Caveolin与高尔基复合体结合的分子表征：Caveolin分子中顺-高尔基靶向结构域的鉴定

细胞培养

如前所述生长和维持BHK细胞(格伦伯格等人，1989年). 原代人成纤维细胞是D.James教授的礼物，并在补充了10%FCS的RPMI中保存。如前所述培养C2C12细胞(Way and Parton，1995年).

重组Semliki森林病毒

根据既定方案，在BHK细胞中制备重组Semliki森林病毒（SFV）-cav-1和SFV-cav-3(Liljestrom和Garoff，1991年;Olkkonen等人，1993年). 简言之，从引入5′BamHI和3′SmaI限制性位点的原始克隆中扩增出犬型和鼠型cav-1和鼠型。在对两条链进行测序后，cDNA被克隆到pSFV1的适当位点(吉布科纽约州格兰德岛）。通过pSFV-cav-1、pSFV-cav-3和pSFV-Helper1的体外转录生成RNA，并电穿孔至BHK细胞。48小时后收集培养上清液，并在−70°C下冷冻。采集用于生产重组SFV的BHK细胞，并制备用于Western blotting。cav-1的表达水平是内源性水平的10倍以上。

对于免疫荧光实验，用未稀释的含有重组SFV的培养上清液在37°C下感染细胞1小时，然后用正常培养基将感染培养基稀释10倍，再孵育12小时。Elina Ikonen（芬兰赫尔辛基国家公共卫生研究所）。

亚细胞分离

BHK细胞组分由Jean Gruenberg教授友好地提供。BHK细胞在等渗蔗糖溶液中均质，核后上清液的膜使用分级蔗糖梯度进行分离，以产生完全符合描述的富含p23和ERD2的组分(Rojo等人，1997年).

克隆和表达

NH系列₂-通过PCR从原始cDNA克隆中获得了cav-3的末端截短突变体。洞穴3^DIH公司（残留物16-151），Cav3^NED公司（残余物33–151），Cav3^DGV公司（残留量54–151）和Cav3^{肯尼亚先令}分别使用5′CGGGGACCACCATGGACATTCACTGCAGAGAG 3′的正向引物DIH、5′CGG GTACCATGAATGAGGACATCTGTGGAAG 3’的NED、5′的DGG GTACCACATGGACTGTGAAG的DGV和5′的CGGGACCCATGGACGGTG的KSY生成（残基108–151），反向引物RORrev 5′CCGGAATTCTAGCCTTCCCTTCGCAGCACCTT 3′。类似地，在三个假定的COOH末端棕榈酰化位点半胱氨酸突变为丙氨酸的情况下，产生了cav-1（残基135–183）的截断。使用野生型（WT）cav-1 cDNA模板生成Cav1^{肯尼亚先令}用cav-1（Cys-Ala）cDNA模板生成Cav1^{肯尼亚先令}Δp分别使用5′CGGGGTACCACCATAGAGAGAGTTTCCTGATTGAGATCGTC3′的正向引物CAV1（KSF）和5′ATAAGAATGCGCCTCTGTTCTCTGCATGTGTGCGG 3′的反向引物CAV 1HArev 5′。将产生的突变体克隆到pCB6KXHA中(Way和Parton，1995年)是真核表达载体pCB6的衍生物，包含HA表位标签（YPYDVPDYA），位于框架内NotI位点下游。

骑士3^{肯尼亚先令}还用5′CCGGAATTCGAAGTACCTGAGAG3′的正向引物KSYGFP和5′TCCCCGGGTTAGCTCTCCCTTCGCAGCAC融合载体pEGFP-C1的反向引物CAV3rev 5′TCCC CGGGTAGCCTCCCTCCGCAGCACCC 3′扩增了该区域，用于在框架内插入COOH末端绿色荧光蛋白（GFP）融合载体(克隆技术公司实验室）。

Cav3的进一步截断^{肯尼亚先令}使用以下引物组合进行类似制备；洞穴3^IYS公司（残留物120–151）和Cav3^IRT公司（残基125–151）分别用正向引物IYS和IRT引物5′GGAATTCACTACTCACTCGC3′，反向引物CAV3rev。

利用5′CCGGAATCAATGACCGAAGAGCACGG 3′的正向引物CAV3GFP和反向引物CavΔCrev 5′TCCCCCGGGTTAAATGCAGCACAGGC 3′，产生了Cav-3（残基1–107）的COOH末端截断突变体Cav-3ΔC。同样，使用正向引物CAV3GFPfor和反向引物CAV3rev产生全长cav-3。然后将产物克隆到pBluescript（Stratagene）中，并亚克隆到pEGFP-C1中。所有构建体的序列通过使用T3和T7引物对pBluescript中的两条链进行测序来确认。

使用脂质体转染BHK、FRT、C2C12和CV-1细胞系(GIBCO巴西雷亚尔)根据制造商的说明。简而言之，细胞分别在盖玻片和10-cm培养皿上生长至约50%的汇合点，用于免疫荧光和电子显微镜，或在10-cm培养基上生长至90%的汇合处，用于生化分析。细胞用无血清培养基清洗两次，然后以每1ml Opti-MEM中1μg DNA与5μl Lipofectamine的比例转染(GIBCO巴西雷亚尔). 转染混合物在细胞上放置6小时，然后用缺乏抗生素的正常生长介质冲洗，并在固定或收获前再培养18小时。固定前，诺卡唑在37°C下以10μM的浓度治疗2小时。

粗馏分的制备

将细胞汇合皿用冷PBS洗涤两次，然后刮入含有蛋白酶抑制剂的冰镇HES均质缓冲液（0.25 M蔗糖、1 mM EDTA和20 mM Hepes，pH 7.4）。细胞通过27-G注射器传代均匀化，细胞核和未破裂的细胞通过1000℃离心去除克在4°C下保持5分钟。然后将产生的上清液在100000下离心克在4°C下保持30分钟，以将细胞质（上清液）与细胞膜（颗粒）分离。对于Western分析，使用体积为1%SDS HES或体积等于上清液体积的1%Triton X-100 HES在室温下提取颗粒10分钟，然后在10000下离心克在温度下保持5分钟，以去除不溶性物质。同样，在50 mM Tris、pH 8.0或0.1 M Na中对体积为1 M KCl的颗粒进行盐萃取₂一氧化碳_三pH 11.5，等于上清液。Triton®声波风廓线仪X-114的相位分离是通过以下方法实现的博第（1981）除了膜（100000-克颗粒）在初始溶液中再次悬浮。

西方印迹法

等量胞浆（100000-克上清液）和洗涤剂提取的微粒体膜（100000-克颗粒）在SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸。电泳蛋白转移到Immobilon膜后(Millipore公司。)使用Bio-Rad trans-blot半干式转移池。用5%脱脂干乳TBS-T（0.15 M NaCl，0.1%吐温20和20 mM Tris，pH 7.4）封闭膜，然后在1%脱脂干奶TBS-T中稀释的特定抗体中孵育。用TBS-T清洗后，用0.2%BSA TBS-T稀释的第二抗体孵育膜。使用增强化学发光检测系统检测结合抗体(Amersham公司。).

免疫荧光显微镜

细胞生长在玻璃盖玻片上，并用甲醇（−20℃，≥5 min）或3%多聚甲醛（PFA，20℃，≤20 min）固定。用0.1%（wt/vol）皂苷在PBS中渗透PFA固定细胞5分钟，并按照前面所述进行标记(Parton等人，1997年). 对于小鼠和兔抗体的双重标记，细胞与一级抗体混合物孵育30分钟，用PBS洗涤三次，并与荧光素或Cy3标记的抗鼠IgG和Cy3或荧光素标记的抗兔IgG混合物孵养20分钟。在一些实验中，用两种兔抗体（p23和抗concav）对细胞进行双重标记。这是使用以下序列进行的：抗concav，Cy3山羊抗-兔，一种阻断无关的兔抗体（抗霍乱毒素），然后是生物素化的兔抗p23，然后是链亲和素-Cy2（Monarch Medical）。省略主要抗体的对照实验显示了标记的特异性。样品用共焦激光扫描显微镜（Bio-Rad实验室）进行分析，该显微镜配备氩和氦/氖激光，用于488和543 nm的双荧光。使用63或100×平面APOCHROMAT油浸物镜依次记录荧光素/Cy2和Cy3信号（发射过滤器：BP510-525和LP590）。对于叠加，荧光素和Cy3图像被调整为类似的输出强度，并使用Power Macintosh 7500/100计算机与Adobe Photoshop 3.0.5合并为复合RGB图像。图是用Microsoft PowerPoint排列的。

通过分析双标诺卡唑处理的细胞的共焦图像来量化结肠化，在这些细胞中，个别斑点清晰可见（例如，见图。​图4）。4). 使用Adobe Photoshop的RGB功能对图像进行数字捕获和覆盖。将单独的图像调整为等效强度。然后使用IP Lab Spectrum软件分析共定位元素所占区域的图像，作为总标记区域的百分比。结果表示为五个字段±SEM的平均值。注意，该技术允许比较不同标记的重叠程度，但低估了两个标记均为阳性的实际puncta（例如，cav/p23显示63%的共定位，但>90%的puncta标记为两个标记；参见示例图。​图4）。4).

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图4

诺康唑治疗后BHK细胞中cav-1和高尔基体标记物的免疫荧光检测。用诺卡唑处理BHK细胞，使其高尔基体分散。（A） 使用针对小窝蛋白-1（cav1（FL））的商业单克隆抗体和亲和纯化的concav抗体对细胞进行内源性小窝蛋白的双重标记。这两种抗体在整个细胞内共定位。（B） 通过比较顺高尔基标记p23和表达的唾液酸转移酶（B），检测诺克唑分离高尔基标记的效率。nocodazole治疗后，内源性p23和表达的唾液酸转移酶部分分离（注意B重叠中黄色结构较少，绿色和红色点较多）。（C和D）在共焦显微镜检查之前，用cav-1（FL）和p23（C）或表达的唾液酸转移酶（D）双重标记细胞。注意，与反式标记ST.Bars 10μm相比，顺式标记p23与小凹蛋白的共定位程度更高（由更多黄点表示）。

Caveolin-1的COOH末端、Concav或纯化Caveolin的抗体定位于Cis-Golgi复合物

鉴于小窝蛋白循环的不同模型，我们试图查明小窝蛋白与高尔基复合体相关的领域。为了进行这项分析，我们使用了一种针对纯化的cav-1（抗cav1FL）的单克隆商业抗体；见图。​图44A） 与顺-Golgi标记p23(Rojo等人，1997年)或TGN标记物（转染唾液酸转移酶，tST；Rabouille等人，1995年). 我们发现，根据共焦显微镜的判断，cav-1免疫标记与TGN标记物tST在对照细胞中共定位，这与以前的研究一致；(Dupree等人，1993年)，但在p23中发现了相同程度的共定位（未显示）。因此，我们使用了微管解聚剂诺卡唑，它已被证明能破坏高尔基复合体(Kreis，1990年)并用于将蛋白质定位到不同的高尔基亚区（例如。，Chavrier等人，1990年;Ullrich等人，1996年). 诺卡唑治疗导致高尔基体标记分散到离散的点状物中（图。​（图4）。4). 用顺式（p23）和反式高尔基体（tST）标记对诺克唑处理的细胞进行双重标记，发现这两个标记明显分离，尽管不完全分离（图。​（图44B类；注意，许多punta只标记了其中一个标记）。诺卡唑治疗后，抗cav1FL与tST的共定位程度相对较低（图。​（图44D） 但与p23几乎完全同位化（见图。​图44C；几乎所有的p23泪点都是小窝蛋白阳性）。同位化水平也被量化为图像中同位化元素所占的面积占总标记元素的百分比（有关详细信息，请参阅材料和方法）。与定性数据一致，这些结果显示caveolin/p23（63±4%）的共定位程度远高于caveolin/tST（46±6%）或p23/tST（41±4%）。这表明小窝蛋白存在于高尔基早期，并不仅仅存在于TGN中。

免疫电镜进一步分析亚细胞定位。所有可用的抗体在完整细胞的超薄冰冻切片上对高尔基复合体进行低标记。然而，在富含p23和ERD2的BHK细胞组分的冷冻切片中(Rojo等人，1997年)，抗cavC标记与p23共定位于高尔基池（图。​（图5）。5). 该制剂中较高的标记可能反映了细胞溶质表位的更易接近性，如其他高尔基蛋白所述(Griffiths等人，1994年). 综上所述，结果表明，在稳态条件下，顺高尔基体中可检测到小窝蛋白。

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图5

BHK细胞高尔基组分中小窝蛋白的免疫电镜定位。根据(Rojo等人，1997年)用p23抗体进行双重标记，然后是15nm蛋白A-金和抗cavC抗体，最后是10nm蛋白A--金。两个高尔基体堆栈显示p23和caveolin（箭头）的极化标记，如放大200 nm的B.Bars所示。

Caveolin靶向突变分析：NH靶向₂-末端缺失突变体

我们研究了小窝蛋白分子的特定区域是否负责小窝蛋白定位到高尔基复合体。避免与内源性小窝蛋白相关的潜在问题(Song等人，1997年)我们制备了在BHK细胞中没有内源性表达的cav-3突变体。制备了一系列带有COOH末端HA标记的cav-3缺失突变体（见图。​图66A） 并在BHK细胞中瞬时表达。如图所示。​图6，6、C–F、NH₂-末端缺失突变体具有重叠但不同的定位模式，具有不同程度的表面和细胞内标记。最引人注目的是，第三洞^DGV公司，缺少NH₂-末端区域一直延伸到支架结构域（残基54–151），没有任何表面标记的迹象，选择该突变体进行更详细的分析。洞穴3^DGV公司局限于高尔基体和整个细胞的点状结构。使用HA标签抗体通过免疫电子显微镜对其进行更详细的检查（图。​（图7）。7). 与共聚焦显微镜分析一致，Cav3^DGV公司与高尔基复合体有关（图。​（图7）7)以及细胞内囊泡元件(Roy等人，1999年). 高尔基体标记与ERD2（KDEL-receptor）共定位显示该蛋白集中在顺高尔基体复合物中（图。​（图77B） ●●●●。在一小部分高表达细胞中，内质网内也观察到标记（未显示）。

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图6

cav-3突变体的图示和免疫荧光检测。（A） 总结本研究中使用的一些突变体及其预测拓扑。（B） 带有额外COOH末端突变体的cav-3假定COOH端结构域的氨基酸序列。（C–F）BHK细胞转染一系列HA标记的小窝蛋白-3突变体，如下所示：Cav3^DIH公司（面板C），第3节^NED公司（D） ，第3节^DGV公司（E） 和第3节^{肯尼亚先令}（F） ●●●●。然后用HA标签抗体对其进行标记，并用共焦显微镜进行检查。虽然在A和B中有明显的表面染色和内部染色，但Cav3^DGV公司构建物（E）没有表面标记，只有核周标记和点状细胞质染色。洞穴3^{肯尼亚先令}（F） 缺乏点状标记，但也标记转染细胞的核周区域。注意，在一些高表达细胞中，标记在整个胞浆中都很明显。棒材，10μm。

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图7

HA标记的cav3的免疫电镜定位^DGV公司BHK单元中。用HA标记的cav3 cDNA转染BHK细胞^DGV公司以及用HA标签抗体检测到的过度表达蛋白。固定前，细胞在37°C下与5 nm BSA-金培养10分钟。解冻后的冰冻切片用HA标签抗体标记，然后用15nm蛋白A-金标记。在B组中，切片也用ERD2抗体标记，然后用10nm蛋白A-金标记。A显示了细胞核周区的低倍视图，显示了HA标记的腔静脉3的特异性标记^DGV公司高尔基复合体（g）。如面板B所示，该标签与顺高尔基标记ERD2（10纳米金，箭头）共存。标记也与囊泡结构有关（未显示）。可忽略的标记与质膜（p）、线粒体（m）和用5 nm BSA-gold标记的早期内体有关（箭头）。N、 核心。棒材，100 nm。

COOH末端Caveolin结构域的靶向性

这些研究表明，高尔基体靶向/保留信息存在于分子的COOH末端部分。为了鉴定相关结构域，我们表达了一个仅包含假定的cav-3 COOH末端细胞质结构域（残基108–151）的构建物。该结构域以前被指定为基于氨基酸序列预测的细胞质定向，基于渗透细胞中COOH末端结构域的抗体识别(Dupree等人，1993年)和体外导入实验(Monier等人，1995年). 名为Cav3的构造^{肯尼亚先令}在带有HA表位标签的BHK细胞中表达。洞穴3^{肯尼亚先令}靶向细胞的核周区域（图。​（图66F） ●●●●。与在相同条件下表达的全长蛋白相比，表面染色不明显。在高度表达的细胞中，除高尔基复合体外，还有明显的细胞质染色（未显示）。

通过免疫电子显微镜（图。​（图8）。8). 表达细胞显示表达蛋白的高尔基体标记。没有标记与质膜或其他细胞器相关。除高尔基染色外，高表达细胞在整个细胞中显示出分散的胞质染色，但与Cav3不同^DGV公司-表达细胞，Cav3^{肯尼亚先令}表达细胞从未显示出ER染色。结合免疫荧光结果，这表明小窝蛋白片段与高尔基复合体的结合是一个可饱和的过程。

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图8

HA标记Cav3的免疫电镜定位^{肯尼亚先令}BHK单元中。用HA标记的Cav3 cDNA转染BHK细胞^{肯尼亚先令}以及用HA标签抗体检测到的过度表达蛋白。解冻后的冰冻切片用HA标签抗体标记，然后用15nm蛋白A-金标记。在B组中，也用p23抗体标记切片，然后用10nm蛋白A-金（箭头）标记。在C中，切片用10纳米金（箭头）标记HA，p23用15纳米金标记。A显示了一个低倍视图，其中显示了HA-tagged cav3的特定标签^{肯尼亚先令}高尔基复合体（g）。如B所示，该标记与顺高尔基标记p23（10纳米金）共定位。C显示了提取的细胞的高尔基复合体，其中p23标记与未提取的细胞相比大大增加。p23和HA标记的Cav3的极性^{肯尼亚先令}（箭头）很明显。可忽略标记与质膜相关（p）。棒材：（A）500 nm；（B和C）200纳米。

然后我们本地化了Cav3^{肯尼亚先令}与定义的高尔基体标记p23、tST和giantin相关的突变(Linstedt和Hauri，1993年)在光和电子显微镜水平。骑士3^{肯尼亚先令}在未经处理的细胞中与所有三个标记物共定位（图。​（图9，9，A–F）。然而，诺康唑治疗后，顺式标记物的共定位比内侧或反式高尔基体标记物更完整（图。​（图10，10，A–I）。这证实了Cav3的本地化^KSY公司与内源性cav-1密切相关，表明Cav3^{肯尼亚先令}未被错误定位到无关域。我们还研究了Cav3的分布^{肯尼亚先令}在电子显微镜水平上，相对于确定的标记物。洞穴3^{肯尼亚先令}显示了与顺高尔基标记p23的明显共定位（图。​（图8，8、B和C）和ERD2（未显示）。在提取的细胞中（例如图。​图88C） 标记清楚地显示与膜的细胞质表面有关。

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图9

HA-标记Cav3的Colocalization^{肯尼亚先令}在BHK细胞中具有高尔基体标记物和小窝蛋白。Cav3公司^{肯尼亚先令}转染的BHK细胞被HA表位抗体（A、C、E、G、I和K）和顺高尔基体标记物p23（B）、中高尔基体标志物giantin（D）、TGN标记物唾液转移酶（F）和小窝蛋白（cav1C；H、J和L）抗体双重标记。然后用共焦显微镜检查细胞。所有三个高尔基体标记（A–F）均显示结肠化。HA标记Cav3的（G-L）免疫定位^{肯尼亚先令}和内源性cav-1。在许多细胞中，HA标记的cav3^{肯尼亚先令}和小窝蛋白共定位（G和H）。然而，一致的观察结果是，在许多Cav3^{肯尼亚先令}转染细胞（变化在30%到40%之间；五个独立实验）内源性cav-1信号减弱或检测不到（I和J）。诺卡唑治疗并没有消除这种信号丢失（K和L）。棒材，10μm。

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图10

HA标记Cav3的免疫定位^{肯尼亚先令}用诺康唑处理的转染BHK细胞，引起高尔基体分散。用HA标记的Cav3转染BHK细胞^KSY公司或双重转染HA标记的Cav3^{肯尼亚先令}然后在固定前用10μM诺卡唑处理2 h，以获得高尔基体标记的分离。然后用HA标签抗体和p23（A–C）、giantin（D–F）或表位标记的唾液酸转移酶（ST；G–I）抗体对细胞进行双重标记。然后用共焦显微镜检查细胞。对覆盖图（如C、F和I所示）的仔细检查表明，HA标签与p23（A–C）的共定位比与giantin（D–F）或tST（G–I）的共定域更完整（与F相比，C中完全黄色的点所占比例相对较高，更引人注目的是，I）。棒材，10μm。

Cav3的分布^{肯尼亚先令}关于内源性小窝蛋白也进行了检测。洞穴3^{肯尼亚先令}根据共焦免疫荧光显微镜的判断，显示与小窝蛋白COOH末端的抗体共定位（图。​（图9，9、G和H）。相反，正如预期的NH抗体₂小窝蛋白的末端仅标记表面小窝蛋白，没有与Cav3共定位^KSY公司（未显示）。Cav3中的一致观察^{肯尼亚先令}-在表达细胞亚群（30-40%）中，内源性高尔基小窝蛋白标记的表达细胞显著减少（图。​（图9，9、I和J）。这种减少似乎与表达水平无关，并通过不同的标记序列观察到，与诺康唑联合治疗（图。​（图9，9（K和L）和三种不同的抗小窝蛋白抗体，它们识别分子的不同结构域。这表明Cav3的关联^{肯尼亚先令}高尔基复合体降低了小窝蛋白抗体对内源性小窝蛋白的可及性，或者更有可能减少高尔基相关小窝蛋白池。

尽管小窝蛋白的齐聚已被证明在体外具有等型特异性(Song等人，1996年)，可能性仍然是高尔基与Cav3的结合^{肯尼亚先令}可能代表与内源性高尔基窝蛋白的关联。为了在体内测试这一点，我们使用了缺乏小窝蛋白和小窝蛋白的上皮细胞系FRT(Lipardi等人，1998年). 洞穴3^{肯尼亚先令}在这些细胞中表达的高尔基复合体显示出特征性染色（图。​（图11，11，A和B）与p23共定位（未显示），强烈表明Cav3与^{肯尼亚先令}不依赖内源性小窝蛋白。通过Cav3的双重转染进一步验证了这一点^{肯尼亚先令}和野生型cav-1或GFP标记的cav-3。洞穴3^{肯尼亚先令}与高尔基复合体中表达的蛋白共定位，但即使在全长cav-3、Cav3高过表达后^{肯尼亚先令}未招募到细胞表面（未显示）。为了检查Cav-3的COOH末端的移除是否导致高尔基体定位的丧失，Cav-3ΔC与NH₂末端GFP标签在BHK细胞中表达。该蛋白仅显示与内质网定位一致的网状染色模式（未显示）。尽管这些结果与小窝蛋白与高尔基复合体结合中COOH末端的作用一致，但它们可能表明折叠/齐聚作用的普遍扰动导致内质网缺乏转运。然而，我们的结果表明，小窝蛋白的COOH末端细胞质结构域以可饱和的方式与顺式高尔基复合体结合。

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图11

cav-3的COOH末端结构域标记FRT细胞的高尔基体，并可将细胞溶质蛋白靶向高尔基复合体。（A和B）HA标记Cav3的免疫荧光^{肯尼亚先令}在FRT细胞中。FRT细胞是一种不表达内源性小窝蛋白的上皮细胞系，用HA标记的Cav3转染FRT细胞^{肯尼亚先令}虽然许多细胞在细胞质（A）中显示HA标记，但所有细胞都与与p23共定位的核周结构（B）有关（未显示）。（C和D）GFP-Cav3的本地化^{肯尼亚先令}转染BHK细胞。用GFP-Cav3转染BHK细胞^{肯尼亚先令}融合蛋白。除了清晰的高尔基体标记（C）外，大多数表达细胞在细胞质中都有标记。在一些高表达细胞中，高尔基体出现形态变化（D）。（E–H）BHK细胞转染小窝蛋白突变体，如共焦显微镜所示和定位。（E和F）转染Cav3^IYS公司（见图。​图6）6)局限于高尔基复合体，而Cav3^IRT公司无论表达水平如何，始终显示出更弥漫的染色。Cav-1的（G和H）免疫定位^{肯尼亚先令}和棕榈酰化缺陷突变体Cav-1^{肯尼亚先令}Δp。洞穴-1^{肯尼亚先令}通常显示出特征性高尔基体标记模式，而那些转染Cav-1的人^{肯尼亚先令}Δp始终呈现更为弥漫的细胞质标记。棒材，10μm。

洞穴3^{肯尼亚先令}可以将异源细胞质蛋白靶向高尔基复合体

为了研究cav-3的COOH末端是否可以靶向高尔基复合体的异源蛋白，高尔基复合体是一种包含Cav3的融合蛋白^{肯尼亚先令}融合到GFP的COOH末端。GFP-Cav3^{肯尼亚先令}融合蛋白在CMV启动子下在BHK细胞中表达。融合蛋白是专门针对高尔基复合体的（图。​（图1111C） 其中它与p23同处（未显示）。在大多数细胞中，细胞质染色也与靶向机制的饱和度明显一致（图。​（图1111C） ●●●●。此外，在高表达细胞中，GFP-Cav3^{肯尼亚先令}标记细胞核周区大泡状结构的外围（图。​（图1111D） ●●●●。这些实验表明，cav-3的COOH末端结构域足以将异源细胞溶质蛋白定位到高尔基复合体。

我们通过将COOH末端片段表达为与GFP的融合蛋白，对高尔基体定位所需的COOH端细胞质结构域区域进行了初步表征。32氨基酸片段（Cav3^IYS公司; 见图。​图66B） 与GFP融合显示高尔基复合体的特征染色模式（图。​（图1111E） ●●●●。相反，所有表达Cav3的细胞^IRT公司缺失Cav3前五个氨基酸的突变体^IYS公司（参见图。​图66B） ，在整个细胞中始终显示分散的标记（图。​（图1111F） ●●●●。观察到的两个突变体之间的差异与表达水平无关。总之，我们已经确定了小窝蛋白分子的一个独特结构域，可以将外源蛋白靶向高尔基复合体的一个特定结构域。

我们要感谢大卫·詹姆斯和让·格伦伯格在整个工作过程中进行了多次讨论，并对手稿进行了批判性阅读。我们还要感谢Tommy Nilsson的cDNA构建和抗原表位抗体；Jean Gruenberg和Manuel Rojo提供膜组分和抗体；和Elina Ikonen提供重组cav-2-Semliki森林病毒构建物。特别感谢科林·麦奎因在光学显微镜方面的帮助。

这项工作得到了澳大利亚国家卫生和医学研究委员会的资助。分子和细胞生物学中心是澳大利亚研究委员会的一个专门研究中心。