫沉淀中MCL-1和BAK的含量。尽管在免疫沉淀过程中,obatoclax的细胞含量显著稀释,但细胞暴露于1μM obatoclax 5 h后,MCL-1恢复的BAK量显著减少,在5μM时几乎完全抑制(c(c)). 共免疫沉淀也揭示了BCL-2与BIM相互作用的破坏(数据未显示)。
Obatoclax对抗BCL通路,依赖BAX或BAK。
由于多种间接途径(例如促凋亡应激途径)也可能影响该BCL成员的活性,因此,对奥巴曲松直接拮抗哺乳动物细胞MCL-1的能力的检测变得复杂。酵母,酿酒酵母然而,不包含任何已知的BCL-2同源物,但已经注意到BAX或BAK的过度表达会抑制其细胞生长(27). 这种抑制可以通过表达MCL-1(和BCL-2、BCL-XL或BCL-w)来抵消(SI图10一). 在50μM浓度下,奥巴托拉西不影响对照酵母细胞的生长;然而,它显著克服了生存前成员对抗BAX或BAK介导的细胞生长抑制的能力。虽然50μM是一种相对较高的化合物外部浓度,但蛋白质是通过高拷贝数质粒表达的;此外,酵母对药物的吸收和滞留不同于哺乳动物细胞,这与以下发现一致:与哺乳动物细胞中有效的浓度相比,酵母细胞通常需要至少100到1000倍浓度的抗癌化合物来抑制细胞生长(28). 关于喜树碱和阿霉素相对于几个人类细胞系的实例,请参见SI图10b条重要的是,在没有BAX或BAK的情况下,每一个存活前BCL成员的表达并没有赋予酵母细胞对奥巴托拉松的敏感性,这表明该化合物对酵母细胞生长的影响取决于BAX或BAK的存在。
酵母细胞的研究结果表明,缺乏BAX和BAK表达的哺乳动物细胞对催产素的反应应该是对凋亡产生抵抗。这种预测在来源于Bax公司,贝克双击鼠标(29). 与转化的WT细胞相比,DKO细胞抵抗caspase-3的激活(一)以及对催产素的反应将DNA裂解为寡核苷酸片段(b条),两者都是细胞凋亡的标志。此外,obatoclax诱导Bax、Bak-表达的WT细胞凋亡的能力也扩展到抑制恶性肿瘤细胞集落形成的能力。在小鼠Eμ-Myc淋巴瘤细胞模型中检测到这种活性(30,31)其中,MCL-1、BCL-2或A1的过度表达提供了对Myc表达介导的凋亡应激的保护(c(c)). 在所有三种细胞系中,obatoclax强烈抑制集落形成和存活。
奥巴曲松诱导细胞凋亡和抑制集落形成。(一)删除Bax公司和贝克引起对obatoclax的抗性。婴儿肾上皮细胞系来源于WT和巴克斯,贝克用含有2.0μM obatoclax或0.5μM staurosporin(STS)的载体(DMSO)或载体处理双基因敲除(DKO)小鼠,20 h后处理caspase-3的大亚单位(箭头)SDS/PAGE和免疫印迹分析检测。(b条)如中所示一经0.05μM(3、10道)、0.2μM(4、11道)和1μM(5、12道)STS处理16h后,用琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色检测到寡核苷酸片段;obatoclax处理为0.5μM(泳道6和14)、1μM(泳道7和15)和2μM(泳道8和16)24小时(c(c))过度表达Bcl-2、Mcl-1或A1的小鼠EμMyc B细胞淋巴瘤细胞系对奥巴曲松的敏感性。如参考文献所述,将细胞暴露于1μM obatoclax或ABT737中24 h,将培养基(含化合物)稀释30倍,7天后在软琼脂上记录菌落形成。45.
奥巴曲克克服MCL-1诱导的细胞凋亡抵抗。
与奥巴曲松相反,BH3模拟物ABT-737抑制过表达BCL-2的Eμ-Myc淋巴瘤细胞的集落形成,但不抑制过表达MCL-1或A1的Eμ-Myc淋巴瘤细胞的克隆形成(c(c)). 该结果与ABT-737不拮抗A1或MCL-1的发现一致(16,21)以及MCL-1对ABT-737诱导的凋亡产生细胞抵抗的观察(32,33). 因此,可以利用这种对ABT-737的耐药机制来确定奥巴托拉索是否能够克服MCL-1介导的凋亡耐药。为此,产生了一个KB口腔癌细胞系,该细胞系过度表达异位BCL-2(以限制细胞死亡),但也表达足够的内源性MCL-1,以限制ABT-737产生的细胞毒性( a–c). MCL-1介导的ABT-737耐药性的KB/BCL-2模型通过siRNA-介导的MCL-1敲除得到验证( b条和c(c)). 根据膜联蛋白V的反应性和碘化丙啶的摄取判断,单独敲除MCL-1或单独用0.5μM ABT-737处理细胞都不会导致细胞死亡;然而,两种治疗方法的联合使用具有很强的细胞毒性(c(c)).
BCL-2过表达的KB细胞,其内源性MCL-1对ABT-737产生耐药性。(一)KB细胞中BCL-2的稳定过度表达。(b条)MCL-1 siRNA降低KB/BCL-2细胞中MCL-1的表达(c(c))MCL-1敲除使KB/BCL-2细胞对ABT-737敏感。用人MCL-1 siRNA或萤光素酶(Luc)siRNA转染KB/BCL-2细胞,并将其接种到含有0.5μM ABT-737的培养基中。72天后,通过流式细胞术测定含有膜联蛋白V FITC和碘化丙啶的细胞百分比。
KB/BCL-2细胞也对0.1μM奥巴托品产生耐药性。然而,与MCL-1 siRNA一样,0.1μM obatoclax克服了MCL-1介导的对ABT-737的耐药性,导致细胞联合死亡(一). obatoclax治疗对MCL-1水平没有影响,但在那些被报道拮抗MCL-1的BH3-only成员中(BID、NOXA、BIM和PUMA;参考文献。24),BIM略有增加(b条). 然而,E1A/p53DN转化的肾上皮细胞来源于比姆−/−小鼠对催产素介导的杀伤反应和WT细胞一样敏感(c(c)),而比姆如参考文献所述,缺失导致对紫杉醇产生部分耐药性。34虽然BIM不需要用于催产素介导的细胞毒性,但其对催产素的反应增加可能会增强药物对MCL-1的抑制。
奥巴曲克克服了KB/BCL-2细胞对ABT-737的耐药性。(一)将KB/BCL-2细胞与指定浓度的ABT-737在不含或含有0.1μM奥巴托品的情况下孵育。用流式细胞术测定细胞摄取碘化丙啶的百分比。(b条)obatoclax对KB/BCL-2细胞MCL-1和BH3-only MCL-1拮抗剂表达的影响。在使用或不使用0.1μM奥巴曲松治疗72 h后,通过SDS/PAGE和免疫印迹分析25μg总细胞裂解液中的指示蛋白。(c(c))Bim缺失不会干扰obatoclax的细胞毒性。比姆−/−或Bim+/+用所示浓度的奥巴曲松或紫杉醇处理转化的幼鼠肾细胞72h,并测定细胞活力。显示标准误差(条)。
奥巴曲克克服了MCL-1介导的对蛋白酶体抑制剂硼替佐米在黑色素瘤中的耐药性。
相对于BCL-2家族的其他生存前成员,MCL-1的一个独特性质是其通过26S蛋白酶体复合体快速稳定地周转(18,20),由E3连接酶MULE/LASU1对MCL-1的构成性泛素化引起(35,36). 干扰E3连接酶或蛋白酶体本身的活性可导致MCL-1蛋白水平显著升高。此外,MCL-1的升高可能会干扰蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Velcade)对来自恶性肿瘤细胞的治疗反应,该药物目前已被批准用于治疗多发性骨髓瘤(37)和套细胞淋巴瘤(26). 对于多发性骨髓瘤(38)和套细胞淋巴瘤(39)联合使用硼替佐米和奥巴托拉司部分克服了对硼替佐米特的耐药性,并导致细胞毒性反应增强。因此,obatoclax克服MCL-1介导的对硼替佐米的耐药性的能力,可以改善在其他适应症中使用硼替佐米作为单一药物的反应障碍。
黑色素瘤细胞系B16-F1中举例说明(). 之所以选择这种细胞系,是因为硼替佐米不影响诺克萨(数据未显示),诺克萨与MCL-1一样,在蛋白酶体抑制作用下也可以升高(39,40). 即使在药物浓度相对较高的情况下,该细胞系对硼替佐米也具有特别的耐药性。硼替佐米使MCL-1在100nM药物浓度下升高到接近最高水平( 顶部)细胞在高达500 nM浓度的药物作用下抵抗24小时( 中部和底部). MCL-1 siRNA在硼替佐米浓度范围内阻止MCL-1蛋白水平的诱导( 顶部)并通过膜联蛋白V染色测量,使细胞对100nM硼替佐米诱导的细胞凋亡敏感,而其自身没有影响( 中部). 由于obatoclax可以拮抗MCL-1,预计其作用类似于MCL-1 siRNA。选择的Obatolax浓度仅对annexin V染色有轻微影响( 底部(直方图左侧),但发现它能增强50或500 nM硼替佐米。因此,蛋白酶体抑制剂和MCL-1拮抗剂的联合应用可使黑色素瘤以及其他潜在的癌症适应症受益。
奥巴曲克克服了MCL-1介导的黑色素瘤细胞对硼替佐米的耐药性。(顶部)用荧光素酶siRNA或小鼠Mcl-1 siRNA转染小鼠黑色素瘤B16-F1细胞24小时,然后用指定浓度的硼替佐米治疗24小时。用免疫印迹法分析总细胞裂解物中Mcl-1的表达。(中部)如中所示顶部除了通过流式细胞术测定结合膜联蛋白V的细胞百分比外。(底部)将B16-F1细胞与硼替佐米单独或与50 nM奥巴托拉松联合培养24 h,细胞凋亡(annexin V染色)测定为中部.
奥巴托克表现出单药抗肿瘤活性。
多个癌细胞株对奥巴曲松治疗有细胞毒性反应。当静脉注射时,发现奥巴曲松在几种标准小鼠肿瘤模型中具有单药抗肿瘤作用。示例见SI图11一和b条在患有实体瘤的小鼠中观察到了在没有动物体重减轻的情况下的抗肿瘤活性,包括来源于小鼠乳腺癌和人结肠癌、前列腺癌和宫颈癌细胞系的实体瘤。
结束语。
obatoclax的疏水性似乎与BCL-2促生存蛋白作用的线粒体外膜环境相兼容。事实上,我们能够证明MCL-1和BAK在完整的线粒体外膜内的构成性相互作用受到了强有力的抑制。因此,我们在维持细胞膜完整性的系统中进行了大部分分析,包括完整的线粒体和细胞。结合用BCL/BAX或BCL/BAK途径重组的酵母细胞和BAX和BAK缺失的小鼠上皮细胞中的发现,这些结果共同表明,奥巴曲松可以抑制BCL-2家族的前存活成员对抗BAX或BAK的能力,从而引起细胞毒性。这种细胞毒性还扩展到抑制B细胞淋巴瘤小鼠Eμ-Myc模型中的集落形成和人类肿瘤小鼠异种移植模型中的抗肿瘤活性。
癌症靶向治疗的发展带来的一个重要机遇是合理组合这些药物以实现药物协同作用的能力。为了说明奥巴托拉索的这种潜力,我们探索了其与26S蛋白酶体抑制剂硼替佐米(Velcade)和BCL-2/BCL-XL、BCL-w选择性抑制剂ABT-737的组合。在这两种情况下,MCL-1均对这些药物产生耐药性:在硼替佐米的情况下,因为该药物干扰MCL-1的快速稳态转换,导致MCL-1升高;对于ABT-737,因为BCL-2拮抗剂没有显著抑制MCL-1。选择了siRNA分析证实MCL-1内源性水平对这些药物产生耐药性的细胞模型。正如预期的那样,奥巴曲松被发现可以克服MCL-1介导的对硼替佐米或ABT-737的耐药性,在这两种情况下,都记录了与奥巴曲拉的强协同细胞毒性。对于具有限制性副作用的强细胞毒性类硼替佐米(41)与奥巴托拉司联合使用可能会减少硼替佐米所需的剂量,以实现治疗益处,并提高其在癌症适应症中的治疗潜力,因为硼替佐米不能作为单一药物使用。此外,硼替佐米诱导MCL-1的证据,无论是否伴随NOXA诱导,都可以作为生物标记物来预测与MCL-1拮抗剂(如奥巴托拉司)的协同作用。
最后,本文报告的研究结果与以下原则相一致,即在临界阈值水平以下抑制MCL-1,而不是完全抑制,足以阻止MCL-1抵抗导致细胞死亡的信号。这一点是相关的,因为MCL-1是发育过程中的一种基本蛋白质,完全抑制可能对某些正常组织有毒。小鼠生殖系消融Mcl-1型例如,基因导致了围植入期胚胎死亡(42),条件基因缺失表明MCL-1在B和T淋巴细胞的发育和维持中发挥重要作用(43). 然而,重要的是,只需部分敲除内源性MCL-1即可使过度表达BCL-2的细胞株对ABT-737诱导的细胞毒性敏感。因此,obatoclax等小分子能够将MCL-1的功能阈值降低到临界水平以下,这可能为在适当的癌症环境中进行有效和安全的治疗提供了一个治疗窗口。
材料和方法
用分离线粒体进行分析。
如参考文献所述,从SK-Mel5中分离出线粒体。44对于MCL-1/BAK相互作用,40μg分离的线粒体与obatoclax或NOXA BH3肽在50μl 200 mM甘露醇、70 mM蔗糖、10 mM Hepes(pH 7.5)和1 mM EDTA中在37°C下孵育30分钟。重新分离线粒体,并在25°C的相同缓冲液中与0.1 mM LC-SMCC交联30分钟。将交联的线粒体重新分离,在50mM Hepes(pH 7.7)、150mM NaCl、0.1%Triton X-100、0.5%Nonidet P-40和1mM EDTA中裂解,并用抗MCL-1抗体(Stressgen)进行免疫沉淀。沉淀用SDS/PAGE进行分析,然后用抗MCL-1和抗BAK(Upstate)抗体进行免疫印迹。用于细胞色素分析c(c)将25μg从KB细胞分离的线粒体与如上所述的obatoclax或BID BH3肽孵育。用SDS/PAGE和抗细胞色素免疫印迹法分离和分析线粒体颗粒和上清液c(c)抗体(BD Biosciences)。
细胞免疫共沉淀。
SK-Mel5细胞在37°C下与obatoclax或DMSO孵育5小时。将细胞颗粒重新悬浮在冰镇的10 mM Tris(pH 8.0)、60 mM KCl、1 mM EDTA、1 mM DTT、0.5%Nonide P-40(IGEPAL)、10 mM钒酸钠、50 mM NaF、0.1 mM PEFABLOC、1μg/ml胃蛋白酶抑制素A和leupeptin以及10μg/ml抑肽酶中,并轻轻地上下移液10-15次。样品在冰上培养10分钟,然后以10000×克在4°C下保持15分钟。将细胞提取物(250μg蛋白质)与免疫沉淀(IP)缓冲液(50 mM Hepes,pH 7.7,150 mM NaCl,0.1%Nonide P-40(IGEPAL),5 mM EDTA)混合至1 ml的体积,并与2μg兔抗MCL-1抗体(SC-819;Santa Cruz Biotechnology)在4℃孵育过夜。免疫复合物通过与预先用IP缓冲液平衡的蛋白A包被的Sepharose珠孵育而沉淀,并用1ml IP缓冲液洗涤五次。免疫沉淀蛋白在12.5%SDS/PAGE凝胶上分离,并使用以下抗体进行Western blot分析:小鼠抗MCL-1抗体(PharMinen)(1/1000稀释);兔抗BAK(上游)抗体(1/1000稀释);和HRP结合的山羊抗兔或抗鼠抗体(1/5000稀释)。使用ECL plus Western blot检测试剂盒(Amersham)检测蛋白质。
siRNA转染。
从Dharmacon购买了四个针对人类MCL-1或小鼠MCL-1 mRNA的siRNA池。根据制造商的方案,使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将人MCL-1 siRNA或荧光素酶siRNA池转染KB/BCL-2细胞两次。第二次转染后24小时,细胞被镀入含有化合物的培养基中。72小时后,用流式细胞仪对细胞进行分析。对于小鼠B16-F1细胞,使用Lipofectamine 2000转染小鼠Mcl-1 siRNA或荧光素酶siRNA池一次。转染后24小时,将细胞接种到含有化合物的培养基中;第二天收集细胞并进行流式细胞术分析。
流式细胞术。
收集处理过的细胞,用PBS清洗,并将其重新悬浮在缓冲液[10 mM Hepes(pH 7.4)、140 mM NaCl、2.5 mM CaCl中2]含有制造商描述的膜联蛋白V(Biovision)或碘化丙啶(Molecular Probes)。细胞在25°C下培养15分钟,并通过流式细胞仪进行分析。有关更多信息,请参阅SI材料和方法.