表皮基底膜正常发育需要α3β1整合素

小鼠PCR基因分型

从杂合子小鼠交配中收集胚胎或新生儿后代，以检测α3整合素基因的无突变(Kreidberg等人，1996年)，将其尾部去除并在56℃下在0.2%SDS、100 mM Tris、pH 6.8、200 mM NaCl、5 mM EDTA和0.1 mg/ml蛋白酶K中消化过夜。用异丙醇沉淀DNA，将其溶解在50μl–100μl的10 mM Tri（pH 7.5）和0.1 mM EDTA中。使用1μl模板DNA和以下寡核苷酸引物进行PCR分析：野生型引物（来自α3基因）：5′-CCGTCATTCATGAACC-3′；α3-敲除引物（新粘菌素耐药基因）：5′-GGGGAACTTCTGACTAG-3′；常见引物（α3基因）：5′-GGAATCCCCTGGTTGATGTC。PCR反应条件为：94℃变性30s；在55°C下延伸40 s；并在72°C下退火30 s。进行了30次放大循环。野生型和普通引物从野生型α3基因中扩增出130-bp片段；α3敲除引物和普通引物从目标等位基因中扩增出285-bp片段。扩增的PCR产物通过1.5%琼脂糖凝胶上的电泳分离，并通过溴化乙锭染色进行可视化。

冰冻切片的制备和免疫荧光

用一氧化碳处死新生小鼠后，将其肢体切除₂麻醉，然后包埋并冷冻在O.C.T.化合物中，并储存在−80°C下。在分娩后第11.5天、第15.5天或第17.5天通过剖腹产收集胚胎，并如上所述嵌入四肢或躯干皮肤或整个胚胎（第11.5和15.5天）。8μm切片在Reichert-Jung低温恒温器（型号2800 Frigocut-E）上切割，并用苏木精和伊红染色或制备免疫荧光。对于免疫荧光，冰冻切片在PBS和0.9 mM CaCl中水合₂和0.5 mM氯化镁₂（PBS/Ca²⁺镁²⁺)5分钟。由于抗EIIIB血清对纤维连接蛋白的识别被N-连接的低聚糖抑制，用抗EIIIB染色的切片在37°C下用N-聚糖酶（PNGase F，新英格兰生物实验室如前所述，在制造商提供的反应缓冲液中，以50000 U/ml的速率(彼得斯和海恩斯，1996年). 切片在3.7%甲醛中固定10分钟，然后在封闭缓冲液中培养（0.1%BSA，0.2%Triton X-100，0.1%PBS/Ca中的甘氨酸²⁺镁²⁺)至少30分钟。切片用兔抗血清（在封闭缓冲液中以70μg/ml稀释免疫纯化的抗EIIIB，或以1:100稀释其他抗血清）染色至少1小时，然后用生物素缀合的山羊抗兔Ig（1:200稀释；TAGO Biosource，Camarillo，CA）染色30分钟，然后用抗生物素-FITC（1:100稀释；西格玛化学公司。对于双标记免疫荧光，抗α6整合素亚基（GoH3）或β4整合素亚基（346-11A）的单克隆抗体包含在与初级抗体的孵育中，然后是德克萨斯州红结合山羊抗大鼠IgG（纽约州曼哈塞特市癌基因科学），浓度为1μg/ml。在蔡司Axiophot显微镜（Thornwood，NY）上拍摄代表性的场。对照实验表明，在我们的条件下，荧光素既没有向德克萨斯红方向渗出，也没有向相反方向渗出。

表皮基底膜的超微结构分析

如上所述制备新生小鼠的四肢，取下脚并制备电子显微镜，如下所示：将样品固定在2.5%戊二醛/2.5%多聚甲醛的0.1 M二甲氨基甲酸缓冲液中，pH值7.2，在4°C下保持1 h，在0.1 M二乙氨基甲酸缓冲溶液中清洗，在4°C的碳酸钙缓冲液中，在2%四氧化锇中后固定2小时，然后在碳酸钙缓冲溶液中洗涤。然后将样品在乙醇和环氧丙烷中脱水，并在60°C下嵌入Spurr树脂中48 h。超薄切片（70 nm）在徕卡切片机上切割，安装在200目铜网格上，用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色，并在JEOL 1200EX电子显微镜上观察（马萨诸塞州皮博迪）。

小鼠原代角质形成细胞的分离培养

基本上如前所述，从新生小鼠中制备表皮角质形成细胞(Dlugosz等人，1995年). 简单地说，新生小鼠被一氧化碳杀死₂麻醉，在PBS中的10%碘溶液（Mallinckrodt，Paris，KY）中清洗10分钟，用PBS冲洗，用70%乙醇冲洗10分钟，然后用PBS清洗。去除尾巴并用PCR进行基因分型；四肢被切除并用于准备冰冻皮肤切片（见上文）。从躯干和头部去除皮肤，然后漂浮在0.25%胰蛋白酶溶液上(GIBCO巴西雷亚尔（马里兰州盖瑟斯堡）在4°C下过夜，表皮朝上。然后将皮肤转移到干燥、无菌的表面，使表皮朝下，真皮与表皮分离并丢弃。将表皮切碎，悬浮在生长介质中（见下文），并搅拌以释放角质形成细胞。悬浮液通过无菌的70μm尼龙过滤器（加州山景城Becton Dickinson）去除角质化的床单。将角质形成细胞接种到涂有30μg/ml变性鼠尾胶原蛋白（collagen Corp.，Palo Alto，CA）的组织培养板上，密度为～2–4×10⁵细胞/厘米²为了防止角质形成细胞分化，培养物生长在低钙培养基中，该培养基由Eagle’s Minimum Essential medium（EMEM；BioWhittaker，Walkersville，MD）组成，并辅以4%的FBS（Intergen，Purchase，NY），其中Ca²⁺被螯合作用除去(Brennen等人，1982年)，0.05 mM氯化钙₂，“HICE”混合物（0.5μg/ml氢化可的松[Calbiochem-Novabiochem Corp.，La Jolla，CA]，5μg/ml胰岛素[西格玛], 10⁻¹⁰M霍乱毒素[ICN Biomedicals，Inc.，Costa Mesa，CA]，10 ng/ml表皮生长因子[Upstate Biotechnology，Lake Placid，NY]，2×10⁻⁹M T3[西格玛])100 U/ml青霉素和100μg/ml链霉素(GIBCO巴西雷亚尔). 小鼠角质形成细胞在34°C，7.5%CO下培养₂在实验中使用前保持5-7天。

整合素的碘化和免疫沉淀

小鼠角质形成细胞培养物生长7 d，单层用0.5 mCi/10-cm Na板进行表面标记[¹²⁵我](新英格兰核电站（马萨诸塞州波士顿），采用乳过氧化物酶-葡萄糖氧化酶法(海因斯，1973年). 用50 mM NaI在PBS/Ca中清洗细胞四次²⁺镁²⁺并在含有200 mM辛基-β-d-吡喃葡萄糖苷（Calbiochem）、50 mM Tris、pH 7.5、150 mM NaCl、1 mM CaCl的1 ml洗涤剂缓冲液中在冰上溶解15分钟₂，1 mM氯化镁₂，2 mM PMSF(西格玛)，0.02 mg/ml抑肽酶(西格玛)和0.0125 mg/ml亮氨酸肽（钙生物化学）。将裂解液在10000℃下沉淀10分钟g、。上清液与100μl蛋白A–Sepharose（1:1浆液；法玛西亚LKB，Piscataway，NJ）1小时，珠子在10000℃下沉淀2分钟g、。使用Bio-Read试剂盒测定上清液的蛋白质浓度，并用所述的抗整合素抗体免疫沉淀等量的蛋白质(Marcantonio和Hynes，1988年). 简单地说，将BSA添加到裂解液（总蛋白180μg）中，使最终浓度达到～3 mg/ml，然后添加5-10μl抗血清。在4°C孵育1 h后，向反应中添加50μl蛋白质A–Sepharose（在裂解缓冲液中预先吸收10 mg/ml BSA的1:1浆料）。反应在4°C下培养过夜。用冷裂解缓冲液和蛋白酶抑制剂清洗样品四次，将样品悬浮在样品缓冲液（2%SDS、80 mM Tris-HCl、pH 6.8、2 mM EDTA、10%甘油和溴酚蓝）中，并煮沸5分钟莱姆利（1970）使用5%丙烯酰胺和3%堆积凝胶。

角质形成细胞制备富含层粘连蛋白-5的细胞外基质

为了制备富含层粘连蛋白5的ECM，从新生儿包皮中制备人表皮角质形成细胞（HEK），如所述(Rheinwald and Green，1975年)或购自Clonetics（加利福尼亚州圣地亚哥），分别在FAD培养基（火腿F12和DMEM的1:3混合物）中生长，1.8×10⁻⁴腺嘌呤、10%FBS、HICE混合物、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素）或无血清角质形成细胞生长培养基(GIBCO巴西雷亚尔)按照制造商的指示，补充EGF和牛垂体提取物。细胞在35 mm组织培养板（Becton Dickinson）上生长几天，用0.05%胰蛋白酶和PBS中的1 mm EDTA去除，然后丢弃。用0.5 mg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂处理HEK分泌ECM涂层的表面(西格玛)然后在PBS中用1 mg/ml BSA封闭。

α3-Null小鼠基底膜组织缺陷

鉴于α3-null皮肤起泡区域的基底膜破裂，我们还检查了非起泡区域中的基底膜组织。正如预期的那样，野生型皮肤中的层粘连蛋白5仅限于表皮基底角质形成细胞正下方的基底膜（图。​（图3，三,A类和C类,箭头)；基底膜在检查的每一个断面上都完好无损。与此形成鲜明对比的是，α3-null小鼠的皮肤染色显示了大量的基质紊乱区域，在基底膜平面下方也检测到层粘连蛋白-5（图。​（图3三 D类,箭头). 同一区域的相位对比显示，这些区域的表皮和真皮完整（图。​（图3三 B类). 在某些情况下，层粘连蛋白-5的密集浓度类似于基底膜的连续残余物，向下延伸至真皮区域（例如，见图。​图44 F类). 在α3-null突变杂合的小鼠中，基底膜的层粘连蛋白-5染色似乎正常，其中α3β1水平降低，但仍易于检测（未显示）。基于紊乱的基质/起泡表型，我们可以在通过PCR或Southern blot分析确认基因型之前，常规地从α3缺失小鼠的皮肤切片中进行鉴定。

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图3

α3-null皮肤基底膜紊乱。(A–D)野生型冷冻皮肤切片(A类和C类)或α3-null(B类和D类)通过相位对比观察小鼠(A类和B类)或用抗层粘连蛋白5的抗血清进行免疫荧光染色(C类和D类). 箭头指向野生型皮肤基底膜层粘连蛋白-5染色区域(A类和C类)或在α3-缺失皮肤基底膜紊乱区域(B类和D类). (E类和F类)比较野生型基底膜区超微结构的电子显微照片(E类)和α3-null(F类)皮肤。(G公司和H（H）)相关结构示意图见E类和F.黑色基底角质形成细胞；陆上通信线，透明层；劳埃德，致密层；箭头指向基底角质形成细胞中沿质膜基底面分布的半桥粒。条形图：(D类)50微米；(F类)200纳米。

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图4

Entactin和VII型胶原与层粘连蛋白-5共分布于基底膜紊乱的区域，以及α3-缺失皮肤水疱的真皮和表皮侧。用抗α6整合素亚基的GoH3单克隆抗体和抗层粘连蛋白5的抗血清对新生儿皮肤冰冻切片进行双标记免疫荧光染色(A类,E类,我，以及B类,F类,J型或使用VII型胶原抗血清进行免疫荧光(C类,G公司，以及K（K）)或纽他菌素(D类,H（H），以及L（左）). (A–D)野生型皮肤的代表性字段。(E–H（E–H）)α3-null皮肤基底膜紊乱区域的相邻切片；箭头指向真皮中α6染色定义的基底膜区以外的区域(E类)基底膜蛋白被检测到的位置(F–H（飞行高度）). (I–L型)通过α3-null皮肤中水疱的相邻部分；箭头和箭头分别指向水疱的真皮和表皮侧。棒，50μm。

我们还检查了真皮-表皮交界处的超微结构。这些分析的结果如图所示。​图3，三,E类和F类，如图所示。​图3，三,G公司和H（H）分别是。野生型小鼠的新生儿皮肤（图。​（图3，三,E类和G公司)，电子致密半桥粒(箭头)在基底膜区透明层（LL）附近的角质形成细胞的基底表面检测到，基底膜致密层（LD）在透明层下方可见一个连续的电致密区。在α3-null小鼠的新生儿皮肤中（图。​（图3，三,F类和H（H）)，基底角质形成细胞上存在半桥粒，其大小和频率与野生型皮肤中的类似。然而，与野生型皮肤相比，一些动物的α3-缺失皮肤致密层在切片中出现不连续；电子致密物质与半桥粒正下方和邻近的区域相关，但在半桥粒之间的区域减少或缺失。因此，在α3-缺失皮肤的超微结构水平上，基底膜的紊乱也很明显。

由于半桥粒在α3-null皮肤的超微结构水平上正常，我们还检测了半桥粒成分α6β4的表达和分布(Stepp等人，1990年;Jones等人，1991年). 在一些细胞中，α6亚单位也与β1亚单位相关(海恩斯，1992). 然而，表皮中的大多数或全部α6似乎与β4有关(Watt和Hertle，1994年)β4-null小鼠的皮肤中检测到很少或没有α6（van der Neut等人，1996；Dowling等人，1996年). 此外，我们在原代小鼠角质形成细胞（下文讨论）中未检测到α6β1，并且α6和β4在野生型和α3缺失皮肤中的分布是相同的。野生型皮肤的双重标记免疫荧光，使用抗层粘连蛋白-5血清和抗α6单克隆抗体GoH3(Sonnenberg等人，1987年)，表明α6亚单位集中在角质形成细胞的基底表面（图。​（图44 A类)在基底膜中与层粘连蛋白5相邻（图。​（图44 B类)，与α6β4的预期一样(Carter等人，1990年b条 ). 虽然α6在α3阴性表皮中的分布相同，但当层粘连蛋白5在基质紊乱区域的基底膜平面以下被检测到时，它并没有与层粘连素5共分布（对比图。​图4，4,E类和F类). 因此，在随后的所有分析中，使用具有针对α6或β4整合素亚单位和层粘连蛋白-5的抗体的双重标记免疫荧光来证实基底膜紊乱的存在。

与层粘连蛋白5相比，α6仍然局限于水疱表皮侧基底角质形成细胞的基底表面（对比图。​图4，4,我和J型)偶尔在水疱上出现不连续分布（未显示）。层粘连蛋白-5在水疱表皮侧的分布可能是由于其与基底角质形成细胞上的α6β4结合，这与我们使用培养角质形成淋巴细胞进行的粘附研究一致，如下所述。

VII型胶原和戊聚糖，这两种成分都是表皮基底膜的成分（Martin，1987；Timpl，1989年;Burgeson，1993年)，分别在野生型表皮的基底膜中检测到（图。​（图4，4,C类和D类）；在真皮毛细血管的基底膜中也检测到了凝集素（图。​（图44 D类). α3-缺失皮肤相邻切片的染色显示，VII型胶原蛋白和凝集素与层粘连蛋白-5共同分布于基底膜紊乱的区域（对比图。​图4，4,F–H（飞行高度）,箭头). 此外，通过水疱对相邻切片进行染色显示，VII型胶原蛋白和凝集素，如层粘连蛋白-5，分别分布在裂开的表皮和真皮两侧（对比图。​图4，4,J–L型). 在预期识别含有α1、β1或γ1链的层粘连蛋白亚型的抗血清中也观察到类似的染色（未显示）（参见Burgeson等人，1994年)包括基底膜蛋白层粘连蛋白-6（α3、β1和γ1），但不包括层粘连素-5（α3，β3和γ2）。

抗纤维连接蛋白的抗血清在真皮上产生了纤维状染色模式（图。​（图5，5,A类和B类)偶尔在基底膜区出现浓染（未显示），如之前在胚胎发育期间所报告的(彼得斯和海恩斯，1996年). 针对纤维连接蛋白EIIIB片段的抗血清产生了类似的染色模式（图。​（图5，5,D类和E类). 在α3-null皮肤中，总纤维连接蛋白（图。​（图55 C类)和EIIIB+纤维连接蛋白（图。​（图55 F类)分别在水疱的表皮和真皮两侧检测到。由于血清中EIIIB+纤维连接蛋白的水平通常很低(Peters等人，1995年)这些染色模式表明，水疱中的纤维连接蛋白来源于细胞外基质，而不是浸润性血清。然而，我们不能排除血清纤维连接蛋白对水疱中检测到的纤维连连接蛋白的某些贡献。虽然纤维连接蛋白作为表皮基底膜成分的作用一直存在争议(海恩斯，1990)，我们的发现表明纤维连接蛋白与表皮基底角质形成细胞有关联。综合考虑，各种基质蛋白的分布表明，α3-缺失表皮中水疱的形成与基底膜本身的紊乱和破裂有关，而不是与表皮与基底膜粘附的简单缺陷有关。

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图5

纤维连接蛋白分布于α3缺乏皮肤水疱的表皮和真皮两侧。野生型冷冻切片(A类,B类,D类，以及E类)或α3-null(C类和F类)皮肤被纤维连接蛋白抗血清染色(B类和C类)或免疫前血清(A类)，或与纤连蛋白EIIIB片段特异性的抗血清(D–F型). 抗EIIIB对纤维连接蛋白的识别需要用N-聚糖酶治疗(E类和F类)，如前所述(Peters和Hynes，1996年)；作为控件，中的节D类未经N-聚糖酶处理。(A类,B类,D类，以及E类)箭头指向皮肤-表皮交界处。(C类和F类)箭头和箭头分别指向水疱的真皮和表皮侧。棒，50μm。

发育中皮肤基底膜蛋白的分布

为了比较正常和α3-缺失小鼠的皮肤发育和基底膜形成，从受精后11.5（E11.5）、15.5（E15.5）和17.5（E17.5）天的胚胎制备冰冻切片。相位对比显微镜（未显示）显示，来自α3-缺失、野生型或杂合胚胎的皮肤在这些发育阶段的每一个阶段在形态学上都无法区分，并且看起来分层正常（有关皮肤发育的综述，请参阅Watt和Hertle，1994年). E11.5处的胚胎表皮由基底细胞层和外层细胞层（周皮）组成，可区分为围绕胚胎的一薄层细胞。在E15.5，表皮显示出不同程度的分层。在出生前2–3天的E17.5，表皮明显分层，与新生小鼠相似。

在所检测的每个发育阶段，野生型、杂合型和α3-缺失胚胎的皮肤中，几种ECM蛋白的发育表达和一般分布是相同的；因此，图中的面板。​图66显示了entactin和VII型胶原蛋白的代表性数据。Entactin在E11.5处真皮-表皮交界处清晰地界定了基膜区（图。​（图66 A类)，E15.5（图。​（图66 C类)和E17.5（图。​（图66 E类). 在这些阶段的每个阶段，都可以在真皮中检测到VII型胶原蛋白，就像出生时一样，但随着发育的进行，它在基底膜区变得更加集中（对比图。​图66 B类,D类，以及F类). 纤维连接蛋白在各个阶段的分布与出生时相似；如前所述，纤维连接蛋白在真皮至真皮-表皮交界处被检测到，在某些部位，它在这个交界处更为集中（数据未显示）(彼得斯和海恩斯，1996年).

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图6

发育中皮肤中的entactin和VII型胶原蛋白的分布。第E11.5天小鼠胚胎皮肤的冰冻切片(A类和B类)，E15.5(C类和D类)，或E17.5(E类和F类)用抗血清对发育过程进行了染色(A类,C类，以及E类)或VII型胶原蛋白(B类,D类，以及F类). 在野生型中，内塔菌素或VII型胶原的染色模式是相同的(A类,C类，以及D类)和杂合子(E类和F类)胚胎；VII型胶原染色B类来自α3-null，E11.5胚胎，但与该阶段的野生型胚胎相同。e（电子）表皮；d日，真皮。棒，50μm。

层粘连蛋白-5及其整合素受体在正常皮肤和α3-空白皮肤发育过程中的分布

为了比较层粘连蛋白5及其受体α3β1和α6β4的发育表达，我们首先检测了野生型或杂合型小鼠中这些蛋白的表达。早在E9.5时，α3β1就在胚胎表皮中表达，并在整个发育过程中仅限于基底角质形成细胞，呈基底外侧分布（图。​（图11 B类和数据未显示）。使用抗β4亚单位（346-11A；犬舍等，1989年)和抗层粘连蛋白-5血清（图。​（图7，7,A–D,G公司，以及H（H）). 在E11.5胚胎的未分层皮肤中未检测到层粘连蛋白-5（数据未显示）。在E15.5，整个胚胎的分层程度不同，基底膜区层粘连蛋白-5的出现大致与表皮分层增加一致；抗层粘连蛋白5在分层较少的区域没有染色基底膜（图。​（图77 B类)但在更分层的区域，基底膜明显染色（图。​（图77 D类). β4在E15.5的分布相似；在分层较少的区域，它在基底角质形成细胞层内呈基底外侧分布（图。​（图77 A类)，类似于α3β1的分布（未显示），在更分层的区域中，它集中在基底角质形成细胞的基底表面，靠近基底膜中的层粘连蛋白5（对比图。​图7，7,C类和D类). 因此，α6β4向基底角朊细胞基底部的募集似乎与层粘连蛋白-5并入基底膜相一致，并可能反映了α6β4.介导的细胞与层粘着蛋白-5粘附的建立。在E17.5表皮中，α6β4总是集中在靠近富含层粘连蛋白5的基底膜的基底角质形成细胞的基底表面（图。​（图7，7,G公司和H（H）)如新生儿皮肤（图。​（图4，4,A类和B类).

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图7

α6、β4和层粘连蛋白-5在正常和α3-缺失胚胎发育中皮肤中的分布。E15.5天小鼠胚胎皮肤的冷冻切片(A–F)或E17.5(G–L)用抗β4整合素亚基的单克隆抗体346-11A对发育进行双标记免疫荧光染色(A类,C类，以及G公司)或抗α6整合素亚基的GoH3单克隆抗体(E类,我，以及K（K）)和抗层粘连蛋白-5血清(B类,D类,H（H），以及F类,J型,L（左））。对照切片取自野生型胚胎(A–D)或杂合胚胎(G公司和H（H）). 在野生型E15.5胚胎中，α6β4和层粘连蛋白5共同分布于多层区域的基底膜区(C类和D类)，但不在分层较少的区域(A类和B类)；每个面板中表皮的宽度用一个双头箭头表示。在E15.5的α3-null胚胎中(E类和F类)和E17.5(我和J型)，箭头指向α6阳性基底角质形成细胞下方基底膜紊乱区域的层粘连蛋白-5染色区域；皮肤E类和F类被折叠起来。(K（K）和L（左）)E17.5处α3-缺失皮肤的放大倍数更高，显示α6-阴性基底角质形成细胞已与层粘连蛋白-5阳性基底膜分离，用箭头标记。e（电子）表皮；d日，真皮。条形图：（如所示J型对于A–J)50微米；和（英寸L（左）对于K（K）和L（左）)50微米。

α3缺失胚胎发育过程中α6β4（即α6或β4亚基）的时间表达和分布与野生型或杂合型胚胎中的表达和分布相同。然而，用抗层粘连蛋白5对E15.5胚胎进行染色，发现α3缺失皮肤中偶尔出现基膜紊乱区域（图。​（图7，7,E类和F类). 到E17.5，这些区域更为常见（图。​（图7，7,我和J型)出生后，变得越来越杂乱无章，范围越来越广。α3基因缺失胚胎的腿部和躯干皮肤上都发现了不规则的基底膜，但在野生型或杂合型胚胎的皮肤上没有发现。

虽然我们不能排除α3基因缺失小鼠产前水疱形成的可能性，但我们在α3基因突变小鼠胚胎中没有发现直径大于少数细胞的皮肤水疱。在E17.5胚胎中，我们偶尔观察到个别基底角朊细胞α6染色缺失（图。​（图77 K（K）). 正如对缺乏α6β4的基底角质形成细胞的预期（van der Neut等人，1996；Georges-Labousse等人，1996年;Dowling等人，1996年)，这些细胞从基底膜上分离出来，因为层粘连蛋白5只分布在分离的真皮侧（比较图中的箭头）。​图7，7,K（K）和L（左）). 然而，我们在E17.5处没有发现类似新生儿皮肤大裂口的水疱。胚胎是通过剖腹产收集的，从而减少了与出生相关的机械应力。否则，E17.5胚胎和新生小鼠的皮肤切片以相同的方式制备，这表明α3-缺失新生儿的水疱是由出生期间或出生后的物理创伤引起的，而不是由样品制备过程中的机械应力引起的。

从α3-Null新生小鼠中分离原代角质形成细胞

为了直接说明α3β1作为表皮层粘连蛋白-5受体的重要性，我们从野生型和α3缺失的新生小鼠中分离出初级角质形成细胞(Dlugosz等人，1995年; 有关详细信息，请参见材料和方法）。为了比较与层粘连蛋白5结合的整合素在野生型和α3β1缺陷型角质形成细胞中的表面表达，在7-d时，对原代培养物进行表面碘化处理¹²⁵一、 用整合素亚单位抗体免疫沉淀洗涤剂裂解物，并在非还原条件下用SDS-PAGE分析（图。​（图8）。8). 正如预期的那样，抗α3免疫血清从野生型细胞（lane）的裂解物中沉淀出大量与β1亚基（～110 kD）相关的α3亚基（~150 kD）2)，但在α3阴性细胞（lane）的裂解液中未检测到α3β15). 抗β1血清（lane1)共免疫沉淀β1和相关蛋白，约150 kD，对应于角质形成细胞中的α3和其他结合α亚单位(Watt和Hertle，1994年). 与野生型细胞相比，α3null细胞中β1整合素的表面水平显著下降（比较车道1和4)表明α3β1构成了小鼠角质形成细胞中总β1整合素的主要比例。

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图8

从野生型（lanes）分离的原代角质形成细胞中整合素的表面表达1–3)或α3-null（车道4–6)，新生小鼠。洗涤剂裂解物来自¹²⁵如每条泳道顶部所示，I表面标记细胞用抗血清免疫沉淀β1、α3或α6整合素亚基的细胞质域。分子量标记显示在放射自显影的右侧。某些整合素亚基的迁移位置显示在左侧，包括β4的蛋白水解片段，一,b条，以及c，前面由描述Hemler等人（1989）.与α3（lane）结合的α3-null细胞中的β1-相关带4)代表角朊细胞中与β1二聚的其他整合素α亚单位，因为α3在α3阴性细胞（lane）中未检测到5). ?, 可能代表β4蛋白水解片段的未知条带（见正文）。

使用抗α6整合素亚基（lane）的多克隆抗血清检测α6β4三)，共免疫沉淀了一系列预期用于α6亚单位（～140 kD）和β4亚单位的各种衍生物的条带(Hemler等人，1989年;Kajiji等人，1989年;亚当斯和瓦特，1991年). 在来自人类细胞的非还原性免疫沉淀物中，全长β4亚单位在～210 kD迁移(一碎片）和165 kD的较小碎片(b条碎片），125 kD(c片段），并且85kD被认为是由β4的蛋白水解引起的(Hemler等人，1989年). 事实上，这种蛋白水解模式在β4整合素的研究中作为一种诊断工具是有用的(Hemler等人，1989年). 对应于一,b条，以及c小鼠角质形成细胞中的β4片段如图所示。​图8；8; ～70 kD的未知条带可能对应于人类细胞中的85-kD片段。这些片段中的每一个在小鼠角质形成细胞中的迁移速度都比在人类细胞中的迁移速度快(Hemler等人，1989年)可能是由于β4糖基化的物种特异性差异。重要的是，在野生型细胞和α3-空细胞的裂解液中，α6-相关带是相同的（比较车道三和6). β1免疫沉淀（lanes）中未检测到与α6亚单位对应的带1和4)表明原代小鼠角质形成细胞几乎没有α6β1。与这一概念一致，无论是通过用GoH3免疫沉淀α6整合素，然后用抗β1血清进行Western印迹，还是通过用抗α6血清免疫沉淀β1整合素然后进行Western-blotting，都没有在小鼠角质形成细胞中检测到α6β1（数据未显示）。

α3β1是皮肤基底膜完整性所必需的

尽管α3-缺陷小鼠的皮肤分层与野生型小鼠的皮肤分层相当，但免疫荧光显微镜和α3-缺失小鼠皮肤切片的电子显微镜均显示基底膜具有广泛的无组织区域。此外，新生小鼠的基质紊乱通常与皮肤-表皮交界处起泡有关。通过α6亚单位的零突变导致α6β4缺乏(Georges-Labousse等人，1996年)或β4亚单位（van der Neut等人，1996年；Dowling等人，1996年)也会导致表皮起泡，尽管这些小鼠的起泡表型比α3阴性小鼠严重得多。此外，α3-null表型在另一个重要方面与α6-null和β4-null小鼠的表型不同。后两种突变似乎导致基底表皮角质形成细胞从基底膜上脱落，因为在这两种情况下，层粘连蛋白5仅定位于水疱的真皮侧面(Georges-Labousse等人，1996年; van der Neut等人，1996年；Dowling等人，1996年). 相反，α3-缺失表皮起泡似乎是由于基底膜本身的缺陷造成的，因为层粘连蛋白-5分布于表皮和真皮侧的裂口。事实上，由于层粘连蛋白-5与α6β4共定位于水疱的表皮侧，并且α3-空角质形成细胞以α6-依赖的方式附着于层粘连素-5，因此α3-空表皮似乎保留了其与基底膜的结合能力，可能通过α6β4。因此，与α3β1缺陷和α6β4缺陷小鼠相关的表皮表型似乎彼此不同，并表明α3βl参与建立和/或维持基底膜的完整性。

表皮基底膜的化学成分和物理组织很复杂（有关综述，请参阅Borradori和Sonnenberg，1996年;Uitto等人，1996年). 在超微结构水平上，皮肤-表皮交界处被分解为透明层，与表皮中基底角质形成细胞的质膜和下面的致密层相邻。内切蛋白/巢蛋白与IV型胶原、层粘连蛋白-5和其他层粘连蛋白质亚型（包括层粘连素-6和-7）一起定位于致密层。一些基底膜结构与半桥粒特异性相关。例如，由VII型胶原组成的锚定纤维从真皮延伸到与半桥粒相邻的基底膜致密层。含有层粘连蛋白-5的锚定丝从锚定原纤维穿过透明层延伸到基底细胞表面的半桥粒。有趣的是，VII型胶原蛋白、凝集素和层粘连蛋白-5分别分布在α3缺失皮肤水疱的两侧。这些分布表明，基底膜不会在基底膜的不同区域之间破裂，而是通过不同的层和结构不均匀地破裂。或者，这些蛋白质在水疱内的分布可能反映与基底膜不同区域相关的不同组分。例如，水疱表皮侧的VII型胶原蛋白可能代表尚未正确组装成锚定纤维的部分。在这两种情况下，水疱内基质蛋白的分布似乎反映了α3缺失皮肤基底膜的普遍紊乱和减弱。尽管在基底膜中存在纤维连接蛋白一直存在争议（在海恩斯，1990)，该基质蛋白也分布于水疱两侧，表明纤维连接蛋白与基底角质形成细胞之间存在直接或间接的相互作用。

α3-Null皮肤发育过程中基底膜出现紊乱

我们的观察结果表明，α6β4、层粘连蛋白5和其他几种ECM蛋白在α3基因缺失小鼠皮肤发育中的时间表达模式和一般分布与野生型和杂合型小鼠皮肤中的表达模式和分布相似。然而，对用抗层粘连蛋白5血清染色的α3缺失胚胎的皮肤切片进行检查，发现在发育的第E15.5天基底膜组织存在缺陷，随着发育的进行，这种缺陷变得越来越明显。E15.5也是层粘连蛋白-5首次在表皮较分层区域下方的基底膜中检测到的阶段，其中大多数α6β4已重新定位到基底角质形成细胞的基底表面。因此，这一发育阶段似乎代表了层粘连蛋白-5被募集到基底膜的时间，并且可能代表了真皮-表皮连接的维持开始转变为层粘连蛋白-5依赖性粘附机制的时间。此时可能需要α3β1来帮助组装和/或维持这种新的层粘连蛋白-5依赖性基底膜（见下文）。

α3-缺失皮肤中基质紊乱和表皮起泡的因果关系尚不清楚。然而，如上所述，基质的紊乱似乎反映了基底膜的薄弱，最终破裂并导致水疱的形成。在另一种但非专用的模型中，皮肤发育过程中可能会出现小水疱（如图。​图7，7,K（K）和L（左）)而且，在胎儿修复皮肤-表皮交界处时，旧基底膜的残留物被移到新沉积基质的平面以下，造成基底膜的紊乱外观。事实上，经常可以看到密集的层粘连蛋白-5和其他类似于连续基底膜残余物的基质蛋白从皮肤-表皮交界处向下延伸到皮肤区域。

层粘连蛋白5受体α3β1和α6β4在角质形成细胞中具有不同的功能

从α3-null表皮分离出的角质形成细胞在培养中保留了与层粘连蛋白-5结合的能力，但与野生型或杂合型角质形成菌相比，在我们的实验条件下扩散不好。α3空角质形成细胞与层粘连蛋白5的粘附依赖于α6β4，因为单克隆抗体GoH3完全阻断了粘附，并且在这些细胞中未检测到α6β1。另一方面，相同浓度的GoH3对野生型角质形成细胞与层粘连蛋白5的粘附几乎没有影响，表明α3β1足以粘附。这些结果表明，α3β1和α6β4在小鼠角质形成细胞中具有不同但重叠的功能；两者都能支持细胞与层粘连蛋白-5的初始粘附，但细胞扩散需要α3β1。在人类包皮角质形成细胞的功能块研究中，已经证实了α3β1和α6β4的这些作用(Xia等人，1996年)，并被建议用于小鼠乳腺肿瘤细胞系(Sonnenberg等人，1993年). 这两种整合素的功能差异反映了它们在体内的不同作用；α6β4是表皮与基底膜稳定粘附所必需的，α3β1似乎在基底膜完整性中起粘附后作用。事实上，虽然α3β1可以通过重新定位到基底角质形成细胞的基底表面来部分补偿β4缺失小鼠中α6β4的缺失（van der Neut等人，1996），但α3βl显然不足以维持这些小鼠表皮与基底膜的粘附。

α3缺失皮肤基底膜的超微结构反映了α6β4和α3β1的这些不同功能。在α3-null皮肤中，致密层直接存在于半桥粒的下方和附近，但在半桥粒之间的区域未正确形成，这表明半桥粒无区致密层的形成是α3β1依赖性的。或者，半桥粒可能与基底膜的电子致密成分有关，这与致密层的其余部分不同。因此，α3β1是形成连续致密层所必需的，但半桥粒组装不需要完整的基底膜。相反，α6β4对于半桥粒的组装是必需的，但对于连续致密层的形成则不是必需的(Georges Labouesse等人，1996年; van der Neut等人，1996年；Dowling等人，1996年).

我们感谢Robert Burgeson为我们提供了纯化的层粘连蛋白-5、层粘连素-5和VII型胶原抗血清，以及宝贵的建议和对原稿的批判性阅读。我们还感谢罗纳德·范德诺伊特（Ronald van der Neut）、阿诺德·桑纳伯格（Arnoud Sonnenberg）和伊丽莎白·乔治·拉布埃西（Elisabeth GeorgesLabouesse）在发表之前分享他们的研究成果。我们感谢Albert Chung、Stephen Kennel和Vito Quaranta分别针对entactin、β4整合素亚基和α6整合素子基的抗体。我们感谢金·默瑟（Kim Mercer）和丹尼斯·克劳利（Denise Crowley）的组织学研究，帕特·赖利（Pat Reilly）的电子显微镜样品制备，斯蒂芬·康沃尔（Stephen Cornwall）的技术援助，以及埃德·克拉克（Ed Clark）、莱德·布鲁姆（Laird Bloom）和伯恩哈德·巴德（Bernhard Bader）对手稿的批判性阅读。