逆行鞭毛内转运（IFT）的不同突变体具有相似的形态学和分子缺陷

鞭毛装配温度敏感突变体的筛选

营养野生型细胞（137⁺, 10⁶细胞/ml）在50 ml 0.02 M柠檬酸盐缓冲液（pH 5）中暴露于1、5或10 mg/mlN个-甲基-N′-硝基-N个亚硝基胍（MNNG）在25°C的暗处放置30分钟。在培养基中洗涤两次后，细胞（10⁶细胞/ml）在21°C的光照下培养24小时。暴露于1、5或10 mg/ml MNNG后，存活率分别为71、57和45%。通过三次重复以下两步循环来筛选鞭毛组装的温度敏感突变体：我们丢弃了再生鞭毛并在32°C的限制温度下游泳的细胞，也丢弃了没有在21°C的允许温度下游泳的细胞。在循环的第一步，细胞通过pH冲击脱脂，并通过1000 rpm离心造粒（在GH-3.7型转子中；贝克曼仪器，Fullerton，CA），重新悬浮在30 ml培养基中，并在32°C的光照下暴露3 h，然后在四等分溶液中分离，其中一个在沉淀的细胞中富集。沉淀细胞在21°C的光照下培养过夜。培养结束后，去除上层70%的培养物，并在32°C下进行下一次筛选。在32°C下第二次和第三次暴露之前，添加到细胞中的培养基体积分别为5和3 ml。我们在固体培养基中培养剩余细胞，挑选单个菌落，并在200μl液体培养基中进行培养。我们选择了在32°C下暴露4小时内失去大部分鞭毛的克隆。我们分别从暴露于1 mg/ml或5 mg/ml MNNG的细胞中保留了11个和5个突变体克隆。一些克隆可能来自筛选过程中分裂的相同突变。

四个不同克隆中的突变体具有相同的表型：鞭毛膜突起。它们与野生型细胞杂交（137⁻)以验证它们代表一个单一突变。他们也相互交叉弗拉10以确定它们是否代表不同的基因座。通过四分体分析进行互补试验(哈里斯，1989年). 四个突变体中的三个在互惠杂交中重组并产生野生型细胞。相反，在204个杂交组合中，两个突变体没有重组。重组的三个突变体中的每一个也与弗拉10.因此，这四个突变体被称为弗拉15,弗拉16,弗拉17-1，以及弗拉17-2遵循之前用于鞭毛组件温度敏感突变体的命名(Adams等人，1982年;哈里斯，1989年). 这些突变体中是否有任何一个是弗拉除了弗拉10仍有待确定。

重组菌株功率因数15，一个瘫痪的鞭毛突变体(Adams等人，1981年)、和弗拉10,弗拉15,弗拉16，和弗拉分离17-1进行视频显微镜分析。它们的鞭毛笔直、不动，对鞭毛的组装具有温度敏感性。

光学和视频显微镜

对固定在2%戊二醛、0.01 M磷酸钠缓冲液（pH 6.9）中的细胞进行突变表型分析。使用显微镜（Axioskop型；卡尔蔡司公司。位于纽约州桑伍德市），通过4×中间透镜连接到CCD摄像机（SenSys，型号KAF 1400；Photometrics，图森，亚利桑那州）。

使用显微镜（Axiovert 35型；卡尔蔡司公司。)配备1.4 NA聚光镜、100×、1.3 NA平面Neofluar物镜和4×放大镜，放置在配备Newvicon管的摄像机前的三目头部（型号C2400-07；新泽西州布里奇沃特市哈马松公司）。透照光由汞弧提供，并通过蔡司标准绿色过滤器。视频图像以30帧/秒的速度采集，并直接存储在光盘上（TQ-3038F型光盘录像机；松下通信与系统公司，新泽西州塞考克斯）。使用测微计对像素尺寸进行校准。

将液体培养基中的细胞固定在约0.25%的低熔点琼脂糖（SeaPlaque；FMC BioProducts，Rockland，ME）中的一个薄室中，该室由玻璃盖玻片和一个由Scotch双面胶带固定在一起的玻片构成，该胶带也用作间隔物。

颗粒鞭毛内运输的定量分析

颗粒双向鞭毛内运输速度的测量是通过一种新的方法进行的，这种方法不依赖于前面描述的图像对比度增强和连续图像的减法(Kozminski等人，1995年;Pazour等人，1998年). 视频序列中的每个图像都是从光盘刻录机中读取的，并通过帧抓取器进行数字化。使用Image-1软件包的内置功能获得了沿着鞭毛的光强度剖面或线扫描(环球成像公司宾夕法尼亚州西切斯特）。为了提高信噪比，对行扫描中的每个值取横过鞭毛宽度的五个像素值的平均值。通过线扫描中局部平均信号强度周围的正弦偏转来确定每个粒子的位置。这种偏转或对比度的振幅及其长度是粒子的双折射、粒子的大小以及与焦平面的距离的函数。在我们的条件下，这些特征的峰间振幅约为总信号的1-2%。通过简单地将偏移量添加到每一行扫描中，将其从前一行扫描移开，并将整个序列显示为一个堆栈，从而获得一个合成图，从而直接显示正在进行双向运动的粒子。该合成图中的强度维度还包含时间信息，因为叠加线扫描是从33 ms间隔获得的图像中得出的。在这些图中，移动的粒子显示为对角脊或条纹，其斜率与速度成正比。虽然原始线扫描足以识别和跟踪许多顺行方向移动的粒子，通常显示出较强的对比度，但由于几个因素，它们不适合对数据进行完整分析和双向粒子速度的准确测量，例如存在不均匀的背景、光强波动和数字化噪声。为了克服这些局限性，数据被提交到奇异值分解，这是一个数学过程，可以用一组n个 _秒非零特征值（也称为奇异值）和两组正交特征向量(Golub和Reinsch，1970年;马林诺夫斯基，1991年;Press等人，1992年). 第一组特征向量构成矩阵U型带尺寸n个 _秒×第页，其中第页是每个行扫描中的像素数，由n个 _秒分量“谱”或波形，携带与实验线扫描形状相关的信息。第二组特征向量构成矩阵V（V）带尺寸n个 _秒×我，其中我是行扫描的数量，包含有关每个n个 _秒每个行扫描的组件。最后，每个n个 _秒对角矩阵中的奇异值秒测量各个组件对线扫描集合的权重或贡献。三个矩阵的乘积，USV公司^T型，其中V（V）^T型表示的转置V（V），使用完整的特征值和特征向量集完美再现了原始的线扫描集合，包括背景和噪声。然而，检查U型特征向量表明，前10-20以外的分量包含数据中噪声产生的不相关信号，而第一个特征向量，有时甚至是第三个特征向量包含结构化背景的信号贡献。使用中间分量子集的矩阵乘法产生了一个重建的线扫描集合，其中背景和噪声的贡献均被抑制。因此，该程序不仅可以明确识别运动粒子，还可以消除由于光强波动和未处理数据中存在的其他伪影导致的信号变化导致的时间/强度维时间分量的畸变。鞭毛线扫描合成图示例功率因数15，一个鞭毛直且不动的突变株，用作参考菌株弗拉15功率因数图15所示为本研究特征重组菌株之一。​图4。4。每个粒子的速度是根据沿每个对角脊手动绘制的线的斜率计算的。

在单独的窗口中打开

图4

在允许的温度下发生的颗粒鞭毛内运输的代表性说明。光强沿鞭毛纵向线扫描的合成图(一)功率因数15和(b条)弗拉15功率因数15.以30帧/秒的速度获取视频序列中的每个连续图像，测量鞭毛近端到远端的一次线扫描。然后对线扫描集合进行奇异值分解，并按照文本所述进行重建。处理后的行扫描进行堆叠和显示，以便x个轴对应于序列的第一行扫描和鞭毛的近端部分。距离年轴线是相对于鞭毛近端测量的。经历顺行或逆行运输的颗粒可分别识别为向右和向左倾斜的脊。(一和b条)红脊和绿脊的例子分别表示正经历顺行和逆行运输的粒子。

鞭毛内转运频率值的下限（以粒子/秒表示）是根据检测到的粒子总数与总观察时间的比值估算的，该比值等于线扫描次数除以30，即视频帧速率。逆行运输的频率可能被低估了，这是因为向该方向移动的粒子所产生的对比度较低，因此其在合成图中的特征处于检测极限。

电子显微镜

在4°C下，将细胞在10mM Hepes缓冲液（pH 7.2）中的3%戊二醛中固定2小时。然后将固定细胞在pH 7.2的10 mM Hepes缓冲液中洗涤三次，每次10分钟，并在1%OsO中固定₄加0.8%K_三铁（CN）₆在pH 7.2的4 mM磷酸盐缓冲液中，4°C下放置30分钟(麦克唐纳，1984年). 然后用水冲洗细胞10分钟，用0.15%单宁酸染色1分钟，再次用水冲洗10分钟，并在室温黑暗中用2%醋酸铀酰整体染色1小时。染色后，用水冲洗细胞10min，然后通过分级乙醇系列脱水（70%、80%、90%、100%，每个阶段30min）。将细胞在室温下在旋转器上进行氧化丙烯15分钟的转化和氧化丙烯∶环氧丙烷/芳二酸酯树脂1∶1的转化1小时。然后在室温下将epon/araldite树脂在旋转器上渗透过夜，最后将其嵌入新批次的epon/alaldite树脂中。树脂在68°C下聚合2天。

银切片在Ultracut E超微切片机（奥地利维也纳Reichert-Jung）上切割，收集在200目网格上，用醋酸铀酰染色20分钟，柠檬酸铅染色2分钟。切片的检查和摄影使用透射电子显微镜（H-7000型；日本东京日立）进行。

17S复合体的隔离

用pH休克法从细胞体中分离出鞭毛(Huang等人，1979年). 鞭毛超声破碎后，在台式微型离心机（5402型；威斯康星州麦迪逊Eppendorf）中以14000 rpm的转速离心分离可溶性蛋白质和不溶性残渣。含有17S复合物的蛋白质组分通过5–20%蔗糖梯度沉淀分离(Piperno和Mead，1997年). 沉淀标准为21S和11S衣原体达因(Piperno等人，1990年)用鞭毛提取物或平行梯度沉淀。

DEAE-Sepharose色谱柱（快速流动，法玛西亚生物技术公司，Piscataway，NJ）在0.3毫升柱上进行。在pH 6.8的0.01 M Hepes中，用4-ml 0.03–0.4 M NaCl梯度洗脱蛋白质。用折光法测量盐梯度的浓度。

多肽的凝胶电泳

单双向电泳³⁵S标记的多肽如所述进行(Piperno，1995年)进行了以下两项修改。SDS凝胶由4–11%聚丙烯酰胺梯度制成。在1.4 mA下进行等电聚焦14小时或1.6 mA下进行16小时。在第二组条件下对等电点进行定量分析，使17S复合体的亚基达到其等电点。含多肽的凝胶在等电点处的pH值直接在1×1×0.1 cm凝胶片与2 ml水的悬浮液中进行测定。

使用分子量标准评估多肽的表观分子量(法玛西亚生物技术公司批号7070615011和GIBCO-BRL公司批号KB9418）。此处报告的17S复合体13个亚单位的值为：(1) 189,000; (2) 148,000; (三) 127,000; (4) 86,000; (5) 81,000; (6) 71,000; (7) 69,000; (8) 65,000; (9) 56,000; (10) 47,000; (11) 26,000; (12) 21,000; 和(13) 19,000. 这些值可能比以前报告的更准确(Piperno和Mead，1997年). 之前的数据是通过预处理分子量标准（SDS-7B批次125H9408；西格玛化学公司。（密苏里州圣路易斯市）产生了不可复制的结果。

fla15、fla16和fla17-1鞭毛中粒子的逆行而非顺行运输有缺陷

确定IFT是否在弗拉15,弗拉16，和弗拉17-1，如图所示弗拉限制温度下为10(Kozminski等人，1995年)我们用视频增强差示干涉显微术观察了体内鞭毛。为此，我们在突变体和功率因数15，一个瘫痪的鞭毛突变体，对不动和直鞭毛进行显微分析。在每个重组体中，弗拉10功率因数15,弗拉15功率因数15,弗拉16功率因数15，和弗拉17-1功率因数15转运沿着鞭毛的整个长度发生，包括膜肿胀所在的部分。

采用《材料与方法》中描述的一种新方法，对蛋白质颗粒顺行和逆行方向的IFT速度和频率进行了定量分析。分析需要沿着每个视频帧中的鞭毛扫描光强度，以及线条扫描的组成。在这些复合图中，移动的粒子显示为对角脊或条纹，其斜率与速度成正比。这些条纹源于经历顺行和逆行运输的粒子，在用功率因数15和弗拉15功率因数15（图。​（图4）。4). 与逆行输运的粒子相比，顺行输运粒子产生了更强的光对比。因此，这些粒子的光学性质不同于那些朝相反方向运动的粒子。

在允许温度下功率因数15与弗拉10功率因数15,弗拉15功率因数15,弗拉16功率因数15，和弗拉17-1功率因数15（表​（表二）。二). 相反，逆行运输的速度弗拉15功率因数15,弗拉16功率因数15，以及弗拉17-1功率因数15显著低于功率因数15和弗拉10功率因数15（表​（表二）。二). 每个重组和功率因数15在置信水平下显著P（P）<0.001，由标准学生t吨测试。

在限制温度下，粒子的逆行传输速度在弗拉16功率因数15和弗拉17-1功率因数15，而逆行运输在大多数弗拉10功率因数总共15根鞭毛弗拉15功率因数15鞭毛。

奇异值分解的代表图处理了从功率因数15和弗拉15功率因数15在允许温度下（图。​（图4）4)表明双向传输的频率在弗拉15功率因数15.双向传输的频率弗拉15功率因数15,弗拉16功率因数15，和弗拉17-1功率因数15人分别为24人、66人和51%功率因数分别为15。相反，双向IFT的频率弗拉10功率因数15与功率因数15在相同条件下。

总之，弗拉15,弗拉16，和弗拉17-1不同于弗拉10，因为它们的鞭毛上存在隆起，逆行IFT的速度较低，双向运输的频率较低。这些表型是无条件的，与在限制温度下表达的每个突变体（包括弗拉10

我们感谢Michel LeDizet（加州大学戴维斯分校）对这份手稿的批判性阅读。我们还感谢Elizabeth Smith（明尼苏达州圣保罗市明尼苏打大学遗传学和细胞生物学系）提供针对PF公司16产品，并向Joel Rosenbaum、Doug Cole和Dennis Diener（耶鲁大学分子细胞和发育生物学系，康涅狄格州纽黑文）提供复合物A和B亚单位的四种单克隆抗体。

这项工作得到了美国国立卫生研究院GM-44467拨款的支持。