星形胶质细胞培养中的小胶质细胞：注意事项

摘要

审查

在过去的几十年里，我们对星形胶质细胞功能潜能的认识并没有停止增长。星形胶质细胞现在被认为是中枢神经系统基本功能（如能量代谢）的重要参与者[1]、神经传递[2]、维持血脑屏障[三]，细胞外离子稳态[4]或脑血管调节[5]它们在神经炎症中也起着关键作用[6]或修理[7]. 这些知识大多是通过体外研究获得的。虽然存在星形胶质细胞系，如大鼠C6或人类U373，但原代培养是目前体外研究星形胶质细胞生物学最常用的模型。关于术语的注释：严格来说，原代培养物是指那些从组织中分离出来后直接通过电镀细胞制备的培养物。当一种初级文化被继代培养时，我们获得二级文化、三级文化等。在本综述中，“初级文化”一词用得不太严格，也包括亚文化，除了在附加文件中1其中“初级”是指没有亚文化。

富含星形胶质细胞的原代培养物易于制备、重复性好、用途广泛，几乎可以从任何中枢神经系统区域获得。大多数实验室从小鼠和大鼠制备富含星形胶质细胞的培养物，但人类原代富含星形胶质的培养物也很常见，而其他种类的培养物则很少使用。富含星形胶质细胞的原代培养物可以从任何年龄的生物体中制备，包括胚胎、胎儿、新生儿、年轻、成年和老年生物体。就产量和纯度而言，最佳年龄是在天体形成高峰期；这发生在神经发生高峰之后，少突胶质细胞发生高峰之前。在小鼠和大鼠中，大脑皮层和大多数中枢神经系统区域的最佳窗口时间跨度为产前2-3天到出生后2-3天[8]但小脑不适用于出生后第4天到第7天[9].

从大鼠/小鼠晚期胚胎/新生儿中制备富含星形胶质细胞的培养物的大多数方案源自Booher和Sensenbrenner的开创性工作[10]或麦卡锡和德维利斯后来的修改[11]. 一种完全不同的方法，这里没有讨论，是培养急性分离的星形胶质细胞[12,13]. 然而，星形胶质细胞能够在多种体外条件下生长，几乎每个实验室都创建了自己或多或少的修改方案（参见其他文件1). 在大多数这些方案中，解剖的组织通过机械和/或酶消化分离，分离的细胞被电镀。如果使用足够的平板密度、平板涂层、培养基成分和培养基更换制度，星形胶质细胞迅速增殖，通常在平板后7-14天获得融合培养物。在这些培养物中，I型星形胶质细胞与可变数量的II型星形胶质胶质细胞形成单层。由于星形胶质细胞构成了这些制剂中最丰富的细胞类型，它们通常被描述为星形胶质细胞、富含星形胶质细胞的、富含星形神经胶质的甚至纯星形胶质细胞培养物。然而，在这些制剂中，星形胶质细胞并不代表100%的细胞。根据培养条件，少突胶质细胞[11,14]，神经元[15]，各种类型的前体[16,17]室管膜细胞[14,17]，成纤维细胞[18-20]、内皮细胞[20,17,21]或小胶质细胞[17,22]可以在这些文化中出现，通常比例很小。

这篇综述的目的是引起人们对星形胶质细胞培养中小胶质细胞的关注。在我看来，小胶质细胞在星形胶质细胞培养中的比例和作用常常被低估。这种低估的一个可能解释是历史性的。当建立第一个星形胶质细胞培养方案时，体外没有良好的小胶质细胞标记物。因此，小胶质细胞是否存在于星形胶质细胞培养物中以及以何种比例存在的问题在该领域的经典论文中没有得到解决[10,11,14]. 这些出版物被许多团体用作指南，这可以部分解释为什么当体外培养的小胶质细胞的良好标记物可用时，小胶质细胞仍然存在。星形胶质细胞培养物中的小胶质细胞有时被忽视的另一个原因与胶质纤维酸性蛋白（GFAP）免疫染色后获得的图像有关，这是迄今为止最常用的估计星形胶质细胞在这些培养物中比例的方法。由于星形胶质细胞形成一个融合的单层，GFAP免疫染色产生的图像中几乎整个培养区域都被星形胶质细胞覆盖，给人一种错觉，认为没有太多的空间容纳其他细胞（图​（图1）。1). 作者可能会得出结论，由于没有GFAP自由空间，非星形胶质细胞的比例必须最小，并且认为没有必要进一步研究来确定非胶质细胞类型的比例。然而，现实情况是，非星形胶质细胞可以存在于星形胶质细胞单层的上方和下方，并且应该使用特定标记来估计这些污染细胞群的比例。

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图1

A） 融合小鼠初级皮质混合胶质培养物的相位对比图。观察到I型星形胶质细胞单层，其中有一些小胶质细胞。这张图片可能表明这是一种几乎纯粹的星形胶质细胞文化。B） A中相同区域的GFAP免疫染色似乎证实了这种印象。很难统计有多少星形胶质细胞在该领域，但由于整个领域都被星形胶质细胞覆盖，人们可能会得出结论，这实际上是一种几乎纯的星形胶质细胞培养物。C） 小胶质标记物CD11b的免疫染色显示，该区域存在大量（20）个小胶质细胞。这些主要不是通常通过摇晃恢复的、位于星形胶质细胞顶部的圆形折射小胶质细胞。相反，这些是更多的分支细胞，与井底、星形胶质细胞之间或下方直接接触。D） Hoechst染色可以轻松量化培养物中的细胞总数。在这个领域有109个细胞，小胶质细胞占18%。Hoechst 33258染色还揭示了星形胶质细胞和小胶质细胞的不同核形态。棒材，100μm

星形胶质细胞和小胶质细胞体外产生NO

关于富含星形胶质细胞的培养物产生NO的大量文献，尤其是关于培养物LPS激活的文献。大多数报告通过测量培养基中释放的NO的积累来分析NO的产生，许多报告认为这种NO的产生是星形胶质细胞的。然而，对文献的回顾表明，在许多研究中，这种假设是不正确的。NO可由NO合成酶1、2和3（NOS1、NOS2和NOS3，分别称为cNOS、iNOS和eNOS）产生，这些酶可由星形胶质细胞表达[23]. NOS2抑制剂1400W消除LPS诱导的鼠胶质细胞培养物中NO生成[24]这表明在这些实验条件下，NOS1或NOS3亚型产生的NO可以忽略不计。因此，确定LPS激活的原代胶质细胞培养物中产生NO的细胞类型的一个合理方法是鉴定NOS2表达细胞。表​表11总结了所有研究，据我所知，这些研究解决了LPS激活的啮齿动物星形胶质细胞富集培养物或混合胶质细胞培养物中表达NOS2的细胞类型的问题。从这些数据可以清楚地看出，在这些细胞制剂中，LPS诱导小胶质细胞中NOS2的表达，因为在每项研究（n=10）中都观察到NOS2与小胶质细胞标记物的共定位。LPS也诱导培养的啮齿动物星形胶质细胞中NOS2表达的证据当然较弱。在大多数研究中（16项研究中有10项），作者未能通过NOS2-GFAP双重标记观察到任何NOS2阳性星形胶质细胞。在报告LPS处理的啮齿动物培养物中存在NOS2阳性星形胶质细胞的研究中，最令人信服的图像可能是在Hamby等人[25,26]. 有趣的是，该小组发现LPS激活后NOS2阳性星形胶质细胞的数量极低，并且在LPS+干扰素-γ（IFNγ）激活后，尤其是在LPS+IFNγ+转化生长因子β1（TGFβ1）激活后增加[25]. 这表明NOS2在活化的星形胶质细胞和小胶质细胞中的表达依赖于活化刺激。Von Bernhardi等人[27]确实显示NOS2阳性星形胶质细胞，但NOS2在小胶质细胞中表达较强。在脊髓星形胶质细胞培养的这一系列研究中，也观察到NOS2阳性星形胶质细胞[28]提示活化星形胶质细胞表达NOS2的能力可能存在区域异质性。最后，一些报告通过GFAP染色鉴定NOS2阳性细胞为星形胶质细胞，尽管这些细胞在体外具有小胶质细胞的形态[29,30]. 根据我的经验，用LPS（1μg/ml）和IFNγ（0.5 ng/ml）对小鼠原代混合胶质细胞培养物进行24小时的治疗，可在许多细胞中产生细胞内NOS2免疫反应。NOS2与GFAP或CD11b的双重标记显示，绝大多数NOS2免疫反应细胞是小胶质细胞，如CD11b免疫反应所鉴定的（图​（图2）。2). 不到2%的NOS2阳性细胞为CD11b-阴性，不到1%的NOS2-阳性细胞为GFAP阳性。

表1

LPS激活的小鼠/大鼠星形胶质细胞富集/混合胶质细胞培养物中的星形胶质细胞和小胶质细胞NOS2免疫反应性。据我所知，该表总结了所有研究，这些研究解决了LPS激活的啮齿动物星形胶质细胞富集培养物或混合胶质细胞培养物中表达NOS2的细胞类型的问题。本表不包括使用LPS以外的激活刺激物的研究或人类神经胶质培养物的研究。描述在LPS处理的星形胶质细胞富集培养物中存在NADPH黄递酶的报告（例如[77]）也不包括在内，因为NOS2只是表现出NADPH黄递酶活性的许多脑酶之一[78]。

裁判.	品种-年龄-地区	[LPS]微克/毫升	辅活化剂	LPS后的时间	星形胶质细胞中的存在*	小胶质细胞中的存在（标记物）	笔记	双重标记法**
[29]图4	小鼠新生儿全脑	1	-	-	是（？）	是（Mac1）	“GFAP/NOS2阳性细胞数量低”。NOS2（+）细胞具有小胶质细胞形态，GFAP染色不清晰	DAB-Ni和DAB
[68]图2	大鼠脑皮层	100	-	24小时	不	-	NOS2（+）细胞具有小胶质细胞外观，但未进行双重标记	国际单项体育联合会
[69]图1	大鼠脑皮层	1	-	24小时	不	是（异凝集素-B4）		国际单项体育联合会
[70]图1	Rat-Neonatal-前脑	1	-	12小时、24小时、48小时	不	-	NOS2（+）细胞具有小胶质细胞外观，但没有进行NOS2/小胶质细胞双重标记	DAB和AP
[71]图3	大鼠脑皮层	2	干扰素γ（100 U/ml）	18小时	不	是（OX-42）		国际单项体育联合会
[72]图2	大鼠新生皮质	2	干扰素γ（100 U/ml）	18小时	不	是（OX-42）		国际单项体育联合会
[73]图3	大鼠脑皮层	2	干扰素γ（100 U/ml）	18小时	-	是（OX-42）	“所有NOS2（+）细胞均为OX-42（+）”	国际单项体育联合会
[74]图2	大鼠脑皮层	2	干扰素γ（100 U/ml）	18小时	不	-		国际单项体育联合会
[39]图2,3,5	大鼠新生皮质	10	-	48小时	不	是（OX-42）		国际单项体育联合会
[30]图3	鼠-新生代-新大脑皮层	0,025	干扰素γ（100 U/ml）	24小时	是（？）	-	一些双GFAP-NOS2（+）细胞看起来不像星形胶质细胞	国际单项体育联合会
[75]图5	大鼠脑皮层	1	干扰素（100 U/ml）	48小时	不	是（异凝集素-B4）		国际单项体育联合会
[28]图1	Rat-Neonatal-Spinal脊髓	1	-	24小时	是的	-	双GFAP-NOS2（+）细胞。未进行NOS2-小胶质双重染色，因为“这些培养物没有OX42阳性细胞”	国际单项体育联合会
[76]图3	大鼠脑皮层	0,1	-	24小时	不	是（OX-42）	“所有NOS2（+）细胞均为OX-42（+）”	国际单项体育联合会
[27]图2	大鼠新生皮质	1	干扰素γ（10纳克/毫升）	14小时	是的	是（异凝集素-B4）	“小胶质细胞的NOS2染色比星形胶质细胞强得多”	国际单项体育联合会
[24]图6	小鼠新生皮质	1	{“类型”：“entrez-protein”，“属性”：{“文本”：“CGS21680”，“term_id”：“878113053”，“term_text”：“CGS21680”}}CGS21680（100毫微米）	48小时	不	是（番茄凝集素）		国际单项体育联合会
[26]图6	新生鼠皮层	2	干扰素γ（3纳克/毫升）	24小时	是的	-	双GFAP-NOS2（+）细胞	国际单项体育联合会
[25]图8	新生鼠皮层	2	干扰素γ（3 ng/ml）和转化生长因子β1（3 ng/ml）	14小时	是的	-	双GFAP-NOS2（+）细胞。LPS后NOS2（+）星形胶质细胞的数量很低，但TGFβ1+LPS+IFNγ处理后的数量较高	国际单项体育联合会

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*GFAP是所有研究中使用的星形胶质细胞标记物

**DAB：二氨基联苯胺，DAB-Ni：DAB-Nickel；AP：碱性磷酸酶；IF：免疫荧光

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图2

用LPS（1μg/ml）和IFNγ（0.5 ng/ml）处理小鼠原代皮层混合胶质细胞培养物24小时，并对NOS2（A，B）、GFAP（C）或CD11b（D）进行免疫染色。A和C显示相同的字段，E是它们的合并图像。B和D显示相同的字段，F是它们的合并图像。在对照培养物中未观察到NOS2免疫反应细胞（数据未显示）。许多细胞（A、B）中存在（LPS+IFNγ）诱导的NOS2表达。NOS2阳性细胞几乎没有GFAP免疫反应（A、C、E），表明大多数星形胶质细胞中NOS2缺乏表达。相反，几乎所有NOS2阳性细胞（>98%）通过CD11b免疫反应鉴定为小胶质细胞。用Hoechst 33258对A-D的细胞核进行复染。用兔抗NOS2抗体（1:500，BD Biosciences）鉴定NOS2阳性细胞，用小鼠抗GFAP抗体鉴定GFAP阳性细胞（1:1000，Sigma），用5C6小鼠抗CD11b抗体鉴定CD11b阳性细胞（1:400，Serotec）。棒材，100μm。

啮齿动物星形胶质细胞在体外肯定能够表达NOS2[31,32]和体内[23]人类星形胶质细胞产生NO也是一个已证实的观察结果[33,34]. 然而，这些结果表明，在LPS或LPS+IFNγ激活啮齿动物星形胶质细胞富集/混合培养物后，小胶质细胞中强烈表达NOS2，而如果不是完全缺失，则星形胶质细胞中NOS2的表达弱于小胶质细胞。与此相一致的是，LPS在高度富集的星形胶质细胞培养物（几乎没有小胶质细胞）中诱导的NO生成几乎无法通过Griess反应进行测量，而相同的方法显示，在小胶质细胞培养或混合胶质细胞培养中，NO生成强劲[25,35-41]. 这些数据表明，LPS诱导的啮齿动物初级皮层星形胶质细胞培养物中NO的产生主要是由“污染”小胶质细胞产生的，而不是通常假设的星形胶质细胞产生。

关于确定载脂蛋白E（apoE）产生来源细胞的研究也存在类似的担忧。在中枢神经系统中，apoE似乎是由胶质细胞（主要是星形胶质细胞）在体内产生的。啮齿动物皮层原代混合神经胶质培养物产生并释放apoE[40,42-45]. 由于体内数据以及星形胶质细胞是这些培养物中的主要细胞类型，人们可能推断这些细胞制剂中apoE的产生基本上是星形胶质细胞起源。然而，高度富集的星形胶质细胞培养物不产生或释放apoE，而高度富集的小胶质细胞培养液则产生或释放[40]啮齿动物混合胶质细胞培养物中apoE免疫反应与小胶质细胞共存，而与星形胶质细胞标记物无关[46]. 因此，apoE是另一个例子，表明小胶质细胞尽管不是最丰富的细胞类型，但可以在富含星形胶质细胞/混合胶质细胞培养物中进行观察。

每年都有大量研究发表，使用富含星形胶质细胞的培养物来描述各种分子的表达，例如细胞因子、趋化因子、粘附分子。大多数研究通过缺乏细胞分辨率的方法（PCR、Western blot、ELISA等）来鉴定这种表达，许多研究假设星形胶质细胞是引起观察到的效应的细胞类型。NOS2和apoE的例子表明，这种假设有时可能是不正确的，并表明当使用富含星形胶质细胞/混合胶质细胞培养物时，估算小胶质细胞比例是多么重要。

星形胶质细胞培养中的小胶质细胞：如何估计和影响其比例

很少确定星形胶质细胞培养物中小胶质细胞的比例（例如，参见附加文件1)但事实上，这样的决定很容易。用特定标记物、抗体或凝集素对固定培养物中的小胶质细胞进行染色，结果可靠，一旦染色，小胶质细胞很容易计数。根据我的经验，识别溶酶体糖蛋白CD68的抗体ED1和识别CD11b的OX-42是良好的小胶质细胞标记物老鼠星形胶质细胞培养[47,48]而5C6抗CD11b抗体（见图​图1）1)以及番茄凝集素（番茄凝集蛋白）（见图​图3）三)是良好的小胶质细胞标记物鼠标星形胶质细胞培养[24,49]. 用于鉴定星形胶质细胞培养物中小胶质细胞的其他标记物包括抗体F4/80或抗电离钙结合适配器分子1（Iba1）和凝集素isolectin-B4、灰树凝集素（GSA）或蓖麻凝集素。小胶质细胞也可以用DiI标记的乙酰化低密度脂蛋白（DiI-Ac-LDL）标记，与上述小胶质细胞标记物不同，该标记物用于活的、不固定的培养物中。小胶质细胞（而非星形胶质细胞）内化并降解Ac-LDL，荧光探针DiI积聚在细胞膜中[22]. 该协议快速简单。估计小胶质细胞在随后用于实验的多孔板哨兵孔中的比例，以及跟踪小胶质细胞随时间的变化比例，是一个很好的策略。该方法的一个警告是内皮细胞也会吸收Ac-LDL[50].

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图3

混合胶质细胞培养中的圆形和分支小胶质细胞。用小胶质标记物番茄凝集素（棕色）染色并用苏木精（蓝色）复染的小鼠初级皮层混合胶质培养物的明亮视野图像。在这个领域，小胶质细胞的比例为13%。其中三个用箭头表示，是圆形小胶质细胞，具有强烈的凝集素染色。这些细胞很容易通过相位对比来识别，因为它们具有折射率。相反，有几个小胶质细胞具有分支形态，凝集素染色不太强烈。通过相差显微镜观察，这些细胞是无反射的。由于它们对各种小胶质标记物的染色较弱，且无反射性，因此在富含星形胶质细胞/混合胶质细胞培养物中，分支小胶质细胞的比例往往被低估。用生物素标记的番茄凝集素（1:500，Sigma）鉴定小胶质细胞。棒材，100μm。

在确定星形胶质细胞培养物中小胶质细胞的比例时，重要的是要记住，这些培养物中存在两种小胶质细胞。一方面，在星形胶质细胞单层的顶部有圆形的折射性小胶质细胞，通常称为变形虫，可以通过摇晃恢复。另一方面，在星形胶质细胞单层下方或星形胶质细胞之间存在非融合的分支小胶质细胞，可以通过温和的胰蛋白酶分离[51]. 对于许多小胶质标记物来说，折射变形虫小胶质细胞的染色比分支小胶质细胞强，这可能导致低估分支小胶质的比例（图​（图3）。三). 同样，使用相位对比显微镜来估计星形胶质细胞培养物中小胶质细胞的比例也会导致低估，因为用这种方法很容易看到折射的变形小胶质细胞，但分支小胶质细胞通常无法与周围的星形胶质细胞区分开来[52]. 在富含星形胶质细胞的培养物中，估计小胶质细胞比例的另一种显微镜方法是流式细胞术，但这种方法迄今很少使用[53].

在富含星形胶质细胞的啮齿动物培养物中，小胶质细胞的真实比例是多少？这可能在小于1%到30%之间变化，甚至更大。有几个因素对这一比例有影响。在这里，我将简要回顾在这方面可能很重要的一些参数的影响。有关星形胶质细胞培养方法学方面的综述，请参阅[54].

动物年龄

这不是一个关键因素。没有特定的年龄特别适合小胶质细胞比例低的星形胶质细胞培养。必须考虑到动物年龄确实会影响胶质细胞的激活状态，因此可能会影响GFAP等细胞标记物[55,56]. 如上所述，晚期胚胎或新生动物通常更受欢迎，因为它们的星形胶质细胞和小胶质细胞产量高于神经元。

物种

实际上缺乏小胶质细胞的大鼠皮层星形胶质细胞培养物可以通过低密度传代获得[40,39,57,18,58]. 同样的程序也用于鼠标培养（参见其他文件1)但根据我的经验，这种方法在降低小鼠小胶质细胞含量方面不如大鼠皮层星形胶质细胞培养中有效。

地区

在大多数CNS区域制备的星形胶质细胞培养物中，小胶质细胞含量可能没有重大差异。黑质是一个例外，它富含小胶质细胞。因此，中脑混合神经元/胶质细胞培养物中小胶质细胞的比例是皮层或海马培养物中的4到8倍[59]. 因此，人们预计中脑星形胶质细胞培养物中的小胶质细胞含量也会很高（除非使用适当的策略来最小化小胶质细胞的含量）。

培养基

DMEM是星形胶质细胞培养最常用的培养基；MEM或DMEM:F12也很常见（参见附加文件1). 这些基本配方的许多变体用于制备星形胶质细胞培养物，例如高糖与低糖、有无HEPES、有无谷氨酰胺或谷氨酰胺、有无碳酸氢钠。关于这些培养基组合在星形胶质细胞和小胶质细胞培养中的适用性的适当比较尚未见报道。根据我的经验，星形胶质细胞在DMEM和DMEM:F12中都生长良好。然而，与DMEM:F12星形胶质细胞培养物相比，DMEM中的小胶质细胞较少（未发表的观察结果）。

介质更改

星形胶质细胞培养物的正常代谢导致培养基中营养物质的逐渐减少。在营养缺乏的星形胶质细胞培养中，星形胶质细胞的存活时间不会超过几天。相反，小胶质细胞不仅存活良好，而且迅速增殖[60]. 因此，为了保持星形胶质细胞培养物中小胶质细胞的低含量，经常更换培养基（至少每2-3天一次）很重要。较少更换培养基，例如每周更换一次，将导致星形胶质细胞培养中的小胶质细胞比例更高。

涂层

与神经元不同，星形胶质细胞在未涂覆的塑料或玻璃表面上生长良好，但不幸的是，小胶质细胞也是如此。大多数实验室在无涂层、聚赖氨酸或聚鸟氨酸涂层的平板上制备星形胶质细胞培养物。基于层粘连蛋白有利于星形胶质细胞生长并抑制小胶质细胞生长的发现[61]我们测试了层粘连蛋白涂层对星形胶质细胞培养的影响，发现层粘连蛋白质涂层确实显著降低了星形胶质细胞中的小胶质细胞含量[24]. 其他小组在星形胶质细胞培养中独立采用层粘连蛋白涂层[62,63]. 在我们的实验室中，使用未涂层的塑料，我们可以从大鼠获得高度富集的星形胶质细胞培养物（<2%小胶质细胞），但不能从小鼠皮层获得。为了从小鼠皮层制备富含星形胶质细胞的培养物，我们通常使用层粘连蛋白涂层。

亚文化

当原代星形胶质细胞培养达到融合时，可以进行胰蛋白酶化和传代培养。该过程导致二次培养，其中小胶质细胞和其他污染细胞的比例降低[11]. 这个简单的步骤在大鼠星形胶质细胞培养中非常有效，尤其是当传代培养的密度相对较低时（<50000个细胞/cm²). 如前所述，它也被用于制备小鼠星形胶质细胞培养物（参见其他文件1)，尽管根据我的经验，这种方法在这种情况下效果较差。

摇晃

在眼眶摇床中摇晃融合的星形胶质细胞培养物2至24小时，会导致位于星形胶质细胞单层顶部的许多细胞脱落，主要是小胶质细胞、II型星形胶质细胞和前体细胞[22]. 因此，摇晃是减少星形胶质细胞培养物中小胶质细胞比例的有效方法。如前所述，并非所有小胶质细胞都位于星形胶质细胞单层的顶部。重要的是要知道，位于星形胶质细胞单层下面或之间的小胶质细胞不会因摇晃而被清除。因此，如果母代培养物中星形胶质细胞下方或中间含有少量小胶质细胞，则可以用摇动法制备高度富集的星形胶质细胞培养物。

阿糖胞苷（Ara-C）

Ara-C是一种抗有丝分裂药物，可单独使用或与其他策略联合使用，以减少星形胶质细胞培养物中小胶质细胞和其他污染细胞的存在。星形胶质细胞汇合后，必须立即将Ara-C添加到培养物中。此时，由于接触抑制，星形胶质细胞停止增殖，小胶质细胞开始快速增殖。大多数方案使用5–10μM的阿糖胞苷，治疗持续2–5天。

特异性小胶质毒素

减少星形胶质细胞培养物中小胶质细胞含量的另一种策略是使用对小胶质细胞有毒而对星形胶质细胞无毒的药物。虽然大多数实验室都没有使用，但这是一种有效的方法，可以将小胶质细胞含量保持在最低水平，尤其是与其他策略结合使用时。L-亮氨酸甲酯是一种溶酶体促生长剂，常被用于去除星形胶质细胞培养物中的小胶质细胞。朱利安和贝克首次在这方面使用[22]在5 mM下持续2小时，最近对其进行了重新评估，并在50–75 mM下连续60-90分钟获得了强烈的小胶质细胞耗竭，而没有星形胶质细胞“副作用”[26]. 使用频率低得多的是氯膦酸盐，一种已知会耗尽单核细胞谱系细胞的二膦酸盐[64]临床上用于骨质疏松症的治疗。这种药物显著降低海马器官型培养物中的小胶质细胞含量[65]因此在星形胶质细胞培养中也可能有用，但据我所知，它还没有在这方面进行过测试。

其他

还存在一些策略，旨在通过减少非小胶质细胞污染细胞的比例来提高星形胶质细胞培养物的纯度，例如用山梨醇替代葡萄糖[14]减少少突胶质细胞和室管膜细胞的数量，或D-缬氨酸的使用[18]在抑制成纤维细胞和脑膜细胞生长的培养基中。对这些方法的详细描述超出了本综述的范围，本综述的重点是小胶质细胞在富含星形胶质细胞的培养物中的存在和作用。最后，重要的是要记住，诸如血清来源或培养板中使用的塑料类型等因素可能会影响星形胶质细胞培养的结果，也可能影响小胶质细胞的数量。

总之，小胶质细胞的比例可以在星形胶质细胞培养物中确定，并且存在有助于降低这些比例的策略。

结论

几位作者曾指出，在声称纯星形胶质细胞培养物时必须谨慎[22,26,52]必须注意小胶质细胞在这些培养物中的存在[66,67]. 虽然确实有一些团体使用适当的方法来估计和最小化小胶质细胞的比例，但这些说法往往被忽视。我认为，作者、审稿人和编辑有必要意识到这个问题，以减少忽视星形胶质细胞富集培养物中小胶质细胞存在的出版物数量，尤其是那些归因于污染细胞，尤其是小胶质细胞所起的星形胶质细胞作用的出版物数量。下面列出了实现这一目标的一些建议：

1.富含星形胶质细胞的培养物中的小胶质细胞应始终通过特定标记物进行鉴定，并应进行计数，论文中包括的小胶质比例以及星形胶质细胞比例，如果可能，还应包括其他污染细胞类型的比例。

2.对高富集星形胶质细胞培养物感兴趣的人应使用适当的方案来减少小胶质细胞的比例，例如层粘连蛋白涂层、摇晃、低密度继代培养、L-亮氨酸甲酯、频繁更换培养基。然而，在许多情况下，星形胶质细胞培养物中存在小胶质细胞是可取的，因为它允许星形胶质细胞与小胶质细胞的相互作用，而这种作用在胶质细胞激活中极为重要。重点是要意识到小胶质细胞存在于这些培养物中，并能够区分由星形胶质细胞引起的观察到的效应、由小胶质细胞引起的效应、由两种细胞类型的组合引起的效应以及由两者都不引起的效应。

3.术语“纯星形胶质细胞培养物”可能是一个矛盾修饰语，应该尽可能少地使用。对于>99%的星形胶质细胞，我建议使用术语“高度富集的星形胶质培养物”，对于>90%（理想情况下，>95%）的星形胶质胶质细胞，使用术语“富含星形胶质细胞培养物”。当小胶质细胞>10%时，术语“混合胶质细胞培养”可能更合适。

4.应使用高分辨率技术（例如免疫细胞化学、原位杂交）明确地将观察到的效应归因于星形胶质细胞培养中的特定细胞类型。在这方面，使用富含星形胶质细胞和小胶质细胞的培养物也有帮助。如果这些方法都不可行，那么这个问题就应该留有待解决，例如，“LPS诱导富含星形胶质细胞的培养物中X的增加”，这是一个真实的观察结果，而不是“LPS导致星形胶质细胞中X的升高”，这可能是一个错误的推论/误解。

缩写

载脂蛋白E

Ara-C，阿糖胞苷

DiI-Ac-LDL，DiI标记乙酰化低密度脂蛋白

胶质纤维酸性蛋白

GSA，灰树花凝集素

Iba1，电离钙结合适配器分子1

干扰素γ、干扰素-γ

脂多糖

NOS2，NO合成酶2

RCA，蓖麻凝集素

转化生长因子β1

竞争性利益

提交人声明他们没有相互竞争的利益。

补充材料

致谢

工具书类