突变体动力蛋白的表达抑制内吞蓖麻毒素的毒性和向高尔基体的转运

细胞

HeLa细胞系（tTA-HeLa[19]）与cDNA稳定转化，用于dyn^重量，动态^K44A公司和dyn^G273D型如前所述进行培养(10–12). 简单地说，细胞生长在Falcon（新泽西州富兰克林湖）或Nunc（伊利诺伊州纳珀维尔）烧瓶中，并保存在DME（苏格兰欧文Flow Laboratories）中，DME补充有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2 mM我-谷氨酰胺、400μg/ml基因素、200 ng/ml嘌呤霉素和1μg/ml四环素。对于实验，dyn^重量和dyn^K44A公司电池（4–6×10⁴细胞/ml）接种四环素和不四环素，48h后使用。在一些实验中，在实验开始前24小时，将丁酸（2 mM）或TSA（0.1或1μM）添加到生长培养基中。对于实验，dyn^G273D型在30°C条件下，加入和不加入四环素培养细胞3d。

细胞内吞和降解的测量

转铁蛋白的内吞作用在与¹²⁵Hepes培养基中的I-转铁蛋白（～100 ng/ml）基本上如Ciechanover等人所述(5). 在用转铁蛋白孵育后，用冰镇Hepes培养基清洗细胞三次，并在0°C下用Hepes介质中的pronase（2 mg/ml）处理1h。将混合物转移到Eppendorf管中并离心2分钟。分离颗粒和上清液并测量放射性。胞内蓖麻毒素的量被测量为¹²⁵I标记的毒素，无法通过在4°C下用0.1 M乳糖溶液培养细胞1小时来清除(52). 蓖麻毒素的降解被测量为2小时后三氯乙酸无法沉淀的放射性量(52).

蛋白质合成的测量

通过在Hepes培养基（无未标记的亮氨酸）中培养细胞，用1–2μCi/ml测量蛋白质合成[^三H] 亮氨酸在37°C下持续30分钟。然后去除培养基并添加5%（wt/vol）三氯乙酸。10分钟后，用同样的溶液清洗细胞一次。最后，将细胞溶解在KOH（0.1 M）中，并测量酸可捕集放射性。结果以百分比表示[^三H] 无毒素培养细胞中的亮氨酸。副本之间的偏差变化不超过10%。

蛋白质分泌的测量

HeLa细胞在不含蛋氨酸的DME中清洗（Flow Laboratories），然后用[³⁵S] 同一介质中的蛋氨酸（～40μCi/ml）。15分钟后，洗涤细胞，并用含有FCS（5%）和蛋氨酸（4mM）的Hepes培养基进一步孵育1小时。然后向细胞和培养基中加入三氯乙酸，将沉淀物溶解在KOH（0.1M）中，并通过液体闪烁测量放射性。

蓖麻素A-sulf-1和蓖麻素A-sulf-2的硫酸化

如最近所述，生产、纯化和重组了蓖麻毒素A-sulf-1和用蓖麻毒素B重组的蓖麻毒素A-sulf-2(48). 蓖麻毒素A-sulf-1含有硫酸化位点，而蓖麻毒素A-sulf-2同时含有硫酸化和糖基化位点。细胞在无硫酸盐的DME中清洗，并用100μCi/ml Na培养³⁵SO公司₄在相同的介质中。4小时后，添加蓖麻毒素硫-1或蓖麻毒素磺-2（～200纳克/毫升），并继续培养3-4小时。然后取出培养基，在一些实验中按如下所述对蓖麻毒素进行免疫沉淀，以调查是否分泌了硫酸化蓖麻毒素。将细胞在37°C的PBS中用0.1 M乳糖溶液洗涤两次（5分钟），然后用冷PBS溶解（溶解缓冲液：0.1 M NaCl，10 mM Na₂高性能操作₄，1 mM EDTA，1%Triton X-100和1 mM PMSF，pH 7.4），并在离心机（5415型；Eppendorf Scientific，Inc.，Madison，WI）中以5000 rpm的转速离心10分钟以去除细胞核。上清液用固定在CNBr–Sepharose 4B上的兔抗蓖麻毒素抗体在4℃下免疫沉淀3 h。最后，用含0.35%Triton X-100的冷PBS洗涤珠子两次，并在还原条件下用SDS-PAGE（12%）分析吸附材料。

电子显微镜

25厘米长的细胞²用Hepes培养基清洗烧瓶，并在37°C的相同培养基中与蓖麻毒素HRP结合物孵育1 h。然后用PBS清洗细胞两次，并在室温下用2%戊二醛将其固定在pH 7.2的0.1 M Na-cacodylate缓冲液中30分钟。用PBS仔细洗涤（五次）后，将细胞在含有0.5mg/ml二氨基联苯胺和0.5μl 30%H的PBS中孵育₂O（运行）₂/ml，室温下。然后将细胞从烧瓶上刮下并造粒。用OsO对颗粒进行后固定₄用1%乙酸铀酰在蒸馏水中处理，嵌入Epon中，切割并在电子显微镜下检查（型号100；新泽西州马瓦市飞利浦电子光学公司）。

Western Blot分析

细胞用PBS洗涤，并在样品缓冲液中用巯基乙醇溶解。对裂解产物进行SDS-PAGE（7.5%），并将凝胶中的蛋白质转移到硝化纤维素膜上（德国达塞尔Schleicher&Schuell）。在含有0.1%吐温20的PBS中用2%的脱脂奶粉封闭膜，并在室温下用抗动力蛋白抗体（0.08μg/ml）（Upstate Biotechnology Inc.，Lake Placid，NY）在含有1%脱脂奶粉的PBS和0.1%吐温20的溶液中孵育1小时。然后用0.1%吐温20清洗膜三次10分钟，最后在室温下用与辣根过氧化物酶结合的山羊抗鼠IgG抗体孵育1小时。使用化学发光检测试剂盒（SuperSignal^TM（TM）CL-HRP；皮尔斯伊利诺伊州罗克福德市）。

免疫荧光

戴恩^K44A型细胞在四环素存在或不存在的情况下生长48h。然后用2%甲醛固定亚流培养物，用0.2%皂苷在5%的山羊血清中渗透，用多克隆抗M6PR抗体（由Bernard Hoflack，EMBL，Heidelberg，Germany善意提供）培养，然后用德克萨斯州红共轭山羊抗兔IgG（Southern Biotechnology Associates，Inc.，Bermingham，AL）培养。

Dyn的影响^K44A公司和Dyn^G273D型蓖麻毒素细胞毒性的过度表达

蓖麻毒素与糖蛋白和含末端半乳糖的糖脂结合。内吞作用后，可能在转运到高尔基体和内质网后(75,76)，少量蓖麻毒素分子到达胞浆，足以通过从60S核糖体亚单位的28S RNA中去除腺嘌呤来抑制蛋白质合成(14,15). 研究dyn是否过度表达^K44A公司改变蓖麻毒素使细胞中毒的能力，我们在向dyn中添加浓度增加的蓖麻毒素后3小时测量蛋白质合成^K44A公司（图。​（图55 A类)和dyn^重量（图。​（图55 B类)用四环素（仅表达内源性dynamine）或不使用四环素的细胞（dyn的过度表达^K44A公司或dyn^重量）。令人惊讶的是，细胞过度表达dyn^K44A公司对蓖麻毒素的抗性比任何一种dyn都强^重量或dyn^K44A型表达内源性动力蛋白的细胞。无论是否有血清（3%），毒性差异均相同。如图所示。​图55 B类，dyn过度表达^重量对细胞对蓖麻毒素的敏感性无影响。

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图5

蓖麻毒素抑制HeLa-dyn蛋白质合成的能力^K44A公司和dyn^重量有四环素和无四环素的细胞生长。戴恩^K44A公司(A类)和dyn^重量(B类)细胞与(开放的圆圈)和没有(实心圆圈)四环素治疗2天。然后将细胞转移到无血清的Hepes培养基（无未标记的亮氨酸）中，并增加毒素浓度。3小时后，按照材料和方法中的描述测量蛋白质合成。该图显示了一个代表性实验重复次数之间的平均值。

在一些实验中，使用了在氯氰菊酯依赖性内吞中具有温度敏感性缺陷的HeLa细胞。在这些细胞中，dynamin的温度敏感突变体dyn的表达^G273D型，与果蝇属西比尔^ts1号机组等位基因(21)也受四环素的调节。为了诱导突变表达，将细胞在30°C（允许温度）下培养3天，不含四环素。以前的研究表明，细胞转移到38°C（非允许温度）后30分钟，转铁蛋白内吞被抑制，而HRP的液相内吞已恢复到控制水平(11). 在我们的实验中，我们孵化了dyn^G273D型细胞在38°C下放置1小时，然后添加蓖麻毒素，使蓖麻毒素内吞恢复。与毒素孵育3小时后，测定蛋白质合成。此外，表达对温度敏感的动态蛋白突变体dyn的细胞^G273D型与含有内源性动力蛋白的细胞相比，对蓖麻毒素的抗性更强（未显示）。

蓖麻毒素从质膜运输到高尔基体对中毒很重要，因为brefeldin A破坏高尔基体可在许多细胞系中对蓖麻毒素提供完全保护(58). 因此，我们想知道布雷菲尔丁A是否也能保护表达dyn的HeLa细胞^K44A公司防止醉酒。在本实验中，将蓖麻毒素添加到brefeldin A预处理（2μg/ml）的HeLa细胞中，添加和不添加突变动态蛋白，并在3小时后测量蛋白质合成。在这两种情况下，brefeldin A都能完全保护细胞免受蓖麻毒素的侵害（数据未显示），这表明这些细胞中通过氯氰菊酯非依赖性途径内化的蓖麻毒素必须通过高尔基体运输，才能使细胞中毒。

丁酸和TSA增强Dyn的作用^K44A公司蓖麻毒素的细胞毒性

我们已经证明，丁酸增加了A431细胞对蓖麻毒素的敏感性，而不影响结合和内吞作用(59). 因此，我们决定研究丁酸是否也能敏化HeLa细胞，以及这对dyn的蓖麻毒素抗性有何影响^K44A公司细胞。为了首先检查丁酸在未诱导细胞中的作用，dyn^K44A公司用四环素在丁酸（0.5–2 mM）浓度增加的情况下培养细胞24和48小时。然后添加浓度增加的蓖麻毒素，并测定其对蛋白质合成的影响。结果表明，用2 mM丁酸预处理24小时可使HeLa细胞对蓖麻毒素敏感，而不会显著影响蛋白质合成或细胞生长（数据未显示）。非传导dyn^K44A公司和dyn^重量在这些条件下处理的细胞对蓖麻毒素的敏感性大约是未处理细胞的五倍（对比图。​图6，6,A类和B类，图。​图5，5,A类和B类,开放的圆圈). 细胞过度表达dyn^K44A公司与表达内源性dynamin的细胞相比，对蓖麻毒素的抵抗力更强（未诱导dynamin^K44A公司和dyn^重量细胞）或过度表达野生型dynamin的细胞（诱导dyn^重量单元格）（图。​（图6，6,A类和B类). 用丁酸预处理也增加了诱导和未诱导dyn之间蓖麻毒素敏感性的差异^K44A公司电池（图。​（图66 A类). dyn的表达^K44A公司在不存在丁酸的情况下，导致对蓖麻毒素的抗性增加约三倍（图。​（图55 A类)，而dyn^K44A公司在丁酸存在下的表达导致抗性增加约10倍（图。​（图66 A类). 同样，dyn没有观察到任何差异^重量用或不用四环素培养的细胞（图。​（图66 B类). 此外，如图。​图66 C类，蓖麻毒素在未诱导的dyn中内化^K44A公司在感应和非感应动态中^重量用丁酸预处理的细胞比蓖麻毒素在诱导dyn中内化的时间短，蛋白质合成减少^K44A型细胞。最后，对照实验表明，丁酸的存在并不影响通过dyn的过度表达抑制氯氰菊酯依赖的转铁蛋白内吞的程度^K44A公司（图。​（图66 D类).

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图6

丁酸增强了具有内源性动态蛋白和突变动态蛋白的细胞之间蓖麻毒素毒性的差异，但不影响dyn对氯氰菊酯依赖性内吞作用的抑制^K44A公司过度表达。戴恩^K44A公司(A类)和dyn^重量(B类)细胞生长(开放的圆圈)和没有(实心圆圈)四环素培养2天，与丁酸（2 mM）培养1天，在无血清的Hepes培养基（无未标记的亮氨酸）中增加蓖麻毒素浓度。如材料和方法中所述，在3小时后测量蛋白质合成。图中显示了一个具有代表性的实验。在C类，动态^K44A公司(开放和填充圆)和dyn^重量(开放三角形和填充三角形)细胞生长(打开的符号)和没有(封闭符号)四环素和丁酸（2 mM）与蓖麻毒素（2μg/ml）在Hepes培养基（无未标记的亮氨酸）中孵育1d，孵育时间为指定时间段。然后按照材料和方法中的说明测量蛋白质合成。该图显示了一个代表性实验重复次数之间的平均值。最后，在D类，动态^K44A公司如前所述，用四环素或不使用四环素和丁酸培养的细胞与¹²⁵I-转铁蛋白在Hepes培养基中放置5分钟。然后按照材料和方法中的描述测量内吞转铁蛋白。条形图表示平均值+SD(n个= 3).

糖脂合成对于丁酸诱导的A431细胞对志贺毒素的敏感性似乎很重要，因为几种鞘糖脂合成抑制剂，如糖基神经酰胺合成酶抑制剂苏氨酸-1-苯基-2-癸酰氨基-3-吗啉-1-丙醇（PDMP）（1μM），可防止A431细胞对志贺毒素敏感(60). 同样，PDMP也能防止丁酸诱导HeLa细胞对志贺毒素的致敏（数据未显示）。然而，PDMP并没有抵消丁酸对蓖麻毒素致敏细胞的能力，这表明不需要形成新的糖脂。有趣的是，TSA是一种类似丁酸的化合物，尽管以一种更特殊的方式抑制组蛋白脱乙酰酶(78)也增加了HeLa细胞对蓖麻毒素的敏感性，并增强了具有内源性动力蛋白和突变动力蛋白的细胞之间蓖麻毒素毒性的差异（图。​（图7）。7). TSA（0.1μM）对蓖麻毒素致敏的作用几乎与丁酸相同。因此，丁酸很可能通过抑制组蛋白去乙酰化酶发挥敏化作用。

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图7

TSA对含有内源性动力蛋白和突变动力蛋白的细胞中蓖麻毒素毒性的影响。戴恩^K44A公司细胞生长(打开的符号)和没有(闭合符号)四环素(TET公司)2天，或用丁酸(文学学士。)如图所示，在无血清的Hepes培养基（无未标记亮氨酸）中，随着蓖麻毒素浓度的增加，将（2 mM）或TSA（0.1μM）培养1d。如材料和方法所述，3小时后测量蛋白质合成。该图显示了一个具有代表性的实验的重复之间的平均值。

众所周知，微管在体外结合并刺激动力蛋白的GTPase活性(62,63). 虽然这种相互作用在体内的意义尚不清楚，但dyn可能是^K44A公司对dynamin与微管的相互作用有影响。然而，我们发现用诺卡唑（33μM）（一种微管干扰物）预处理丁酸处理的细胞(51)，没有改变dyn中蓖麻毒素敏感性的差异^K44A公司单元格（未显示数据）。因此，动力蛋白-微管相互作用的干扰不太可能是导致毒性差异的原因。

丁酸和TSA对Dyn过表达的影响^重量和Dyn^K44A公司

众所周知，丁酸通过抑制组蛋白脱乙酰化酶来增加组蛋白乙酰化(8)组蛋白乙酰化的拟议作用之一是减少组蛋白/DNA的相互作用，从而增加转录因子对DNA的可及性(34). 丁酸通常用于增加巨细胞病毒（CMV）启动子驱动的载体转染细胞的表达(45,46,73).因此，我们决定通过Western blot分析研究丁酸处理是否增加了pUHD10-3质粒中受最小CMV启动子控制的dynamin的表达。从dyn的生长培养基中去除四环素后，突变体dynamin相对于内源性dynamin明显过度表达^K44A公司细胞（10个和我们未发表的结果）。此外，丁酸增加了这两个突变体的本已高表达（图。​（图8）8)和野生型dynamin（未显示数据）。为了研究组蛋白乙酰化参与丁酸诱导的动态蛋白过度表达的可能性，我们研究了一种更特异的组蛋白脱乙酰化酶抑制剂TSA的作用(78). 如图所示。​图8，8TSA也刺激突变体dynamin的过度表达。Western blot定量显示，用丁酸或TSA治疗后，表达水平增加了三到四倍。此外，当这两种化合物被添加在一起时，其表达没有比单独添加化合物时增强（图。​（图8），8)表明TSA和丁酸调节共同的机制。突变体dynamin的表达增加可能解释dyn的增强效应^K44A公司用丁酸和TSA观察蓖麻毒素中毒。

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图8

丁酸和TSA对突变体dynamin过度表达的影响。戴恩^K44A公司无四环素培养2d的细胞以及有无丁酸(文学学士。)（2 mM）、TSA（1μM）或两者均用PBS洗涤1天，并用巯基乙醇在样品缓冲液中裂解。将裂解液置于7.5%的凝胶上，制备Western blot，并按照材料和方法中的描述对数据进行分析。

Dyn强烈抑制改性蓖麻蛋白的硫酸化^K44A公司过度表达

dyn的超微结构分析^K44A公司在四环素存在下生长并与蓖麻毒素HRP孵育1h的细胞显示，高尔基体（假定的TGN）的标记在所有细胞剖面中都常见（图。​（图2）。2). 然而，去除四环素后，没有检测到这种高尔基体标记（图。​（图3），三)这表明动态蛋白突变体的过度表达抑制了蓖麻毒素向高尔基体的转运。为了进一步分析这一概念，我们使用了一种可以硫酸化的改良蓖麻毒素作为运输到TGN的探针。蛋白质硫酸化是一种反式-高尔基体修饰主要存在于分泌蛋白中(三,27–30). 考虑到[³⁵S] 蛋白质的硫酸标记已被证明对研究硫酸化分子的分泌很有用，Leitinger等人(35)决定使用这种方法，通过向这些蛋白质中添加大鼠胆囊收缩素前体的COOH末端九肽（一种可以硫酸化的酪氨酸肽）来研究非天然硫酸化蛋白质的分泌。Rapak等人使用了这种方法(48)生成蓖麻毒素A-sulf-1，一种可以硫酸化的蓖麻毒素分子。在这种情况下，酪氨酸硫酸化信号被添加到蓖麻毒素A链的COOH末端。此外，通过在蓖麻毒素a-sulf-1的COOH末端添加一个包含三个部分重叠的N-糖基化位点的九肽，制备了第二个修饰蓖麻毒素，即蓖麻毒素a-sulf-2。这两种结构都被用于研究蓖麻毒素向TGN（硫酸化位点）和内质网（糖基化位点）的逆行转运(48).

研究dyn过度表达导致蓖麻毒素贩运的变化^K44A公司研究了蓖麻毒素A-sulf-1的硫酸化和蓖麻毒素A-sulf-2的硫酸化及糖基化。当动态^K44A型使用和不使用四环素生长的细胞与钠孵育₂ ³⁵SO公司₄和重组蓖麻毒素A-sulf-1，蓖麻毒素A链的硫酸化在过度表达dyn的细胞中受到强烈抑制^K44A公司突变体（图。​（图99 B类). 当用丁酸处理细胞时，也得到了类似的结果（图。​（图99 B类). 在这种情况下，四环素存在下蓖麻毒素的标记更强，这与我们之前的发现一致，即丁酸处理可以提高蓖麻毒素中毒的效率(59). 此外，诱导细胞和未诱导细胞之间的硫酸化程度差异大于非丁酸处理细胞。通过密度测定法在放射自显影图中定量硫酸化蓖麻毒素，结果表明硫酸化的差异与毒性的差异相对应。在表达dyn的细胞中，未观察到内源性蛋白的硫酸化程度受到抑制^K44A公司通过免疫沉淀法去除蓖麻毒素（和硫酸化蓖麻毒素）的细胞裂解液中TCA沉淀蛋白的SDS-PAGE对此进行了研究。因此，在过表达突变动力蛋白的细胞中抑制蓖麻毒素硫酸化并不是由于硫酸化的普遍缺陷。由于蓖麻毒素本身抑制蛋白质合成，因此也在存在蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（10μg/ml）的情况下进行硫酸化实验，以研究硫酸化的差异是否取决于蛋白质合成。然而，环己酰亚胺的存在并没有改变结果。当动态^重量使用了细胞，在有和没有四环素生长的细胞之间没有观察到蓖麻毒素硫酸化的差异（图。​（图99 A类). 在过度表达dyn的细胞中发现的硫酸化蓖麻毒素含量较低^K44A公司不是由于硫酸化蓖麻毒素培养基分泌增加。这是通过从培养基中免疫沉淀蓖麻毒素来研究的。同样，分泌[³⁵S] 蛋氨酸标记蛋白不受dynamin突变体过度表达的影响（数据未显示）。

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图9

蓖麻毒素A-sulf-1和蓖麻毒素A-sulf-2的硫酸化。戴恩^重量(A类)和dyn^K44A公司(A类和B类)细胞在有四环素和无四环素的情况下生长(TET公司)持续2天，带(A类和B类)和没有(B类)丁酸(文学学士。)（2 mM），如所示持续1d。然后用不含硫酸盐的DME清洗细胞，并用Na培养³⁵SO公司₄（100μCi/ml）4小时。然后，重组蓖麻毒素硫-1(A类和B类)或蓖麻毒素亚磺基-2(B类)添加，并继续培养3-4小时。培养期间存在丁酸和四环素。在37°C的PBS中用0.1 M乳糖溶液清洗细胞，然后用冷PBS进行溶解。通过离心去除细胞核，并在4°C下与固定在CNBr–Sepharose 4B上的兔抗蓖麻毒素抗体孵育3 h，以免疫沉淀上清液。最后，在还原条件下用SDS-PAGE（12%）分析吸附材料，并对凝胶进行放射自显影。

为了研究蓖麻毒素向高尔基体和内质网的转运，我们研究了蓖麻毒素sulf-2在细胞中的修饰，包括突变体dynamin的过表达和不表达。当将蓖麻毒素硫-2添加到细胞中时，在蓖麻毒素免疫沉淀和SDS-PAGE后，可以看到三条带（图。​（图99 B类). 分子量最高的条带代表硫酸化和糖基化蓖麻毒素，因为早先已经表明，用糖基化抑制剂突尼斯霉素预处理几个细胞系后，该条带消失(48). 还可以观察到一条代表硫酸化蓖麻毒素的带（中间带）。在其他细胞系中未观察到分子量最低的条带(48)可能是一种降解产物。正如预期的那样，在表达dyn的细胞中，条带非常微弱^K44A型.

我们要感谢Tove Lie Berle（挪威镭医院）、Kirsten Pedersen（丹麦Panum研究所）和Mette Ohlsen（Panum研究院）提供的专家技术援助，以及Frederik Vilhardt帮助我们开展免疫荧光工作。

这项工作得到了挪威科学与人文研究理事会（NAVF）、挪威癌症协会、丹麦癌症协会、挪威医学研究理事会、Novo-Nordisk基金会、Blix遗产、Torsteds遗产、Odd Fellow、Jahre基金会、北欧癌症联盟、，一项北约合作研究拨款（CRG 900517）和一项人类前沿科学计划拨款（RG404/96M）。