p28 Bap31，一个Bcl-2/Bcl-X_L（左）-和内质网中的前天冬酶-8相关蛋白

细菌的表达和纯化³²用于Ligang Blot（远西方）分析的P标记Bcl-2细胞溶胶结构域

将编码人类Bcl-2细胞溶质结构域（即缺乏COOH末端21氨基酸）的cDNA插入pTrchis载体（Invitrogen，Carlsbad，CA），使用标准PCR方法在COOH末端延伸六组氨酸，以包含使用寡核苷酸5′-CTAGCCCGCCGCCTCTGTGGAATTCGAA和5′-AGCTTTCAGAATTCCAAGAGCGCGGCGGCGCG-3′的心肌激酶识别序列。最终构建物编码Bcl-2（氨基酸1–218）、hexahis、Arg、Arg，Ala、Ser-COOH，以及指定为Bcl-2Δc21/his6/HMK的蛋白质。Bcl-2部分包含三个额外的突变，这些突变是由于与本项目无关的原因引入的（Met 16到Leu；Lys 17到Arg；Lys 22到Arg）。发现表达携带这些突变的全长Bcl-2的稳定上皮细胞系在对抗凋亡死亡刺激方面与表达野生型Bcl-2的细胞一样有效（未显示）。

大肠杆菌MC1061用p转化Bcl-2Δc21/his6/HMK当500毫升培养物达到A时₆₀₀0.6，用1.0mM IPTG处理，4h后离心回收细胞。将包装的细胞（2.5–3.0 ml）悬浮在15 ml提取培养基（20 mM磷酸钠，pH 7.4，0.5 M NaCl，0.05%vol/vol Triton X-100，10 mMβ-巯基乙醇，1.0 mM PMSF和1.0 mM苯甲脒）中，并用Vibra Cell探针超声仪（Sonics&Materials，Inc.，Danbury，CT）超声处理8次在设置为7.5的条件下，在4°C下运行15 s。将声波仪调整为10%（vol/vol）甘油，并在Ti 50.2转子中以25000 rpm在4°C下离心30 min(贝克曼仪器公司。加利福尼亚州富勒顿）。将上清液添加到1.2 ml镍中²⁺-NTA琼脂糖（QIAGEN Inc.，Chatsworth，CA；1:1[vol/vol]混合物与萃取介质），并在4°C下培养1.5小时。在含有20%（vol/vol）甘油和22 mM咪唑的萃取介质中广泛洗涤小球，在含有20%甘油和0.3M咪唑萃取介质中洗脱Bcl-2Δc21/his6/HMK。1升诱导培养产生0.8–1.0 mg蛋白质，纯度>95%。纯化的蛋白质被标记为³²与心肌激酶（HMK）孵育后的P¹和³²P[γ-ATP]，产量2.0–2.5×10⁶cpm/μg蛋白，用于配体印迹，如布兰纳和拉特（1992）.

p20片段的纯化与鉴定

将KB细胞培养在20个15厘米的培养板中，直到达到80%的融合，并感染25 pfu/细胞5型腺病毒，该腺病毒缺乏E1B 19K的表达(下午1716/2072). 60小时后，收集并冲洗总细胞（根据排除台盼蓝判断，65-70%不存活），并将填充的细胞（~1.5 ml）悬浮在6 ml冰冷的裂解培养基中，该培养基含有10 mM Tris-HCl、pH 7.5、140 mM NaCl和1.5 mM MgCl₂0.5%Triton®声波风廓线仪X-100和1 mM PMSF），并分成三等份。使用Artek探头声波仪（Artek Systems Corp.，Farmingdale，NY）在设置6.0下对每一个进行4 X 10 s的声波处理。组合的声波在11000下离心克持续20 min，将上清液与0.25 vol的5×SDS样品缓冲液（250 mM Tris HCl，pH 6.8，50%甘油，0.5%溴酚蓝，10%SDS和1 M DTT）混合。使用Prep Cell 491系统（加利福尼亚州Hercules的Bio-Rad实验室）对总体积进行制备14%SDS-PAGE，该系统配备有37 mm直径的分离凝胶室。以1 ml/min的流速收集组分，通过配体印迹法使用³²P-Bcl-2Δc21/his6/HMK作为探针，反应峰分数在Centripre-10浓缩器中合并并浓缩五倍（Amicon，Inc.，Beverly，MA）。将浓缩样品与等体积的0.12%三氟乙酸混合，并在配备有Vydac C4柱（The Nest Group，Inc.，Southboro，MA）（0.21×20 cm）的系统（1090；Hewlett-Packard Co.，Palo Alto，CA）中进行反相高效液相色谱（HPLC），该柱前面装有两个SDS去除筒（2.1×20 mm）。柱的线性梯度为0至80%n个-含有0.12%三氟乙酸的丙醇，流速为0.1 ml/min，在a下进行监测₂₈₀收集组分（0.1-ml），根据配体印迹判断，含有Bcl-2活性p20的组分分别接受NH₂-哈佛微化学的末端肽序列分析（哈佛大学，马萨诸塞州剑桥）。

p28 Bap31/CDM cDNA的克隆

利用人成纤维细胞RNA和来自人类序列的引物，通过逆转录PCR克隆了p28的编码区BAP31号机组（这些序列数据可从GenBank/EMBL/DDBJ获得，登录号为{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“X81817”，“term_id”：“550342”，“term_text”：“X81817“}}X81817型). 条件完全符合Goping等人（1995年）一)，我们使用5′-TTCTAGAACAAACAGAAGTACTGGA-3′作为反义引物，5′-GATCTAGACATCTCGTGGGAA-3′作为有义引物。DNA序列分析证实了其真实性。

谷胱甘肽S-转移酶融合蛋白

使用分别包含5′-BamH1或3′-EcoR1悬挑的引物，PCR生成与p28氨基酸1–246（全长）、1–164、122–164和165–246相对应的cDNA片段。p28氨基酸1-246的引物为5′-GCGGATCTGCAGTGGACT-3′和5′-GGCGAATTCTACTCTCCTTCTTGTC-3′；p28氨基酸1–164的5′-GCGGATCTGCAGTGGACT-3′和5′-GCCAAATTCAACAGCTCCCCT-3′；p28氨基酸122–164的5′-GCGGCGGATCCCCTCATTTCGCAGCAGCC-3′和5′-GGCGAATTCAGACACCCCTT-3′；p28氨基酸165-246的5′-GCGGATCCCGGAGCAAGTTGGATGTC-3′和5′-GGCGAATTCTACTCTCCTTCTTGTC-3’。PCR产生的片段用BamH1和EcoR1消化，插入pGEX-2t的BamH1和EcoR2位点之间(法玛西亚精细化工，Piscataway，NJ），并将重组质粒导入大肠杆菌MC1061.回收500 ml诱导培养物中的填充细胞，将其悬浮在25 ml PBS和0.1%Triton X-100中，并使用振动细胞探针声波仪在4°C下以7.5的设置操作4×15 s进行声波处理。在Beckman Ti 50.2转子中以25000 rpm离心25 min后，回收上清液，与750μl 1:1的谷胱甘肽-Sepharose 4B珠悬浮液混合，并在4°C下旋转45 min。在PBS和0.1%Triton X-100、谷胱甘苷S-转移酶（GST）中广泛清洗珠后用3 ml 50 mM Tris HCl、pH 8.0和12 mM还原型谷胱甘肽洗脱融合蛋白。

抗体

将GST融合蛋白注射到鸡体内，从鸡蛋中回收产生的IgY抗体，正如Goping等人（1995年）一)在吸附与固定化GST反应的IgY后，使用Amino-Link Plus试剂盒中描述的方法，通过与固定化的GST-p28（165-246）或GST-p2八（122-164）融合蛋白亲和结合来纯化p28序列特异性抗体(皮尔斯化学公司。，伊利诺伊州罗克福德）。

瞬时转染

CHO LR73细胞以5×10的密度接种⁵6孔板中的细胞/孔。24小时后，用磷酸钙沉淀法将每个孔中的细胞转染0.5μg荧光素酶报告质粒、10μg RcRSV-p28或RcRSV p20和10μg剪切鲑鱼精子DNA(Goping等人，1995年b ). 24小时后，用15%的甘油冲击细胞，24小时后收集。在0.4 ml 0.5%NP-40和50 mM Tris HCl（pH 7.8）中溶解每个孔中的细胞，并如前所述分析等分样品的荧光素酶活性(Goping等人，1995年b ). 当细胞达到50-60%的融合率时，将293T细胞在10-cm培养板中同样转染15μg总质粒DNA。

第28页Bap31

图。​图22 C类强调了人类p28序列中的几个预测基序。有三个潜在的跨膜（TM）片段(基特和杜立德，1982年)位于NH₂-分子的末端一半。TM1和TM3各自含有带电荷的残基。此外，由相同的P1–P4四肽识别序列（Ala-Al-Val-Asp）和P1′位置的优选小氨基酸（Gly）组成的两个潜在半胱氨酸蛋白酶裂解位点位于多肽中的164和238位置，在预测的亮氨酸拉链结构域的任一侧（图。​（图22 C类)与procaspase-8/10和FADD等蛋白质中发现的死亡效应域的弱同源性重叠（图。​（图22 D类). 近端半胱天冬酶识别位点的裂解将产生产物（计算M_第页18.8 kD），大小与p20相似。有趣的是，小鼠序列中缺乏远端胱天蛋白酶识别位点（图。​（图22 D类). 最后，该分子终止于Lys-Lys-Glu-Glu，这符合一个典型的KKXX COOH末端信号，该信号保留含有COOH端的完整ER蛋白，该蛋白暴露于该细胞器内的细胞质中，阻止其进入远端分泌途径(Jackson等人，1993年).

如图所示。​图3，三p28被高效地共翻译插入犬胰腺微粒体。β-内酰胺酶在内质网膜上易位，并以可溶性蛋白的形式沉积在内腔中，与之相反，p28在核糖体释放后作为一种整体蛋白被回收。然而，加工后的β-内酰胺酶不受外部蛋白酶的影响（图。​（图3，三，车道4)并通过碱提取从微粒体中分离出来（图。​（图3，三，车道三)，p28对碱提取有抗性（图。​（图3，三，车道7)，并表现出对外部蛋白酶的敏感性（图。​（图3，三，车道8)这导致产生蛋白水解片段，预期该片段将用于具有暴露的胞质域的多跨整合蛋白。不像β-内酰胺酶，其NH₂-在易位过程中，终端信号序列被删除（图。​（图3，三，比较车道1和4)，没有观察到p28的处理（图。​（图3，三，比较车道5和6)这表明插入微粒体膜是由未分离的信号锚开始的。尽管没有详细研究，但p28的观察属性（图。​（图3），三)以及基于电荷差规则的内质网跨膜节段取向预测(冯·海因（von Heijne），1986年;Hartmann等人，1989年)，建议ER膜中p28的拓扑结构，其中NH₂这种三跨多肽的末端面对内腔，留下一个～13-kD的COOH末端片段，其中包含预测的caspase裂解位点、亮氨酸拉链/死亡效应样结构域和暴露于胞浆的ER保留基序（见图。​图3）。三). 生化分级和冷冻免疫细胞化学电镜证实p28主要位于大鼠肝细胞的内质网（未显示）。

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图3

将p28插入内质网微粒体。前β-内酰胺酶（lanes1–4)和p28（车道5–8)mRNA在兔网织红细胞裂解物系统中被翻译[³⁵S] 蛋氨酸，存在（车道2–4和6–8)或不在（车道1和5)核糖体撕裂的犬胰腺微粒体(沃尔特和布洛贝尔，1983年). 在反应结束时，通过SDS-PAGE和荧光成像直接回收微粒体并进行分析（lanes2和6)或在碱性不溶物（NaCO）隔离后_三pH 11.5）产品（车道三和7;Nguyen等人，1993年)，或用蛋白酶K（lanes）处理后4和8;McBride等人，1992年). p28、前β-内酰胺酶的位置(前β-L（左）)和加工过的β-内酰胺酶(β-L（左）)如凝胶前面所示。c（c），标记翻译产品。荧光图下方所示的示意图描述了内质网膜中p28的推断拓扑结构（见正文）。

重组p28和p20与Bcl-2相互作用

构建了各种p28融合蛋白，其中GST与p28氨基酸1–246（全长p28）、1–164（p20）、122–164和165–246连接。这些结构体与GST本身一起被纯化，并在配体印迹分析中检查等量的结构体与Bcl-2细胞溶质结构域的结合能力。如图所示。​图44 一个，GST-p28（车道5)和GST-p20（车道4)，活性较弱，可能与COOH末端165-246氨基酸结构域（lane2)中间122–164氨基酸结构域（lane）未检测到三)或仅用于GST（车道1).

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图4

p28与Bcl-2、Bcl-X的结合_L（左）和procasase-8（pro-FLICE）。(一个)GST（车道1)或GST融合到p28氨基酸165–246（lane2)，122–164（车道三)，1–164（车道4)，和1–246（车道5)在细菌中表达，纯化并在SDS-PAGE后转移到硝化纤维素中，一式两份。一个印迹用Ponceau S染色，另一个通过配体印迹（远西方）用³²P-Bcl-2Δc22/his6/HMK，如图所示。结构和结果总结如下。(B类)使用标准的重组DNA操作来产生编码Bcl-X的cDNA_L（左）在COOH末端标记Myc表位EQKLISEEDL（Chinnayan等人，1997年）；在COOH末端标记血凝素原-FLICE(哈)表位，YPYDVPDYA（Chinnayan等人，1997）；在NH标记Bcl-2₂HA表位末端(Nguyen等人，1994年); 和用Flag表位标记的p28，其中Flag序列MDYKDDDDKA插入p28的Pro240和Met241之间。重组cDNA，或仅标记DNA(控制-滞后)，插入pcDNA 3（Invitrogen）或RcRSV(法玛西亚精细化工)（HA-Bcl-2）并转染293T细胞，如图所示(加号和缺点). 细胞裂解物与抗旗帜抗体孵育后，免疫沉淀(知识产权)用SDS-PAGE对裂解产物进行拆分，转移到硝化纤维上，用所示抗体进行印迹，并通过增强化学发光进行可视化。Ig HC抗体，免疫球蛋白重链。(C类)与中的相同B类，但如图所示，Bax包含在共转染中。

体内与p28相关的Bcl-2蛋白质和Procaspase-8（pro-FLICE）

Bcl-X的表位标记版本_L（左）在293T细胞中分别或联合表达Bcl-2和野生型procaspase-8，以及p28-Flag或对照Flag。然后通过免疫印迹（Western）分析评估用抗Flag回收的免疫沉淀物中存在的p28相关蛋白（图。​（图44 B类). 为了避免干扰p28中ER保留信号的功能，Flag表位正好插入蛋白质COOH末端的KKEE基序上游。根据联合免疫沉淀判断，Bcl-X_L（左）、procasase-8和Bcl-2都显示了与p28的特定关联（图。​（图44 B类，条车道三，8、和14）。Procaspase-8被观察到是一条双链蛋白带，在Ig重链的正下方迁移；转录-cDNA在体外的翻译同样产生了一个大小相似的双倍体（未显示）。有趣的是，Bcl-X_L（左）当以组合形式表达时，procasase-8不会相互对抗对方与p28的结合能力（图。​（图44 B类，车道5和10; 注意Bcl-X的较低输入电平_L（左）在lane的细胞内裂解物5). 虽然可以预期野生型procaspase-8会被激活，但在Bcl-X存在和不存在的情况下，全长原酶很容易在类似水平上被检测到_L（左）（图。​（图44 B类，条车道8和10).

最后，Bcl-2家族的促凋亡成员Bax(Oltvai等人，1993年)在293T细胞中共表达p28后，没有与p28共免疫沉淀（图。​（图44 C类，车道5)尽管记录了转染Bax的显著表达水平（lanes2和三). 然而，Bax阻止了Bcl-2与p28的结合（图。​（图44 B类，比较车道11和12). 尽管在含有Bax的转染剂中，细胞裂解物中的Bcl-2水平略低（图。​（图44 B类，比较车道8和9)否则，这样的Bcl-2水平就足以检测到Bcl-2和p28的联合免疫沉淀。

通过FLICE相关半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶将p28裂解为p20

为了测试p28，AAVD·G中预测的半胱天冬酶识别序列实际上可以被一种或多种酶识别的可能性，³⁵S标记的p28转录翻译产物在体外与增加浓度的caspase-1（ICE）或caspase-3（CPP32）孵育(Nicholson等人，1995年)，并在SDS-PAGE后对产物进行检测（图。​（图55 一个). 在广泛的酶浓度范围内，观察到caspase-3几乎没有反应性。另一方面，caspase-1产生了两种产物（表示为一和b在图中。​图55 一个)其在SDS凝胶中的表观尺寸（分别为～27和～20 kD）与AAVD/G位点发生的解理一致。值得注意的是，p28对caspase-8（FLICE）的裂解比caspase-1（ICE；图。​图55 B类).

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图5

caspase-1体外切割p28(内燃机)和半胱天冬酶-8(FLICE公司)但不是caspase-3(清洁石油产品23). (一个)³⁵p28 cDNA的S标记转录-翻译产物与增加浓度的CPP32或ICE孵育，产物通过SDS-PAGE进行解析(Nicholson等人，1995年). 每25μl反应混合物中添加的酶单位为：无（lane1)，0.0056（车道2)，0.98（车道三)，1.95（车道4)，3.9（车道5)，7.8（车道6)，15.6（车道7)，31.2（车道8)，62.5（车道9)和125（车道10). 显示了多肽分子质量标记的位置。指定的箭头一和b表示解理产物，其大小与p28在以下位置的解理一致一和b在图底部的示意图中(B类)与中的分析相同一个，但p28与纯化的ICE或FLICE孵育，并使用磷光成像仪对产生的p20裂解产物进行定量。1 U半胱氨酸天冬氨酸酶活性相当于25°C饱和底物浓度下每分钟从荧光四肽-AMC中释放1 pmol氨基甲基香豆素(Nicholson等人，1995年).

在被19K缺陷型腺病毒感染而诱导凋亡细胞死亡的细胞中，也观察到两个p28裂解产物，其大小与体外观察到的相似（图。​（图6）。6). 在图中。​图66 一个用鸡体内培养的抗体对p28蛋白的两个区域进行分析，这两个区域分别是：p28氨基酸122–164（αp28-M）和165–246（αp28–C）。用αp28-M而不是αp28-C检测到裂解产物，这一发现与肽序列分析的建议一致，即p20裂解产物来自NH₂p28的终点（图。​（图2）。2). αp28-C也未能检测到两种切割产物中较大的一种（指定为一在图中。​图66 一个)尽管预计该产品与注射到鸡体内的序列重叠。推测，这意味着p28的极端八个氨基酸对该抗体的表位识别至关重要。最后，从凋亡细胞提取物中提取蛋白质电泳印迹，沿着蛋白通道的垂直中线切开一半，一半用αp28-M探测，另一半用αp28-M探测³²P-Bcl-2Δc21/his6/HMK。Bcl-2探针检测到的p20与αp28-M免疫印迹检测到的p20精确迁移（未显示）。

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图6

体内细胞凋亡过程中p28切割和procaspase-3（pro-CPP32）处理的诱导。(一个)从感染腺病毒60小时的KB细胞中提取细胞提取物下午1716/2072缺乏E1B 19K表达或被模拟感染(+或−细胞凋亡）。在12%的SDS-PAGE并转移到硝化纤维后，用亲和纯化的鸡抗p28氨基酸165-246抗体孵育印迹(αp28-C)或p28氨基酸122–164(αp28-M)并用与HRP偶联的第二抗体开发，并通过电化学发光进行可视化(阿默沙姆国际，伊利诺伊州阿灵顿高地）(αp28-M)或碱性磷酸酶，用NBT/BCIP可视化(博林格曼海姆生物化学公司，印第安纳州印第安纳波利斯）(αp28-C)，根据制造商的说明。显示了与p28对应的频带。标记的箭头一和b表示其大小与p28在指定位置的解理一致的产品一和b在示意图中。(B类)单独表达新霉素耐药性的KB细胞(减去Bcl-2，条车道6–10)或与Bcl-2一起(加Bcl-2，条车道1–5)被腺病毒感染下午1716/2072缺乏E1B 19K表达和在感染后0、24、36、48和60小时制备的细胞提取物(私人股本。; 车道1和6，2和7，三和8，4和9、和5和10）。将等分样品（15μg蛋白质）进行12%SDS-PAGE，转移到硝化纤维素中，并用抗p28-M或抗CPP32 17-kD亚基的抗体检测印迹(Boulakia等人，1996年)，产品开发如所述答：。p28的位置和裂解产物一和b显示在上部面板中。箭头表示外观可变的交叉反应产品（例如，它没有出现在一个). 全长pro-CPP32和加工的17-kD亚基（p17）以及推测的29-kD加工中间体的位置(星号)显示在下部面板中。

在图中。​图66 B类用αp28-M抗体检测Bcl-2对19K缺陷型腺病毒感染细胞后p28裂解产物外观的影响。在没有Bcl-2表达的情况下，这些产物出现的时间过程与蛋白酶-3（CPP32）激活的时间过程密切相关，这是通过将原酶加工成p17催化亚基来判断的（图。​（图66 B类，条车道6–10). 然而，在表达Bcl-2的病毒感染细胞中，p28裂解和procaspase-3处理均被阻断（图。​（图66 B类，车道1–5).

我们感谢Robert MacKenzie、John Bergeron、Jerry Pelletier、Anne Claude Gingras、Jose e Dostie和Jose e Lavoie的讨论和技术建议。