随着越来越多的证据表明，病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞（CTL）在遏制HIV-1在感染者体内的传播方面起着重要作用，人们已经达成共识，即HIV-1疫苗应刺激CTL的产生(1). 这一要求对HIV-1疫苗的开发提出了一些挑战。事实证明，诱导高频率、持久HIV-1特异性CTL反应的安全疫苗方法难以实现。此外，由于测量靶细胞裂解的传统方法繁琐且难以量化，因此监测疫苗合法HIV-1特异性CTL生成的效率一直存在问题。
诱导特异性CTL反应通常需要与主要组织相容性复合物（MHC）I类分子相关的短肽的细胞内合成、加工和细胞表面呈现。重组痘苗病毒有效激发和刺激CTL的能力使其成为强大的研究工具(2,三). 然而，这种具有复制能力的实验室菌株可能不适合用作疫苗，尤其是在艾滋病毒感染高危人群中。幸运的是，存在高度减毒的痘苗病毒株。其中一种病毒，改良的安卡拉痘苗病毒（MVA），在鸡胚成纤维细胞中连续传代超过500代后，在人类和大多数哺乳动物细胞中复制能力出现缺陷(4–6). 值得注意的是，在人类细胞流产感染期间，MVA表达的重组蛋白相当于完全复制的痘苗病毒(7). 此外，重组MVA诱导的抗体和CTL反应至少与在保护性免疫实验动物中复制痘苗病毒诱导的抗体或CTL反应一样好或更好，以对抗包括流感病毒、副粘病毒和猴免疫缺陷病毒在内的致病病毒(8–10). 这些观察结果表明，重组MVA作为HIV-1疫苗的组成部分可能具有优势。
广泛的细胞操作和长时间的在体外细胞培养导致了使用传统杀伤试验评估CTL功能的困难。然而，关于荧光染料偶联四聚体MHC类I肽复合物能与表位特异性CD8+T细胞亚群特异性结合的报告，提出了利用流式细胞术研究CTL的可能性(11). 事实上，最近在小鼠系统和人类中进行的实验表明，这种方法在分析病毒特异性CTL方面的能力和准确性(12–15). 它在评估感染猴免疫缺陷病毒（SIV）的恒河猴外周血中Gag特异性CTL方面也被证明是有用的(16).
在本研究中，我们评估了重组MVA-SIV的能力性虐待堵漏波尔构建以诱发SIV性虐待恒河猴Gag-特异性CTL。我们证明了针对优势SIV的CTL反应的疫苗诱导性虐待通过使用功能性和四聚体MHC类I肽结合分析在这些动物中检测Gag表位。此外，我们发现这些CTL存在于接种疫苗的猴子的外周血和淋巴结中。
材料和方法
选择Mamu-A*01+恒河猴。
通过以下方法选择表达Mamu-A*01 MHC I类分子的恒河猴马穆阿*01-RNeasy纯化法分离的5×10总RNA的特异性逆转录-PCR6外周血单个核细胞。简单地说，在含有50 mM KCl、10 mM Tris（pH 8.3）、5 mM MgCl的100 ml反应中，从5 mg RNA合成cDNA2dATP、dCTP、dGTP和dTTP各1 mM，2.5 mM oligo-d（T）16，50单位RNase抑制剂，75单位MuLV逆转录酶（GeneAmp RNA PCR核心试剂盒，加利福尼亚州福斯特市珀金-埃尔默）。cDNA在25°C下合成15分钟，在42°C下合成45分钟，然后在99°C下失活10分钟。然后在含有2mM MgCl的热启动反应中使用20μl这些cDNA进行PCR扩增2、50 mM KCl、10 mM Tris（pH 8.3）、每个引物0.5 mM、AmpliWax Gem 100和5单位AmpliTaq DNA聚合酶（Perkin–Elmer）。将反应加热至94°C 2 min，并通过45个循环进行扩增：90°C下40 s，69°C下20 s，72°C下1 min，最后延伸7 min。对每个cDNA进行两次反应。第一个反应使用了独特的引物马木-A*01序列（正向5′-GGCGGCTCCACTCCATGAA-3′和反向5′-ATGTGCTTGGGGGGTCCGT-3′）从马木A*01-阳性样本。第二个反应使用了所有已知的保守引物马穆阿，-B类、和-E类从所有样本中扩增出197-bp片段的序列（正向5′-GCTAGTGGACGACCACGCAGCAGT-3′和反向5′-CCGCGGAGGCGCGAGGCCGTC-3′）。恒河猴MHCⅠ类基因序列(17)和序列对马木-A*01这些引物由David I.Watkins（威斯康星地区灵长类动物研究中心和威斯康星大学病理学系）善意提供。PCR产物在3%琼脂糖凝胶（ISS agarose HT，Integrated Separation Systems，Natick，MA）中通过电泳进行分析，选择两种产物均扩增的猴作为表达Mamu-a*01 MHC I类分子的猴。通过纯化PCR产物的直接测序进行验证（QIAquick PCR纯化试剂盒，Qiagen）。
恒河猴免疫。
猴子通过静脉接种108任一MVA的斑块形成单元(n个=2）或MVA-SIV性虐待堵漏波尔(n个=4）在0周和13周时采集痘苗病毒，每次免疫后依次采集EDTA抗凝血。第二次免疫后2周进行淋巴结活检。通过Falcon细胞过滤器从淋巴结中分离出单核细胞，并用于随后的细胞毒性分析、染色和表型分析。
重组MVA结构。
SIV公司性虐待H4型堵漏波尔ORF（核苷酸1049–5397）被克隆到pMC03的Pme I位点(18)因此它将受到强合成早/晚启动子的调节(19). 将质粒转染到感染MVA的鸡胚成纤维细胞和添加X-Gluc（5-溴-4-氯-3-吲哚-β）后染蓝的斑块中-d日-葡萄糖醛酸（CLONTECH）的提取和纯化基本如所述(18). 用SIV感染猕猴的血清（代码RH E544 1/31/94）对斑块和SDS聚丙烯酰胺凝胶的印迹进行免疫染色，证明gag-pol蛋白的表达。重组病毒在鸡胚成纤维细胞中扩增并通过36%蔗糖缓冲液离心纯化(20). 通过用RH E544血清对感染的鸡胚成纤维细胞进行免疫染色来测定该库存的滴度。
功能性细胞毒性试验。
外周血淋巴细胞（PBL）来自马木-A*01+用10μg/ml p11C（EGCTPYDINQML）以5×10的密度培养恒河猴6细胞/ml。培养第3天，向培养基中添加重组人IL-2（20单位/ml；由Hoffman–La Roche提供），并将培养物再维持4天。然后将PBL在Ficoll-Hypaque（Ficoopaque；Pharmacia）上离心，并在标准中评估为效应细胞51使用含10的U底微量滴定板测定Cr释放4具有不同浓度效应细胞的靶细胞。对所有井进行了两次化验。以自体B淋巴细胞母细胞系为靶细胞，隔夜用1μg/ml p11C、C-M（CTPYDINQM）或1μg/ml对照肽p11B（ALSEGCTPYDIN）孵育51铬标签。平板在37°C的加湿培养箱中培养4小时。具体释放量计算为[（实验释放-自发释放）/（最大释放-自发发布）]×100。在所有分析中，使用洗涤剂（2%Triton X-100；Sigma）的自发释放小于最大释放的20%。
p11C特异性CD8+T淋巴细胞的染色和表型分析。
可溶性四聚体Mamu-A*01/p11C，C-M复合物如黑田所述等。(16). 将藻红蛋白标记的ExtrAvidin（Sigma）与生物素化的Mamu-A*01/p11C，C-M复合物以1:4摩尔比混合以生成四聚体。用于本研究的单克隆抗体直接偶联到异硫氰酸荧光素、藻红蛋白-蝶红或别藻蓝蛋白。
使用以下单克隆抗体：抗CD8α（Leu2a）-异硫氰酸荧光素（Becton Dickinson）和抗CD8β（2ST8–5H7）-藻红蛋白-Texas红（Coulter）（识别CD8分子的α链和β链结合产生的新抗原决定簇）。识别恒河猴CD3的单克隆抗体FN18直接与别藻蓝蛋白偶联，CD3是NIH小D.M.Neville，MD Bethesda的礼物。藻红蛋白偶联的四聚体Mamu-A*01/p11C，C-M复合物与抗CD8α-异硫氰酸荧光素、抗CD8β-藻红蛋白-Texas红和抗恒河猴CD3-别藻蓝蛋白结合使用。
如前所述，在COULTER EPICS Elite ESP上制备并分析淋巴细胞(16). 使用史诗精英软件版本4.02（Coulter）。数据表示使用温姆迪软件版本2.7（Joseph Trotter，加利福尼亚州拉霍亚）和Microsoft电源插座软件版本4.0c（c）（微软，华盛顿州雷蒙德）。
结果
重组MVA-SIV对恒河猴的免疫性虐待 堵漏波尔引发了功能性Gag表位特异性CTL反应。
恒河猴接种重组MVA-SIV性虐待 堵漏波尔，并对其PBL进行功能性SIV评估性虐待-特定CTL活动。因为选择动物进行表达恒河猴MHC I类等位基因的研究马木-A*01，可以预测任何SIV性虐待该疫苗接种产生的Gag特异性CTL活性仅限于显性9-aa表位p11C、C-M（Gag的181–189氨基酸）(21–23). 四只猴子收到108MVA-SIV的斑块形成单元性虐待插科打诨两个收到108通过静脉接种控制MVA的斑块形成单位。然后每2周对这6只动物的PBL进行一次p11C、C-M特异性CTL活性的评估在体外用p11C刺激。
如图所示。，四只猴子中有三只接种了MVA-SIV性虐待堵漏波尔接种疫苗后14天产生Gag表位特异性CTL反应在体外肽刺激。这种反应一直持续到第91天进行第二次免疫。在第四只猴子449中，初级CTL反应可以忽略不计。在第91天增强后，先前存在SIV的三只猴子的Gag表位特异性CTL反应增加性虐待-特定CTL活动。此外，猴子449，直到那时才证明没有SIV性虐待-特异性CTL活性，发展出Gag表位特异性CTL活性，与其他三只猴子相当。这两个马木-A*01+仅用MVA免疫的恒河猴没有产生Gag表位特异性CTL反应，表明MVA-SIV性虐待堵漏波尔免疫是诱导Gag特异性CTL的主要原因。
用MVA-SIV为恒河猴接种疫苗性虐待 插科打诨诱导Gag表位特异性功能性CTL活性。马木-A*01+恒河猴接种MVA-SIV性虐待 堵漏波尔(A类)或控制MVA(B类)如箭头所示，在第0天和第91天。这些猴子的PBL在在体外p11C刺激用于p11C、C-M特异性裂解。如图所示，在三个效应器：目标比率下评估溶解度。
重组MVA-SIV性虐待Gag Pol-Vaccined恒河猴发育成Mamu-A*01/p11C、C-M四聚体结合、CD8αβ+外周血T淋巴细胞。
对这些接种疫苗的猴子的PBL也进行了监测，以确定与四聚体Mamu-a*01/p11C，C-M结合的CD8+T淋巴细胞群的发育情况。在新鲜分离的全血中以及在接种疫苗后，对PBL的四聚体结合情况进行了评估在体外用p11C培养。MVA-SIV之一的数据性虐待堵漏波尔-接种了疫苗马木-A*01+图中显示了恒河猴。首次接种疫苗后，新鲜分离血液中的淋巴细胞表现出最小的四聚体结合。然而，在在体外用p11C刺激后，这些相同的淋巴细胞群与多达26%的CD8αβ+T淋巴细胞结合。第二次接种后1周，在新鲜分离的全血中，可以证明四聚体与1.8%的CD8αβ+T淋巴细胞结合。此外，在在体外用p11C刺激这些相同的PBL，四聚体结合的T淋巴细胞扩增到多达42%的CD8αβ+T细胞。
接种MVA-SIV后与接种恒河猴（443）CD8αβ+外周血T淋巴细胞结合的四聚体Mamu-A*01/p11C，C-M复合物性虐待 堵漏波尔流式细胞术直方图显示了新鲜PBL和p11C刺激PBL在第一次接种后两个时间点和第二次接种后的两个时间点将四聚体结合到门控CD8αβ+CD3+T淋巴细胞。这些值表示结合四聚体的CD8αβ+T淋巴细胞的百分比。
表总结了所有六种细胞的四聚体染色和功能性p11C、C-M特异性CTL数据马木-A*01+动物第一次免疫后14、35和91天，第二次免疫后10和28天。初始免疫后，仅一只443只猴子的新鲜分离外周血中可显示四聚体结合CD8αβ+T淋巴细胞，在第14、35和91天，仅0.1%、0.3%和0.1%的猴子细胞中可显示。然而，在第二次免疫后10天，在所有MVA-SIV的全血中可发现明显的四聚体结合CD8αβ+T细胞群性虐待堵漏波尔-免疫动物。这一结果在猴子443中最大，4.9%的CD8αβ+T细胞表现出四聚体结合。用p11C培养PBL 6天后，所有4株MVA-SIV的T细胞性虐待堵漏波尔-免疫猴表现出四聚体结合细胞的扩增，达到所有CD8αβ+T淋巴细胞的19-44%。因此，这种疫苗合法的优势SIV性虐待Gag表位特异性CD8+T淋巴细胞反应可通过四聚体染色技术进行检测。
表1
MVA-SIV的PBL性虐待 堵漏波尔-接种了疫苗马穆-A*01+恒河猴与四聚体Mamu-A结合*01/p11C，C-M复合体
| 免疫接种 | 猴子 | 化验 | 免疫后一天
|
|---|
主要
| 次要
|
|---|
| 14 | 35 | 91 | 101 | 119 |
|---|
| MVA-SIV公司性虐待插科打诨 | 442 | 新鲜* | 0 | 0 | 0 | 0.7 | 0.3 |
| | 肽刺激的† | NT公司§ | NT公司 | 11.3 | 21.5 | 25.9 |
| | %特异性裂解‡ | 50 | 24 | 27 | 42 | 45 |
| 443 | 新鲜 | 0.1 | 0.3 | 0.1 | 4.9 | 0.7 |
| | 肽刺激的 | NT公司 | NT公司 | 13.3 | 23.9 | 27.1 |
| | %特异性溶解 | 33 | 33 | 31 | 43 | 59 |
| 446 | 新鲜 | 0 | 0 | 0 | 0.6 | 0.6 |
| | 肽刺激的 | NT公司 | NT公司 | 13.4 | 44.4 | 35.7 |
| | %特异性溶解 | 3 | 26 | 24 | 54 | 41 |
| 449 | 新鲜 | 0 | 0 | 0 | 1.7 | 0.5 |
| | 肽刺激的 | NT公司 | NT公司 | 5.6 | 18.5 | 15.6 |
| | %特异性溶解 | 1 | 0 | 1 | 40 | 35 |
| 控制MVA | 454 | 新鲜 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| | 肽刺激的 | NT公司 | NT公司 | 0 | 0 | 0 |
| | %特异性溶解 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 |
| 459 | 新鲜 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| | 肽刺激的 | NT公司 | NT公司 | | 0 |
| | %特异性溶解 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 |
重组MVA-SIV性虐待Gag-Pol免疫诱导恒河猴淋巴结中Gag表位特异性CTL。
通过功能性杀伤试验和四聚体染色，在接种疫苗的恒河猴的淋巴结中评估Gag表位特异性CTL。第二次免疫后14天，同时检测淋巴结淋巴细胞和PBL在体外用p11C刺激SIV性虐待Gag表位特异性裂解活性。如图所示。，在四种MVA-SIV的淋巴结淋巴细胞中显示Gag特异性溶解性虐待堵漏波尔-接种了MVA疫苗但没有接种两个对照组的猴子。肽刺激淋巴结淋巴细胞的裂解活性始终低于相同猴子的类似刺激PBL的裂解活性。
MVA-SIV的淋巴结和外周血中存在Gag表位特异性CTL性虐待 堵漏波尔-给恒河猴接种疫苗。MVA-SIV外周血和淋巴结中的淋巴细胞性虐待 堵漏波尔-对接种了疫苗（猴子442、443、446和449）和对照MVA疫苗（猴子454和459）的动物进行p11C、C-M特异性裂解活性评估。如图所示，在四个效应器：目标比率下评估溶解度。
这些淋巴结淋巴细胞与四聚体Mamu-A*01/p11C，C-M复合体结合的细胞进行了类似的评估。如表所示在四种MVA-SIV的淋巴结中，在一小部分新分离的淋巴细胞中检测到四聚体结合细胞性虐待堵漏波尔-接种了疫苗（0.1-0.5%CD8αβ+T细胞），但没有接种两个对照MVA的猴子。体外用p11C刺激淋巴结淋巴细胞，导致结合CD8αβ+T淋巴细胞的四聚体大量扩增为CD8ααβ+T细胞的11–16%。因此，通过杀灭试验和四聚体染色，在这些接种疫苗的猴子的淋巴结淋巴细胞中可以证明Gag表位特异性CD8+CTL。
表2
MVA-SIV淋巴结T淋巴细胞性虐待 堵漏波尔接种了疫苗马穆-A*01+恒河猴与四聚体Mamu-A结合*01/p11C，C-M复合体
| 免疫接种 | 猴子 | %CD8αβ四聚体结合
|
|---|
| 新鲜* | 消化肽† | %特异性裂解‡ |
|---|
| MVA-SIV公司性虐待堵漏波尔 | 442 | 0.1 | 10.7 | 24 |
| 443 | 0.5 | 15.8 | 26 |
| 446 | 0.3 | 11.6 | 20 |
| 449 | 0.3 | 13 | 28 |
| MVA控制 | 454 | 0 | 0 | 0 |
| 459 | 0 | 0 | 0 |
讨论
先前的研究表明，重组MVA能够在恒河猴体内诱导针对副流感病毒3型包膜蛋白的高滴度抗体反应，并对这些动物进行保护性免疫以抵抗呼吸道挑战(24). 此外，表达堵漏波尔和环境价值在恒河猴静脉注射SIV后，SIV诱导的中和抗体和调节病毒血症性虐待(9). 尽管重组MVA先前已被证明可在小鼠中诱导CTL(8,25–27)，这在灵长类动物中尚未检测到。
目前的研究表明，重组MVA-SIV性虐待插科打诨疫苗构建物可以在恒河猴中引发Gag特异性CTL反应。这种反应的一些特征强调了重组MVA作为HIV-1疫苗载体的潜在效用。首先，诱导的CTL反应可以用相同的疫苗结构来增强。这表明对载体的免疫不足以限制反复接种时病毒蛋白的表达。其次，在接种疫苗的动物的淋巴结中可以发现CTL。由于HIV-1在感染者体内复制的主要部位是淋巴结，因此成功的HIV-1疫苗必须诱导在这些解剖部位活跃的CTL。
复制缺陷病毒对重组蛋白诱导高水平体液和细胞免疫的能力似乎与直觉相反。基于在体外在对猴细胞的研究中，我们预计MVA的细胞间传播有限，但在受感染的细胞中高表达(6). 虽然尚未测试，但我们认为，由复制缺陷型MVA形成的少量痘苗病毒颗粒可能会降低宿主抗病毒反应，从而延长重组基因的表达。MVA的完整基因组序列为其强大的免疫原性提供了额外的解释(28). 在众多被删除的基因中，有许多基因编码负责免疫逃避的蛋白质；其中包括干扰素-γ、干扰素α/β、肿瘤坏死因子和CC趋化因子的可溶性受体(28,29). 因此，结合高表达、更有限的抗痘苗反应和缺乏免疫调节病毒蛋白可能会弥补复制缺陷。
由于对非定量检测的依赖性，迄今为止，在疫苗接种者中监测HIV-1特异性CTL反应被证明是有问题的。目前的研究表明，耐受性良好的疫苗模式可以引发CTL反应，而CTL反应可以通过使用四聚体染色技术轻易检测到。这一观察表明，四聚体染色可能补充甚至取代传统的杀灭试验，用于监测非人类灵长类动物和人类的HIV-1疫苗试验。
