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EMBO J。2003年10月15日；22(20): 5323–5335.
数字对象标识：10.1093/emboj/cdg542
预防性维修识别码：PMC213796型
PMID：14532106

EZH2型是pRB-E2F通路的下游，对肿瘤的增殖和扩增至关重要

阿德里安·P·布雷肯,1 迭戈·帕西尼,1 玛丽亚·卡普拉,1,2 埃琳娜·普罗斯佩里尼,1 埃琳娜·科利,1和克里斯蒂安·赫林1,2,三
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

最近的实验表明，Polycomb组（PcG）基因EZH2型在转移性前列腺癌和淋巴瘤中高度表达。EZH2是PRC2组蛋白甲基转移酶复合物的一种成分，该复合物还包含EED和SUZ12，是沉默HOX公司胚胎发育过程中的基因表达。在这里，我们证明EZH2和EED对转化和非转化人类细胞的增殖都至关重要。此外，pRB-E2F通路严格调控其表达，与此一致，我们发现EZH2在大量人类肿瘤中高度表达。这些结果提出了一个问题，即EZH2是否是增殖的标志物，或者它是否真的有助于肿瘤的形成。重要的是，我们建议EZH2型是一个真正的癌基因，因为我们发现EZH2的异位表达能够为原代细胞提供增殖优势，并且其基因位点在一些原发性肿瘤中特异性扩增。

关键词：E2F/EED/EZH2/多梳/pRB

介绍

视网膜母细胞瘤蛋白（pRB）通路在调节哺乳动物细胞周期的进展中起着关键作用。在人类肿瘤中，这种途径的核心成员发生了高频率的改变，这表明其失活是所有人类癌症发展的必然事件(哈纳汉和温伯格，2000年). pRB最受研究和理解的靶点是E2F转录因子家族的成员(戴森，1998). E2Fs对许多基因的转录调控至关重要，这些基因的产物控制细胞周期的进展。其中包括进入细胞周期S期所必需的两个基因，例如CCNE1公司（细胞周期蛋白E1）和CCNA2号机组（细胞周期蛋白A2）和参与DNA复制调控的基因，如CDC6型,DHFR公司和TK1型(赫林，1998;Trimarchi和Lees，2002年).

最近，包括我们在内的一些实验室已经使用基因表达谱和ChIP分析来鉴定新的E2F调节基因(米勒等., 2001;魏因曼等., 2001,2002;任等., 2002). 由于E2F在控制细胞增殖关键调控因子的表达方面起着关键作用，因此很可能在这些已确定的基因中有几个新的细胞增殖关键调节因子。这些特征的描述对于理解正常增殖控制及其在癌症中的放松管制至关重要。

多梳群（PcG）基因的鉴定，Zeste Homolog 2增强剂(EZH2型),胚胎外胚层发育(EED公司)和Zeste抑制12(SUZ12型)因为潜在的E2F目标是我们屏幕上最有趣的发现之一(Müller等人，2001年). PcG基因最为人所知的是其在维持HOX公司发育过程中的基因（有关综述，请参阅Brock和van Lohuizen，2001年;Jacobs和van Lohuizen，2002年). 人们认为PcG蛋白通过形成多蛋白复合物发挥作用，通过改变染色质结构，抑制靶基因的表达。两种不同的PcG蛋白复合物，Polycomb抑制复合物（PRC）1和PRC2已在遗传学和生物化学上定义(Jacobs和van Lohuizen，2002年). 有趣的是，三个潜在的E2F调节的PcG基因，EZH2型,EED公司和SUZ12型构成PRC2复合体(曹等人，2002;Czermin等人，2002年;库兹米切夫等人，2002年;Müller等人，2002年). PRC1含有其他几种PcG蛋白，包括癌基因BMI1、HPC、HPH2和SCML(Jacobs和van Lohuizen，2002年). 在功能上，EZH2是PRC2的催化活性成分，能够使组蛋白H3的赖氨酸9（H3K9）和赖氨酸27（H3K27）甲基化(Cao等人，2002年;Czermin等人，2002年;库兹米切夫等人，2002年;Müller等人，2002年). 有趣的是，PRC1复合物的HPC2可以与甲基化的K27特异结合(曹等人，2002;Kuzmichev等人，2002年). 结合之前的证明，如果没有功能性PRC2，PRC1就不能与染色质结合，这表明EZH2的K27甲基化导致PRC1的募集和随后的转录抑制。

这里，我们证明了两个PRC2成员EZH2和EED的表达受E2F转录因子控制。我们证明EZH2和EED是细胞增殖所必需的，是E2F功能的重要下游介质。此外，我们发现EZH2在原发性人类肿瘤中高度表达和扩增，并且EZH2的异位表达在原代小鼠胚胎成纤维细胞中具有生长优势。因此，除了识别EZH2型作为一个强大的候选癌基因，我们的数据提供了pRB-E2F生长控制途径和由重要PcG复合体调节的染色质修饰之间的直接联系。

结果

pRB-E2F通路调节EED和EZH2的表达

此前，我们鉴定了三个PRC2基因EZH2型,EED公司和SUZ12型在肿瘤细胞系U2OS中E2F过度表达诱导(Müller等人，2001年). 为了确定这些基因是否是E2F功能的相关生理靶点，我们进行了如下所述的一些实验。

首先，为了确定E2F是否也能够在非转基因细胞系中诱导PRC2基因，在WI38人二倍体成纤维细胞中进行了northern blot分析。该分析表明E2F1–3的激活显著增加了三个PRC2基因的水平（图1A） ●●●●。这种上调是在缺乏从头开始蛋白质合成。为了测试PRC2基因被诱导的机制，我们使用了E2F1的特定突变体（图1B） ●●●●。通过western blotting测定所有融合蛋白的表达水平（图1C） ●●●●。一个DNA结合突变体E2F1（E132）和一个反式激活域突变体E2F1（1-374）不能诱导PRC2基因。然而，E2F1的TA和pRB结合域被另一转录因子VP16的TA取代的突变体能够诱导PcG基因。这些结果表明，E2F介导的PRC2基因反式激活需要功能反式激活和DNA结合域。

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图1。的表达式EZH2型和EED公司由E2F和pRB调节。(A类)Northern印迹分析EZH2型,EED公司,SUZ12型和CCNE1公司WI38成纤维细胞表达ER-E2F1、ER-E2F2或ER-E2F3，在OHT和环己酰亚胺（CHX）存在（+）或不存在（-）的情况下生长。在添加4-羟基三苯氧胺（OHT）和/或CHX后的指定小时提取mRNA。(B类)如A组所述，使用表达ER-E2F1突变体的WI38进行Northern blot分析。(C类)表达ER-E2F融合蛋白的WI38的Western blot分析。(D类) EZH2型和EED公司pRB抑制表达。实时定量PCR（qPCR）用于测定U2OS细胞pRbΔcdk诱导后的相对mRNA表达水平。(E类)EZH2型和EED公司表达受到p16的抑制。qPCR用于确定p16过度表达的影响。(F类) 鄂尔多斯2表达式在中被取消按下卢比–/–MEF。qPCR用于确定鄂尔多斯2,伊德,抄送1和抄送2pRb缺乏型和野生型（WT）非同步生长型（AS）和血清缺乏型（G0)MEF公司。(G公司)的表达式EZH2型和EED公司细胞生长受到调节。将WI38细胞血清饥饿72 h，通过添加血清重新刺激进入细胞周期。在指定的时间点制备mRNA用于northern blot分析。面板顶部显示了碘化丙锭（PI）FACS分析。(H（H）)EZH2和EED蛋白受细胞生长调节。类似于（C）所述的IMR90细胞生长实验中制备的细胞裂解物的Western blot分析。PI FACS分析显示在面板顶部。

接下来，我们进行了实验，以确定E2F的两个上游调节因子pRB和p16的表达是否受到影响EZH2型和EED公司转录。pRbΔcdk和p16的表达导致E2F活性的抑制和随后的细胞周期阻滞(Jiang等人，1998年;Lukas等人，1999年). 为了避免这种细胞周期停滞对转录的二次影响，在观察到细胞周期进展的可测量变化之前采集细胞（数据未显示）。在U2OS细胞中，pRbΔcdk和p16的表达导致显著抑制EZH2型并且在较小程度上，EED公司mRNA水平（图1D和E）。此外鄂尔多斯2部分伊德Rb–/–小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）与野生型MEF相比增加（图1F） ●●●●。综上所述，这些数据表明EZH2型和EED公司是pRB-E2F途径的生理靶点，如在人类癌症中经常观察到的那样，解除该途径的调控将导致EZH2和EED水平升高。

EZH2和EED的表达仅限于生长中的细胞

在分化的细胞中EZH2型和EED公司被下调。然而，它们的表达不受细胞周期调控（参见附录图1，网址：欧洲分子生物学组织在线）。因此，要确定EZH2型和EED公司在细胞生长受到调节的情况下，将WI38细胞血清饥饿3天，然后通过添加血清重新刺激进入细胞周期。如图所示1G、 两者都有EZH2型和EED公司mRNA转录物强烈调节细胞生长，并在G1/S转换与E2F细胞生长调节基因一致。Western blot分析表明，EZH2和EED的蛋白质水平也受到强烈的细胞生长调节（图1H） ●●●●。使用针对全长小鼠EED蛋白产生的单克隆抗体识别出至少两种特定形式的EED（图1H） ●●●●。慢迁移形式可能是EED蛋白的修饰形式，因为EED公司也产生了这种缓慢的迁移带（图4C） ●●●●。此外，在特定EED siRNA作用下，这两条带的强度都降低了（图三B） 确认抗体的特异性。需要进一步研究来了解这种迁移较慢的改良EED蛋白的性质。值得注意的是，只有快速迁移的EED形式受到强烈的细胞生长调控。

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图3。EZH2和EED对正常细胞和癌细胞的增殖都至关重要。(A类)siRNA对TIG3成纤维细胞EZH2表达的特异性抑制。TIG3细胞转染H2O（模拟）、荧光素酶siRNA寡核苷酸（GL3）和特异性寡核苷酸EZH2型mRNA。转染后44 h制备细胞裂解物，western blot检测EZH2蛋白水平。(B类)siRNA对U2OS细胞中EZH2和EED表达的特异性抑制。用所示的siRNA寡核苷酸转染细胞，并在转染24和48小时后制备细胞裂解物进行western blot分析。(C类)抑制EZH2和EED表达会导致细胞形态改变和生长缓慢。siRNA转染48小时后拍摄TIG3（成纤维细胞）和U2OS细胞的代表性照片。(D类)EZH2和EED表达的抑制导致生长减慢。给出了EZH2、EED和模拟siRNA处理U2OS的生长曲线。生长曲线一式三份，是三个独立实验的代表。(E类)siRNA至EZH2型导致EZH2水平降低和DNA合成抑制。转染BJ1细胞后44h用免疫荧光法测定EZH2蛋白水平和BrdU掺入量。(F类)E2F诱导的增殖需要EZH2和EED。在无血清的情况下，用mock、EZH2和EED siRNA处理表达ER-E2F3的U2OS细胞36小时。加入OHT 14 h，在BrdU脉冲10 min后，通过BrdU FACS测定E2F3过度表达的生物学效应。

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图4。EZH2异位表达导致G缩短1延长了主MEF的寿命。(A类)EZH2和EED的异位表达增加了S期细胞的数量。将表达EZH2或EED的pCMV质粒注射到缺乏血清、静止的Rat1细胞。注射E2F1的细胞作为阳性对照。在45分钟BrdU脉冲之前，将血清添加到缺乏血清的注射细胞中14小时。通过免疫荧光评估BrdU掺入来测定相对DNA合成。给出了五个独立实验中的一个代表性实验。(B类)EZH2异位表达导致S期积聚。用PI-FACS转染HeLa细胞48小时后，测定转染所示质粒后细胞周期的时相。(C类)HeLa细胞的Western blot分析显示野生型和突变型EZH2蛋白的表达相似。(D类)野生型EZH2的表达，但不是SET域突变体，允许初级MEF在低密度下形成菌落。原发性MEF感染了表达所示蛋白的逆转录病毒载体。所示实验是使用不同MEF制剂的五个独立实验的代表。(E类)在集落分析前后，对感染指示逆转录病毒载体的MEF进行Western blot分析。

E2F交易私有化并约束EED和EZH2发起人

为了研究E2F调节EZH2型和EED公司，我们在NCBI数据库中确定了他们的发起人。对两个启动子序列的检查表明，它们每个都包含至少两个潜在的E2F DNA结合位点（图2A） ●●●●。所示的启动子克隆到荧光素酶报告子结构中，对E2F1、E2F2和E2F3的异位表达有反应，但对E2F1的E132 DNA结合突变体没有反应（图2A） ●●●●。EZH2启动子截短版本的产生表明，去除四个潜在的E2F DNA结合位点使启动子对E2F1的异位表达无反应（图2B） ●●●●。为了确定EZH2启动子中的这些E2F响应元件是否是其细胞生长调节所必需的，将EZH2-启动子构建物转染Rat1细胞，然后通过添加血清诱导其进入细胞周期。如图所示2C、 最长的EZH2启动子结构由E2F有效地反式激活，在进入细胞周期时被诱导，与细胞生长调节的表达一致EZH2型mRNA。相反，EZH2启动子结构缺乏假定的E2F结合位点，对血清添加没有反应，这表明EZH2型的细胞生长调节依赖于E2F。有趣的是，在静止细胞中，较短结构的活性约为较长启动子结构的四倍，这表明E2F DNA结合位点也需要用于有效抑制非生长静止细胞中的转录（数据未显示）。作为E2F在调节EZH2型和EED公司表达，使用E2F3和E2F4特异性抗体进行定量染色体免疫沉淀（ChIP）分析。如图所示2D、 E2F3和E2F4与EZH2和EED启动子结合，表明EZH2和EED启动子是E2F转录因子的直接靶标体内值得注意的是，E2F3在S相富集最大，而E2F4在G相富集最强0.

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图2。E2F与EZH2和EED启动子结合以调节其表达。(A类)E2F激活EZH2和EED启动子。EZH2和EED启动子对应的基因组区域示意图。中的黑盒EZH2型启动子代表四个推测E2F位点的区域，而EED启动子中的两个圆圈分别代表一个推测的E2F DNA结合位点。+1代表NCBI数据库中最长鉴定cDNA中最多的5′核苷酸。启动子构建体上的数字是相对于+1。在293T细胞中用pCMVE2F1、pCMVE2F2、pCMVE2F3或pCMVE2F1（E132）DNA结合突变体共转染的EZH2和EED启动子构建体的萤光素酶报告子分析。(B类)EZH2启动子中E2F DNA结合位点的描述。用所示荧光素酶报告基因构建物和不同浓度的pCMVE2F1和pCMVE_2F1（E132）转染U2OS细胞。(C类)EZH2的细胞生长调节表达需要E2F。用指示的EZH2启动子转染Rat1细胞，血清饥饿48小时，然后通过添加血清释放到细胞周期中。联合转染表达β-半乳糖苷酶的质粒，以使荧光素酶活性正常化，从而提高转染效率。折叠激活指的是空pCMV转染。平均值的标准偏差显示在每个实验中。(D类)血清饥饿TIG3成纤维细胞E2F3和E2F4染色质免疫沉淀（G0)生长（AS）和血清释放细胞处于S期（S）。

EZH2和EED对正常细胞和癌细胞的增殖都是必需的，并且在过度表达时具有增殖优势

测试是否EZH2型和EED公司双链RNA干扰寡核苷酸（siRNA寡核苷酸EZH2型和EED公司如图所示三A、 siRNA至EZH2型特异性阻止TIG3二倍体人成纤维细胞中EZH2的合成。在U2OS细胞中也观察到EZH2和EED几乎完全耗尽（图三B） 和HeLa细胞（数据未显示）。

EZH2和EED缺失的细胞似乎比具有衰老样表型的对照转染细胞大。转染培养物的检查表明，缺乏EZH2和EED导致增殖减少（图三C） ●●●●。通过测量转染细胞的增殖率来量化这种效应（图三D） ●●●●。EZH2或EED表达降低导致U2OS细胞的细胞增殖受到强烈抑制。在其他转化细胞（如HeLa和SAOS2）以及二倍体成纤维细胞TIG3、WI38和HEL299（数据未显示）中也观察到类似的生长速度降低。

为了了解哺乳动物细胞周期中的特定点是否需要EZH2和EED，用EZH2-siRNA或对照siRNA转染人类二倍体BJ1细胞，并在转染后48 h测量BrdU掺入量（图三E） ●●●●。虽然在模拟转染细胞中很容易检测到EZH2，但在接受EZH2-siRNA的细胞中未检测到EJH2表达。此外，与EZH2-和EED都是细胞增殖所必需的概念一致，转染EZH2-EED siRNA的细胞停止了DNA复制（图三E） ●●●●。在U2OS和HeLa细胞系中也获得了类似的结果（数据未显示）。此外，FACS分析表明，所有转染siRNA到EED或EZH2的细胞株都随着G细胞数量的增加而停止增殖1，G2或两者（数据未显示），表明EZH2和EED都是进入和进展细胞周期S期所必需的。

为了评估E2F诱导的细胞增殖是否需要EZH2和EED，我们建立了一种检测方法，在该方法中，人类细胞中E2F的激活增加了S期细胞的数量。为此，我们将表达ER-E2F3的U2OS细胞从血清中去除36小时，导致合并BrdU的细胞数量减少2倍（图三F；数据未显示）。在这些条件下，E2F3激活14小时导致纳入BrdU的细胞数量增加2倍。值得注意的是，这种增加依赖于EZH2和EED，这表明这两个基因都是E2F诱导增殖的重要下游介质。

由于EZH2和EED siRNA缺失的细胞停止DNA复制，我们希望确定PRC2蛋白是否可以加速生长停滞释放的细胞进入S期。为了测试这一点，我们将EZH2和EED表达质粒微注射到静止的Rat1细胞中（图4A） ●●●●。随后将这些细胞从血清饥饿状态释放出来，并监测其进入S期。在这些实验中，E2F1被用作阳性对照。三个独立实验的代表性例子如图所示4A、 并证明EZH2和EED的过度表达缩短了G0/G公司1-S过渡。与此结果一致，HeLa细胞中EZH2和EED的过度表达导致S期细胞数量增加（图4B） ●●●●。值得注意的是，EZH2的这种效应需要一个功能性SET域。western blot分析证实EZH2、EED和EZH2-ΔSET的过度表达（图4C） ●●●●。

接下来，我们希望确定EZH2的异位表达是否会给原代细胞带来生长优势。众所周知，在低密度电镀时，原电池会发生G1逮捕(Sherr和DePinho，2000年). 然而，pRB家族所有三个成员的缺失、p53或ARF的失活或致癌基因（如MYC）的过度表达可以使这些细胞继续生长(贝尔等., 2000;圣人等., 2000;Sherr和DePinho，2000年). 为了在本试验中检测EZH2，我们用表达EZH2.、EZH2-ΔSET和MYC的逆转录病毒载体感染原发性MEF作为阳性对照。感染细胞以低密度镀膜，生长14天，然后用结晶紫染色。实验前后EZH2的表达水平均得到控制（图4E） ●●●●。如图所示4D、 EZH2的表达，像MYC一样，允许大量细胞形成集落。值得注意的是，EZH2需要一个功能性SET域来实现这种生物效应。对形成的菌落进行挑选和传代，以确定其特征。这些细胞生长非常缓慢，表明它们不是不朽的，因此在本试验中EZH2和MYC没有作为不朽致癌基因发挥作用。事实上，在接受测试的菌落中，所有菌落都含有功能性p53通路，如紫外线照射后p53和p21的积累所示（数据未显示）。因此，总之，EZH2的过度表达，如MYC(贝尔等., 2000)缩短G1细胞周期的阶段，导致细胞在细胞周期的S阶段积累，并在原代MEF中体外表达时赋予增殖优势。

EZH2在人类癌症中高度表达和扩增

因为我们的数据表明EZH2型赋予生长优势，并且先前的结果表明，由E2Fs调节的基因子集在癌症中过表达，我们测试了EZH2型mRNA在原发性人类肿瘤中的表达就地杂交（ISH）。我们评估了EZH2型中的表达式就地使用0-3分制进行分析，其中0=阴性染色强度，1=弱染色强度，2=中等染色强度，3=强染色强度。大多数正常非肿瘤组织呈阴性或弱染色。相比之下，共有34%（156/454）的分析肿瘤样本表现为中等/强EZH2型表达水平。因此，我们认为EZH2型在这些肿瘤中被“高度表达”。这些数据表明EZH2型在人类肿瘤中过度表达的比例高于先前的想象。值得注意的是，我们没有观察到EZH2型分析了25例原发性前列腺癌，这可能与最近发表的一篇文章相矛盾，该文章表明EZH2过度表达与转移性前列腺癌的侵袭性相关(Varambally等人，2002年). 然而，我们不这么认为，因为在分析的25个样本中，我们没有发现任何转移性前列腺癌，而且大多数样本的增殖指数较低（Ki67 IHC评估的增殖指数<10%）。

由于pRB通路控制EZH2的表达，并且该通路在人类肿瘤中被解除调控EZH2型在肿瘤中观察到的可能只是由于pRB通路核心成员的特定基因改变。另外，一些E2F调节基因如CCNE1公司(Lin等人，2000年),第二个多年电价（B-MYB；Kononen等人，1998年)和MYB公司(Wallrap等人，1997年)，高度表达EZH2型可能是基因位点扩增的结果。因此，要确定EZH2型在原发性人类肿瘤中扩增，我们分离出一个含有EZH2型位于染色体7q35上(Cardoso等人，2000年). 荧光标记的BAC克隆与7号染色体着丝粒区的特异探针一起用于组织微阵列上的FISH分析（图5C） ●●●●。除两例外，我们共观察到7号染色体着丝粒区域的两个拷贝（数据未显示）。值得注意的是，在所分析的225个肿瘤中，约15%的肿瘤（图5D） 我们观察到EZH2型（定义为每个肿瘤超过四个拷贝）（图5C、 顶部面板）或紧密的信号簇（图5C、 中间面板）。提交了几个案例，其中有8-10份EZH2型每个细胞的基因（图5C、 顶板；数据未显示）。在最近的一份报告中，研究人员测定了几种原发性乳腺癌的基因表达谱和基因拷贝数，发现DNA拷贝数和转录水平之间有很强的相关性(Pollack等人，2002年). 特别是，这些作者发现，DNA拷贝数的平均2倍变化与mRNA水平的1.5倍变化相关。因此，我们的FISH结果表明，EZH2在所分析的乳腺肿瘤中过度表达3到8倍，这与我们的mRNA ISH分析一致。非常重要的是，我们发现所有肿瘤的DNA拷贝数都增加了EZH2型也在mRNA水平上过度表达该基因。综合起来，我们的数据表明EZH2型在大量人类癌症中高度表达，并且，至少在这些病例的一个子集中，高水平的表达可能是由于EZH2型基因。

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图5。EZH2在人类原发肿瘤中高度表达和扩增。(A类)EZH2在原发性乳腺肿瘤中高表达。通过TMA上的ISH测定EZH2 mRNA的表达水平。左侧面板显示了ISH的典型示例EZH2型乳腺癌TMA。从每个肿瘤（T）和正常（N）对应物中取两个样本进行TMA。亮场面板显示了苏木精和曙红复染显示的组织样本的形态。暗场面板显示了ISH对EZH2型乳腺浸润性导管癌和正常乳腺中的表达水平。在面板中，数字表示：1、基质；乳腺上皮细胞；肿瘤组织；4、EZH2表达细胞。(B类)EZH2在大量人类原发肿瘤中高度表达。的汇总表EZH2型测试TMA的表达。(C类)原发性肿瘤的亚组显示EZH2型基因（顶部和中间面板）。肿瘤TMA的FISH分析EZH2型基因拷贝数。这两个面板显示了两个具有代表性的乳腺癌组织，其中EZH2型. TheEZH2型特异探针用Cy5标记，7号染色体着丝粒探针用FITC标记。由于FITC探针的快速褪色和对每个TMA的相对较长的显微镜分析，我们能够计数，但无法拍摄几个分析样品的着丝粒特定染色的照片。（C，下面板）包含正常拷贝数的乳腺肿瘤组织示例EZH2型对同一TMA上的一个无关基因（HECTH9）进行的FISH分析显示，在所有测试样本中没有扩增（数据未显示）。(D类)的汇总表EZH2型测试TMA的副本号。

增殖基因的表达需要PRC2

鉴定PRC2成员的靶基因对于确定其促进正常细胞和癌细胞增殖的机制至关重要。以前，研究表明，PRC1的一种成分Bmi1通过抑制细胞增殖第19页ARF(第14页ARF人类）(Jacobs等人，1999年). 由于PRC2复合体被认为是PRC1复合体抑制能力所必需的，我们推断PRC2复合体也可以抑制p14ARF基因因此，我们测试了EED或EZH2的消耗是否导致第14页ARF这可以解释在PRC2缺失的细胞中观察到的增殖阻滞。通过实时定量PCR定量EZH2、EED、BMI1和对照GL3 siRNA处理的TIG3细胞中的相对mRNA水平（图6A） ●●●●。正如预期的那样，在BMI1耗尽的细胞中，第14页ARF与对照GL3 siRNA转染细胞相比，该水平增加了3倍。然而，令我们惊讶的是，我们发现第14页ARFEED和EZH2 siRNA处理细胞中的mRNA水平均显著降低（图6A） ●●●●。接下来，我们将分析扩展到其他已知的细胞周期进展抑制剂，并发现p53的mRNA水平(TP53型)PRC2缺失的细胞也减少（图6A） ●●●●。此外，我们没有发现任何细胞周期素依赖性激酶抑制剂p16的表达显著增加(CDKN2A型)，第18页(CDKN2C型)，第21页(CDKN1A公司)，第27页(CDKN1B型)和第57页(CDKN1C公司)（图6B类；数据未显示）。因此，我们还测试了一些细胞增殖“阳性调节物”的表达。事实上，在EED和EZH2 siRNA-处理的细胞中，检测到的所有细胞周期蛋白的mRNA水平，即细胞周期蛋白D1(CCND1号机组)，细胞周期蛋白E1(CCNE1公司)，细胞周期蛋白A2(CCNA2号机组)和细胞周期蛋白B1(CCNB1公司)，显著减少（图6C类；数据未显示）。所有E2F-调节基因的mRNA水平测试，即MYB公司,B-MYB车型,CDC6型,E2F1系列和CDC2（CDC2），也显著减少（图6D类；数据未显示）。相反，在缺乏BMI1的细胞中CCND1号机组,CCNE1公司,C-MYB基因,E2F1系列和B-MYB型增加，与观察到的效果类似第14页ARFmRNA。

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图6。EZH2和EED是几个基因的活性转录所必需的。通过qPCR对转染EZH2、EED和BMI1特异性siRNA的TIG3细胞进行表达水平分析。(A类)p53通路成员的mRNA水平。(B类)CDK抑制剂的mRNA水平。(C类)细胞周期蛋白mRNA水平。(D类)E2F调节基因的mRNA水平。(E类)PcG基因的mRNA水平。

讨论

在这份手稿中，我们证明pRB-E2F通路控制PRC2基因的表达EZH2型和EED公司这与PRC2基因在增殖细胞中的高表达及其在非生长或分化细胞中的下调一致。此外，我们证明EZH2和EED的细胞生长调节表达依赖于E2F转录因子。两个PRC2成员都是所有受试细胞类型中细胞增殖所必需的，它们的过度表达导致S期的诱导。此外，当原代细胞受到生长抑制条件时，EZH2能够延长其生长能力。这表明EZH2可能促进肿瘤生长。最后，我们证明EZH2在多原发性肿瘤中高度表达，这与pRB通路在大多数癌症中被解除调控的事实一致。然而，我们的证明是EZH2型在10–15%的受试肿瘤中，该位点被扩增，表明EZH2过度表达的肿瘤具有特定的遗传选择，并表明EZH2型也可以独立于解除管制的pRB途径发生。

pRB-E2F通路与PRC2表达之间的功能联系

这里提出的一个主要发现是，E2F转录因子对EZH2型和EED公司结合pRB和p16的异位表达抑制其表达以及在pRB缺乏的MEF中表达更高的证据，该发现提供了pRB通路和PRC2复合物存在之间的功能联系。虽然pRB-E2F通路因其在细胞增殖和肿瘤发生的调节中的作用而广为人知，但在小鼠中获得了一些结果，果蝇属和爪蟾已经表明，这条通路的完整性对于分化和胚胎的正常发育也是至关重要的(利宾斯基和杰克斯，1999年;Myster等人，2000年;Suzuki和Hemmati Brivanlou，2000年). 我们证明pRB-E2F通路调节PRC2基因可以解释pRB和E2F参与发育调控的分子机制。

细胞增殖需要PRC2复合物

我们的结果进一步支持了pRB-E2F通路对PRC2基因的严格控制，我们的结果表明，与非增殖和分化细胞相比，增殖细胞中的EZH2和EED mRNA和蛋白质都显著增加。这些结果与以前的数据一致，这些数据表明EZH2和EED蛋白在增殖的B细胞和T细胞中高表达，但在分化的B细胞或T细胞中不表达(拉阿弗斯特等., 2000,2001). EZH2和EED在活跃循环细胞中的表达强烈表明PRC2复合体在增殖细胞中发挥生物学作用。事实上，我们证明该复合物是细胞增殖所必需的，因为EED和EZH2的特异性siRNA阻断DNA复制并阻止细胞生长。其他实验室的工作进一步支持了这一概念。福山等.（2000年）证明EZH2反义寡核苷酸抑制HL-60细胞的DNA合成，而奥卡罗尔等. (2001)推测Ezh2在控制扩散方面具有更全球性的作用。这一建议是基于EZH2缺乏小鼠在原肠胚形成期间死亡的观察结果；以旺盛生长和短细胞周期为特征的胚胎发生期。此外，从囊胚中提取ES细胞的尝试导致非ES-like细胞无法增殖。我们认为PRC2复合物是大多数（如果不是全部）细胞类型增殖所必需的。

PRC2复合物与肿瘤发生

我们的一个工作假设是，在E2F靶基因中存在尚未确定的癌基因。这一概念基于这样一个事实，即pRB-E2F通路的放松调控是人类癌症中的常见事件，并且一些E2F靶基因如CCNE1公司,MYB公司和第二个多年电价是真正的致癌基因(Wallrap等人，1997年;Kononen等人，1998年;Lin等人，2000年). 在此，我们扩展了先前的观察结果，并表明EZH2在多种人类癌症中高度表达，不仅在前列腺癌和淋巴癌中表达(Visser等人，2001年;Varambally等人，2002年). 此外，我们已经证明了这一点EZH2型在10–15%的受试原发肿瘤中被扩增，这强烈表明它有助于肿瘤的形成，而且它不仅仅是增殖的标志物。我们的发现进一步支持了这一建议，即EZH2的异位表达缩短了G1在原发性MEF中具有增殖优势。根据这些发现，我们建议EZH2型应该被认为是一个很强的候选癌基因。为了进一步验证这一点，我们目前正在生成在特定组织中过度表达EZH2的转基因小鼠，从而建立一个比成纤维细胞更相关的肿瘤发生研究模型。

最近发现SUZ12在子宫颈子宫内膜肉瘤中经常被发现为融合蛋白，这支持了PRC2复合物放松调控可能导致癌症的概念(孔茨等., 2001). 尽管作者没有证明融合蛋白是肉瘤发生的诱因，但发现该融合蛋白的频率较高，再加上肿瘤发生中染色体易位的频率相对较低，强烈提示该融合蛋白对肉瘤的发生有重要作用。这些发现以及本文中的结果表明，导致PRC2活性放松调节的特定基因改变是癌症的常见事件。

PRC2复合分子作用机制与靶基因

为了了解PRC2复合物调节增殖的潜在机制，我们测试了一些潜在的靶基因。有趣的是，EED或EZH2表达的缺失并没有导致细胞周期中一些负调控因子水平的增加，包括第14页ARF然而，我们发现几个E2F调节基因的表达，包括G1/S表达的细胞周期蛋白在缺乏EZH2和EED的细胞中显著降低。

我们推测，PRC2复合物可能是激活或维持这些基因激活状态所必需的。与此相反的是来自果蝇属表明PcG基因突变导致发育中胚胎中同源异型（Hox）基因异位或表达增加(Jacobs和van Lohuizen，2002年). 由此推断，PcG的功能是抑制或维持靶基因的抑制。然而，强烈的温度敏感性E（z）中的突变果蝇属证明E（z）的缺乏导致某些Hox基因的水平增加，但显著地导致其他基因的表达缺失(LaJeunesse和Shearn，1996年). 因此，作者推测E（z）也可能在维持某些基因的激活转录状态中发挥作用。这些观察结果被同一组人扩展，表明包括E（z）在内的几个PcG基因可以增强TrxG突变体的表型(Gildea等人，2000年). 基于这些结果，作者建议将这组新基因命名为“三胸和多梳增强基因”或ETP（综述于Brock和van Lohuizen，2001年). 因此，这些有趣的结果增加了EZH2和EED也可能在维持某些靶基因的激活状态中发挥作用的可能性。从机理上讲，我们认为PRC2复合体通过其甲基化组蛋白H3上的K27的能力，是激活或维持增殖细胞中某些基因激活状态所必需的。由于EZH2和EED的耗竭导致潜在靶基因（如E2F调节基因）的下调，因此需要PRC2复合物的持续存在来维持这种激活状态。生长细胞中活跃的PRC2靶基因随后可通过PRC1与K27甲基化组蛋白H3的结合在分化细胞中被抑制。与此一致，Dahiya等人（2001年）研究表明，PRC1成员HPC2与某些E2F调节基因结合，与诱导退出细胞周期的细胞中的pRB相关。然而，为了进一步研究这个新概念，有必要确定H3K27甲基化是否与活性转录基因相关。此外，还需要进一步的研究来证明PRC2成员在活性转录基因的启动子上的存在，或者证明PRC2蛋白的组蛋白甲基化在转录激活或维持激活中发挥作用。

总之，我们提出了一个模型（图7)其中PRC2基因的转录由生长因子通过pRB-E2F途径控制。pRB-E2F通路最具特征性的是其在控制细胞增殖中的作用，其放松调控通常有助于肿瘤的发生。相比之下，PRC2复合体直到最近才主要在功能上与发育控制相关。因此，这项工作的意义是多方面的。首先，我们认为PRC2复合物对pRB-E2F通路下游的增殖控制也至关重要。值得注意的是，它的放松管制似乎可能导致癌症。其次，E2F和pRB在控制胚胎发育中的作用可能与它们调节PRC2复合体丰度的能力有关。

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图7。pRB通路和PRC2复合物协同作用的模型。有关详细信息，请参阅讨论。

材料和方法

定量聚合酶链反应

cDNA是使用PE Applied Biosystems TaqMan®逆转录试剂通过RT-PCR生成的。使用SYBR Green I检测化学系统（Applied Biosystems Foster City，CA），使用ABI Prism 7700序列检测系统测定反应。GAPDH被用作标准化的对照基因。使用的引物序列可根据要求提供。

微量注射

将Rat1细胞在无血清的DMEM中培养48小时。然后使用蔡司自动注射系统直接向细胞核微量注射50 ng/µl的指示表达质粒和2 ng/¦Μl的兔IgG（Jackson Laboratories）。注射后，通过添加DMEM和10%的血清刺激细胞重新进入细胞周期。14h后将BrdU（100µM）添加到培养基中40 min，然后在4%多聚甲醛/PBS中固定并随后进行免疫荧光染色。

染色质免疫沉淀分析

如前所述，进行染色质免疫沉淀并进行基本分析(弗兰克等., 2001). 使用的抗体是抗E2F3（sc-878；Santa Cruz）、抗E2F4（sc-866）和抗Flag（F3165；Sigma）。通过实时qPCR对模拟沉淀DNA进行定量。PCR引物的序列可根据要求提供。

荧光素酶报告分析

将293T和U2OS细胞转染在6孔培养皿中，每孔50 ng pCMVβ-Gal质粒和100 ng报告构建物。不同的E2F结构体在图中所示的浓度下进行共转染。使用FuGene（Roche）转染试剂，将RAT1细胞与0.4µg pCMVβ-Gal和1.6µg报告构建物共同转染在10 cm培养皿中，同时按照上述方法进行血清饥饿和释放。

siRNA干扰

Dharmacon Research设计了靶向EZH2、EED和BMI-1 mRNA的特异性siRNA寡核苷酸。Dharmacon Research合成了几个寡核苷酸序列，其中最有效的寡核苷酸为：EZH2、AAGACTCTGAATGCAGTTGCT；EED、AAGCACTATGTGGCCATGGA；和BMI1，AAGGAATGGTCCACTTCCATT。还合成了靶向荧光素酶基因的非特异性寡核苷酸（GL3）。使用寡聚体胺（Invitrogen）转染细胞，并在指定的时间点采集用于qPCR和western blot分析的样本。

MEF菌落分析

初级MEF是从胚胎发生期间第13.5天采集的129、C57/Bl6或129-C57/Bl6胚胎的混合背景中制备的。所得结果与MEF的遗传背景无关。早期传代MEF感染了指示的逆转录病毒载体。感染细胞在100 mm培养皿中以低密度（10000个细胞/皿）传代和培养，培养基每3-4天更换一次。2周后，用结晶紫染色法检测菌落形成能力。

肿瘤材料和组织芯片（TMA）构建

460个福尔马林固定和石蜡包埋的人类肿瘤样本用于构建五种不同的TMA（见图6如前所述(科诺宁等., 1998). 对于每个肿瘤样本，从肿瘤和正常对应组织中取两个0.6 mm的圆柱体。

ISH与免疫组织化学

EZH2型用ISH评估mRNA表达[35S] UTP标记的正、反义核糖探针。ISH的执行如前所述(Rugarli等人，1993年). 对载玻片进行轻微的H&E复染，并使用暗场冷凝器对银颗粒进行分析。探针的序列可根据要求提供。对于Ki67免疫染色，将TMA切片放置在95°C的0.25 mM EDTA中50分钟，用于抗原检索，并与抗Ki67单克隆抗体克隆MIB1（1:200，Immunotech，Westbrook，ME）孵育3小时。使用EnVision Plus/HRP检测系统（Dako）和二氨基联苯胺作为显色底物显示结合抗体。用苏木精对组织进行复染。

荧光ISH

定位于7q35-q36的BAC克隆RP11-731B4包含EZH2型分别用Cy3-dUTP和FluorX-dCTP（Amersham Pharmacia Biotech）标记人类7号染色体着丝粒区特异的基因位点和alphoid探针pZ75。杂交特异性首先在正常人棕色皮毛中期染色体传播中得到控制。如前所述，BAC克隆和Cr.7着丝粒探针在TMA上共杂交(Andersen等人，2002年).

补充数据

补充数据可在欧洲分子生物学组织在线。

致谢

我们感谢丹尼尔·皮奇尼（Daniele Piccini）生成抗EED抗体，艾玛·希克曼（Emma Hickman）帮助进行MEF分析，艾曼纽拉·弗里托利（Emmanuela Frittoli）帮助进行微注射实验，曼努埃拉·内布洛尼（Manuela Nebuloni）和伦佐·博尔多里尼（Renzo Boldorini）提供肿瘤材料，米凯拉·夸托（Micaela Quarto）和马克·比安奇（Marco Bianchi，Eros Lazzerini-Denchi在小鼠成肌细胞分化和批判性阅读手稿方面的专业知识，Patrizia Gasparini就FISH分析提供技术建议。我们感谢Bruno Amati、Jiri Bartek、Thomas Jenuwein、Arie Otte和Liang Zhu提供了宝贵的试剂。我们感谢Maarten van Lohuizen、Pier Giuseppe Pelicci、Chris Marine和Helin实验室成员的讨论。我们感谢卢西亚诺·迪克罗斯和克莱尔·阿特沃尔对手稿的批判性阅读。这项工作得到了AIRC、FIRC、欧盟第五框架计划、意大利卫生部和人类科学前沿科学计划的资助。

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文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团