黏附斑激酶转导的细胞外基质生存信号抑制p53介导的细胞凋亡

单元格行

如前所述分离兔滑膜成纤维细胞（RSF）(Huhtala等人，1995年). 原代培养物扩增至第3代并冷冻。在第4代和第8代之间使用细胞。野生型和FAK缺陷的TT2胚胎干细胞和FAK缺乏的胚胎成纤维细胞在前面已经描述过(Ilić等人，1995年 一,b条).

内皮细胞按如下方式从E8.0岁的小鼠中分离假货+或假货−也携带突变的胚胎第53页将从植入部位切下的胚胎第8天（E8.0）的胚胎机械分解，置于纤维结合蛋白涂层培养皿（10μg/ml）上，并在含有10%热灭活FCS、丙酮酸钠、非必需氨基酸、10⁻⁴Mβ-巯基乙醇和青霉素/链霉素。用无酶PBS基细胞分离缓冲液分离细胞(GIBCO巴西雷亚尔; 纽约州格兰德岛Life Technologies），用冷PBS清洗，并用大鼠单克隆MEC13.3抗CD31（血小板-内皮细胞粘附分子[PECAM]-1）抗体在4°C下旋转培养1小时（意大利米兰马里奥内格里研究所E.Dejana博士赠送）。然后使用抗大鼠免疫球蛋白涂层磁珠分离结合抗PECAM-1的细胞(戴纳尔A.S.，挪威奥斯陆）。在冷的0.5%BSA/PBS中洗涤五次后，细胞被重新放置。细胞汇合后，再重复两次纯化过程。

内皮细胞完整第53页从野生型和FAK缺陷型TT2 ES细胞的类胚体（EB）中分离出该基因，然后用多瘤中间T（pmT）逆转录病毒转化(Fennie等人，1995年). 为了产生用于内皮细胞分离的EB，FAK+和FAK−TT2 ES细胞在不含白血病抑制因子的含血清培养基中悬浮培养11天。通过强力移液将产生的EB分散在胰蛋白酶/淀粉酶/胶原酶溶液中。细胞通过细胞过滤器去除剩余的细胞团，清洗并重新放置。达到汇合点后，用上述抗-PECAM-1和IgG包被的磁珠培养内皮细胞，然后进行电镀。含pmT–抗原/Neo基因组质粒转染的psi-Cre/psi-Crip逆转录病毒包装系统^第页逆转录病毒由C.Fennie和L.Lasky（Genentech，San Francisco，CA）提供。用于转化的上清液中的病毒滴度为～10⁵cfu/ml。用病毒上清液和聚brene作为增强剂，感染一次选择的内皮细胞培养物4小时(Fennie等人，1995年). 大多数细胞继续增殖。使用MEC13.3抗CD31（PECAM-1）抗体和抗大鼠Ig包被磁珠，通过两个多周期纯化内皮细胞。

EB细胞死亡分析

野生型和FAK缺陷型TT2 ES细胞在含有血清的培养基（含有丙酮酸钠、非必需氨基酸、10⁻⁴Mβ-巯基乙醇、青霉素/链霉素和10%FBS）持续11天以形成EB(Ilić等人，1996年). 然后，在存在或不存在10%血清作为生长/存活因子来源的情况下，将它们在相同的培养基中再培养24小时。EB在3.7%多聚甲醛中固定20分钟，然后用0.2%Triton X-100/PBS渗透2分钟。在PBS中洗涤后，按照制造商的建议，使用原位细胞死亡检测试剂盒对其进行末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）(勃林格曼海姆公司。印第安纳波利斯）。作为非特异性染色的对照，反应混合物在没有酶的情况下使用。最后一次洗涤在10μg/ml的Hoechst 33342/PBS中进行，以观察细胞核。使用Vectashield（加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories）安装样本。用表观荧光显微镜（Axiopot型；卡尔蔡司公司。纽约州桑伍德）配备适当的滤光片并拍照（Tri-X胶片；伊士曼柯达公司。纽约州罗切斯特）。

FACS公司^®-基于细胞凋亡分析

内皮细胞系与血清培养48小时，再与血清或无血清培养24小时。通过流式细胞术测定凋亡人群(Hamel等人，1996年). 实验重复了三次。将缺乏血清的细胞和对照细胞重新悬浮在含有2%FCS、3%无酶PBS的1ml冰镇PBS细胞分离缓冲液中(GIBCO巴西雷亚尔)和5μg/ml碘化丙啶(西格玛化学公司。密苏里州圣路易斯）。在添加Hoechst 33342之前，细胞在冰上保存10–15分钟。在平衡至室温后，向细胞悬浮液中添加4μg/ml Hoechst 33342。6分钟后使用双激光FACStar检测Hoechst 33342染色⁺细胞分选机(贝克顿·迪金森加利福尼亚州圣何塞市）。

粘附细胞的细胞死亡分析

使用Annexin v Biotin凋亡检测试剂盒分析粘附内皮细胞系和RSF中的凋亡(钙生物化学10μg/ml或Hoechst 33342染色10–15分钟。正常细胞的大细胞核用Hoechst33342轻微染色，而浓缩的凋亡细胞核染色明亮。同时使用这两种方法进行染色和定量产生了类似的结果。

质粒

通过在小鼠FAK cDNA的核苷酸2134–2139之间引入一个AflII位点，使用引物（5′-GCTCAGCAATAAGGAGAGAAGGTGCAGC-3′和5′-GCCTCTCCTCCCTTAAGATGTGTGTGTGCAGC）创建FAK相关非激酶（FRNK）序列并遵循QuikChange突变试剂盒（加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫纳）中概述的方案。使用引物（5′-GATACCTAGCATCTAGCGGTACATGGCATGCATC-3′和5′-GAAGCAGCTGCATTC-3′）和QuikChange协议在克隆到pBluescript中的小鼠FAK cDNA的翻译起始点旁创建一个KpnI位点。DNA测序证实了所有核苷酸的变化。

为了构建绿色荧光蛋白-焦点粘附靶向（GFP–FAT）融合蛋白，用XhoI切割正常和突变的FAK cDNA（2628–2633 bp伪造cDNA）和BamHI（在双血凝素[HA]标记后）位点。将该片段插入pEGFP-C1表达载体的多克隆位点中的XhoI和BamHI位点之间(克隆技术公司加利福尼亚州帕洛阿尔托实验室）。为了表达GFP–FRNK融合蛋白，pEGFP-C1载体也在多克隆位点用XhoI打开，钝化，然后用BamHI切割。FRNK在新引入的AflII站点进行切割，BamHI位于双HA标签之后。将插入物连接到pEGFP-C1表达载体的多克隆位点，以保持GFP和FRNK之间阅读框的连续性。为了生成GFP–FAK表达载体，在ATG密码子前的新KpnI位点和HA标记后的BamHI位点切割FAK cDNA，并插入相应位点的pEGFP-C1载体。

为了破坏paxillin结合位点2，我们在关键R1042残基之前引入了一个终止密码子，并产生了突变GFP–FATΔC13。GFP–FATΔC13是在去甲基化GFP–FAT表达载体的BclI消化后，通过钝化端的自我调节产生的。

使用QuikChange突变试剂盒和引物5′-CTACCGAAGGAGAGGCGCGCGCCGGCGCGCGAAAAAAAACCA-ATG-ATG-3′和5′-CATTGGTTTTATGGGCGCCTCTTCTCTCTCGGCGCGTCGCGGTTAGAGAG-3′将GSE p53中的T367、S372、T373和S374转化为丙氨酸。DNA测序证实了所有核苷酸的变化。

从pBluescript II KS（加利福尼亚大学旧金山分校Z.Werb的礼物）中切下小鼠Bcl2，并将其插入pCDNA3.1/Hygro表达载体（加利福尼亚州卡尔斯巴德市Invitrogen）的多克隆位点。

所有钝化和结扎反应均使用钝化或结扎试剂盒（日本Takara，由威斯康星州麦迪逊PanVera Corporation进口）进行。使用适当的QIAGEN试剂盒分离质粒DNA和琼脂糖包埋片段（加利福尼亚州巴伦西亚QIAGENE）。

表达载体是礼物：来自E.White的E1B 19K（新泽西州皮斯卡塔韦罗格斯大学）(怀特和西普里亚尼，1990年); CrmA来自V.Dixit（密歇根大学，密歇根州安阿伯；基因泰克）(Tewari等人，1995年); 来自T.Tlsty和V.Ossovskaya（加利福尼亚大学旧金山分校）的p53-175、p53-273和GSE p53突变体；来自J.Moscat（西班牙马德里坎托·布兰科自治大学）和S.Ohno（日本横滨市横滨市立大学医学院）的正常和突变PKC；Chiron Corp.（加利福尼亚州埃默里维尔）的肉豆蔻酰化HA标记AKT；和cPLA₂来自A.Stewart和C.Leslie（科罗拉多大学丹佛分校）。

基质存活分析

用25μg/ml纤维连接蛋白、层粘连蛋白-1、玻璃体凝集素或I型胶原在4°C下的组织培养塑料孔上涂敷12 h(GIBCO巴西雷亚尔). 包衣后，在细胞贴壁前，用PBS清洗包衣孔。用于存活检测的细胞（RSF和FAK+p53+内皮细胞）生长到亚融合状态，并用无酶PBS基细胞分离缓冲液从塑料培养皿中分离(GIBCO巴西雷亚尔). 在用PBS清洗后，细胞被镀在基质涂层孔上，在无血清二甲醚中与谷氨酰胺和非必需氨基酸约75%的汇合处。培养16或24小时后（分别为RSF和内皮细胞），按上述方法对凋亡细胞进行定量。

内皮细胞和成纤维细胞中缺乏血清的特异性基质信号细胞存活

上述实验表明，在血清中产生的复杂内源性ECM可以支持FAK+EB和pmT-永生化FAK+p53+内皮细胞在退出血清后的存活。为了更准确地确定哪些基质成分对支持FAK+p53+内皮细胞的存活至关重要，我们在没有血清的情况下将这些细胞接种在确定的ECM配体上。我们还测试了ECM配体支持原发性RSF生存的能力，以确定这些配体对无血清生存影响的细胞类型特异性。就内皮细胞而言，纤维连接蛋白和层粘连蛋白-1在促进生存方面最为有效，而玻璃体凝集素也显示出显著的促进生存活性。I型胶原的有效性明显低于其他ECM配体（图。​（图22 A类). 对于RSF，纤维连接蛋白在促进生存方面明显优于其他三种配体：后一种基质上的RSF的凋亡指数并不比组织培养塑料的好（图。​（图22 B类). 纤维结合蛋白用于随后的实验，因为它支持内皮细胞和成纤维细胞的存活。

在单独的窗口中打开

图2

内皮细胞和成纤维细胞中无血清的特异性基质是细胞存活的信号。组织培养塑料孔涂有纤维连接蛋白(FN公司)，卵磷脂(越南)，层粘连蛋白-1(洛杉矶)或I型胶原蛋白(一氧化碳)，或未涂层(数控)，如材料和方法中所述。在无血清的情况下，在这些基质上培养细胞16小时（原代兔滑膜成纤维细胞：RSF）或24小时（EpmTp53+FAK+内皮细胞）。东南方，血清对照。按照材料和方法中的描述，对培养物中的凋亡细胞进行量化。在每次实验中，至少取100个细胞的每个样品，一式三份。实验至少重复了三次。错误栏显示SD(A类)FAK+p53+内皮细胞。(B类)RSF公司。

在无血清培养基中干扰FAK功能触发原代成纤维细胞凋亡

为了测试FAK和p53在调节RSF中纤维连接蛋白的生存信号中的作用，我们依次使这些细胞中内源性FAK和p53的功能失活。在FAK的情况下，我们使用了两个COOH-终端结构：FRNK和FAT域（图。​（图3三 A类). FRNK是FAK的天然替代转录物，在某些细胞类型中表达，并构成FAK COOH末端到激酶结构域的序列(理查德森和帕森斯，1996年). FAT是FAK和FRNK中的一个区域，包含将FAK靶向黏附部位所需的序列(Hildebrand等人，1993年). FRNK和FAT会干扰FAK定位和信号(Gilmore和Romer，1996年;理查德森和帕森斯，1996年). 为了确定局部粘附定位对FAT活性的重要性，我们还测试了一种FAT结构，其中COOH末端13个氨基酸被删除，以消除其靶向局部粘附位点的能力（FATΔC13）。为了跟踪这些结构以及全长FAK在活细胞中的表达和定位，编码GFP的cDNA在框架内融合到NH₂所有这些cDNA的末端（图。​（图3三 A类材料和方法）。

在单独的窗口中打开

在单独的窗口中打开

在单独的窗口中打开

在单独的窗口中打开

图3

GFP–FAT是FAK的主要阴性反应。(A类)用编码GFP和FAK、FRNK、FAT或FATΔ13C（缺失13个COOH末端氨基酸的FAT）融合蛋白的cDNA转染RSF。(B类)8小时时，除GFP–FATΔ13C外，所有融合蛋白均在局部接触和细胞质中广泛检测到。(C类)16小时时凋亡指数的量化（转染百分率[绿色]如Hoechst 33342）检测到的GFP、GFP-FAK、GFP-FAT、GFP-FRNK和GFP-FATΔ13C转染体中含有浓缩、破碎细胞核的细胞。与GFP–FAT转染后的高凋亡指数（75%）相反，单独转染GFP或将GFP融合到完整FAK的转染，在无血清的情况下，未引起高于纤维连接蛋白细胞水平的凋亡（～20%）。GFP–FATΔ13C在局灶性粘连中未检测到，也无法诱导与GFP–FAT相同程度的细胞凋亡。(D类)通过膜联蛋白结合和Hoechst 33342染色评估细胞凋亡。大多数表达GFP–FAT的RSF，而不是单独表达GFP或GFP-FAK的RSF是圆形的，转染后16小时，其Hoechst 33342染色的细胞核变亮并浓缩(箭头). 这些细胞也显示出膜联蛋白阳性染色(红色)在质膜中，表明它们是凋亡的（材料和方法中描述的染色）。未转染和GFP–FAK–转染细胞扩散(阶段)并且有正常的细胞核(赫赫斯特).

当转染这些构建物8小时后对活培养物进行检查时，在成功转染的细胞中的局部黏附部位以及扩散部位检测到GFP-FAK、GFP-FRNK和GFP-FAT。相反，GFP–FATΔC13在局部粘附部位未检测到（图。​（图3三 B类). 随后用识别NH的抗FAK抗体固定和染色GFP–FRNK–和GFP–FAT–转染细胞₂-FAK的末端区域（因此不是FAT或FRNK）显示，内源性FAK在此时部分或完全从局部黏附部位移位（数据未显示）。

通过添加Hoechst 33342，在转染16 h后评估这些培养物中的细胞凋亡，这显示了细胞核形态。成功转染的细胞（GFP阳性）中也含有浓缩/碎片细胞核的百分比被确定为每种培养物的凋亡指数（图。​（图3三 C类). 转染后16小时，大多数表达GFP–FAT的细胞被评为凋亡细胞（75%）。相反，GFP–FATΔC13触发的凋亡水平低得多（38%），这表明定位于局部黏附部位对GFP–FAT促凋亡作用具有重要意义。单独转染GFP或GFP–FAK的细胞的凋亡指数与在无血清的情况下培养在纤维连接蛋白上的未转染成纤维细胞的低水平相似（～25%）。有趣的是，转染GFP–FRNK的培养物的凋亡指数显著低于转染GFP-FAT的细胞（31%对75%），尽管两者都可以靶向局部黏附部位。

通过评估未固定细胞结合生物素化膜联蛋白（膜联蛋白v-生物素）的能力，还评估了单独转染GFP、GFP-FAK或GFP-FAT的培养物中的细胞凋亡。膜联蛋白v-生物素与磷脂酰丝氨酸结合，磷脂酰丝蛋白通常存在于质膜的内叶中，但在发生凋亡的细胞中转移到外叶，从而被标记的膜联蛋白所接近(Martin等人，1995年). 这些培养物的annexin、Hoechst和相位显微镜图像如图所示。​图3三 D类大多数表达GFP–FAT的细胞都有核流变的迹象，并且存在着程序性细胞死亡细胞特有的染色质，染色质颜色鲜艳。相比之下，同一培养物中的大多数未转染细胞，以及单独转染GFP或将全长FAK融合到GFP（GFP–FAK）的细胞，其细胞核大而浅染，这是活细胞的特征。Hoechst染色显示的异常核形态程度与膜联蛋白结合高度相关，因此与GFP–FAK–和GFP转染细胞相比，通过不同的方法证实了GFP–FAT的凋亡表型。

FRNK已被证明是FAK的主要负调节因子，至少对其某些功能起作用，包括细胞扩散(理查德森和帕森斯，1996年). 然而，在我们的系统中，约70%的表达GFP–FRNK的细胞存活，而75%的表达GFP–FAT的细胞死亡（图。​（图3三 C类)GFP–FRNK在RSF中起作用，这是由其延迟胰蛋白酶化和替换表达GFP–FNK的RSF扩散的能力决定的（图。​（图44 A类)时间进程与理查德森和帕森斯（1996）此外，GFP–FRNK和GFP–FAT在转染细胞中的表达水平相似，通过免疫印迹等数量的FACS测定^®-分选GFP–FRNK–和GFP–FAT–表达细胞与抗GFP（图。​（图44 B类). 这些结果与FRNK是FAK的某些（即传播）功能的负调节器，但不是所有（即依赖于新闻媒介的生存）功能的消极调节器的建议一致。有趣的是，胰蛋白酶化和重新移植的GFP–FAT表达细胞尽管最初附着，但实际上无法扩散（图。​（图44 A类). GFP–FAT在转染GFP–FAT的粘附性RSF中作用的时间过程表明，GFP–FAT在局部接触中的积累导致细胞圆形、脱离，最终导致死亡（图。​（图3，三,B类和D类).

在单独的窗口中打开

在单独的窗口中打开

图4

评估GFP–FRNK和GFP–FAT功能。(A类)表达GFP–FRNK的细胞表现出延迟扩散。将转染GFP、GFP–FRNK或GFP–FAT的RSF进行胰蛋白酶消化，并将其重新放置在涂有纤维连接蛋白的盖玻片上。移植后60分钟，转染GFP的细胞完全扩散，而转染GFP-FRNK和GFP-FAT的细胞仍呈圆形。到2小时，GFP–FRNK–转染细胞已经扩散，显示融合蛋白的局部接触定位(箭头). 然而，大多数转染GFP–FAT的细胞仍然是圆形的，尽管仍然附着。(B类)转染细胞表达类似数量的GFP–FRNK和GFP–FAT。FACS对表达GFP–FRNK或GFP–FAT的细胞进行分类^®转染后10小时。相同数量的分拣单元（5×10^三)在RIPA缓冲液中对每种类型进行裂解，用10%SDS-PAGE分离，转移到硝化纤维素中，并用抗GFP抗体进行检测(Zymed实验室加利福尼亚州旧金山）。通过ECL-Plus检测系统显示条带(Amersham公司。伊利诺伊州阿灵顿高地）。

图中的数据汇总在一起。​图3三和​和44支持FAT是FAK的主要阴性反应，干扰FAT检测和/或传输纤维连接蛋白的生存信号的能力。在缺乏这些FAK转导信号的情况下，正如在缺乏血清的p53+FAK−内皮细胞中观察到的那样，细胞凋亡被触发（图。​（图11 B类).

PI3K/AKT通路的激活并不能拯救GFP–FAT引起的细胞死亡

已证明激活的FAK可结合PI3K的p85调节成分。此外，FAK/p85复合物的形成以及磷脂酰肌醇3，4-二磷酸和3，4，5-三磷酸（PI3K活性的产物）水平的升高，随后是AKT的激活，发生在细胞附着于ECM之后(Khwaja等人，1997年). 如果在锚定依赖性条件下培养的细胞中，锚定诱导型PI3K/AKT途径位于FAK的下游，那么组成型活性肉豆蔻酰化AKT的表达(Kohn等人，1998年)应将转染GFP–FAT的细胞从程序性细胞死亡中拯救出来。因此，我们将GFP–FAT与HA标记的肉豆蔻酰化AKT一起转染到无血清培养基中在纤连蛋白上培养的RSF中。根据抗HA标签抗体染色的结果，AKT结构被正确定位，并且在使用的满血清培养条件下，积极地将细胞从FAK相关激酶PYK2过度表达诱导的凋亡中拯救出来熊和帕森斯（1997）然而，它并没有将依赖ECM生存信号的细胞从GFP–FAT诱导的凋亡中拯救出来（图。​（图5）。5). 此外，添加稳定的PI3K抑制剂LY294002不能诱导未转染细胞或单独转染GFP并在无血清培养基中培养的细胞凋亡（图。​（图5）。5). 这些数据表明，FAK下游的ECM生存途径与PI3K/AKT生存途径不同，当PYK2过度表达时，PI3K/AKT生存途径受到抑制(熊和帕森斯，1997)说明细胞中存在多种生存途径。

在单独的窗口中打开

图5

PI3K/AKT通路不能拯救RSF对GFP–FAT的凋亡反应。在无血清的纤维连接蛋白培养的RSF中，LY294002对PI3K活性的阻断不会触发细胞凋亡，组成性激活AKT（myr AKT）与GFP–FAT的联合转染也不会阻止细胞凋亡。这表明PI3K/AKT不是缺乏血清、凤尾鱼依赖性细胞中FAK生存途径的下游介质。

FAK失活诱导锚定依赖性、血清剥夺性成纤维细胞凋亡是通过p53调节途径启动的

关于凤尾鱼依赖性血清剥夺成纤维细胞中FAK失活所触发的凋亡途径，我们使用了几种方法来测试p53是否参与，正如我们在内皮细胞中所证明的那样（图。​（图11 B类). 在所有病例中，我们确定干扰p53功能或p53信号通路是否可以挽救GFP–FAT诱导的凋亡。E1B 19K腺病毒蛋白灭活基因组不稳定触发的p53凋亡途径(怀特和西普里亚尼，1990年;Debbas和White，1993年;Ko和Prives，1996年;莱文，1997年). E1B 19K表达载体与GFP–FAT共同转染到纤维连接蛋白上的无血清RSF中，导致低（背景）水平的细胞凋亡（19%；图。​图66 A类)尽管GFP–FAT使FAK功能失活。干扰p53介导凋亡途径的另一种方法(Ko和Prives，1996年;莱文，1997年)，Bcl2在GFP–FAT转染的RSF中过度表达。Bcl2与GFP–FAT的共表达也广泛抑制了细胞凋亡（35 vs.82%；图。​图66 A类).

在单独的窗口中打开

在单独的窗口中打开

在单独的窗口中打开

在单独的窗口中打开

在单独的窗口中打开

在单独的窗口中打开

图6

在缺乏血清的RSF中，在缺乏ECM生存信号的情况下触发的凋亡途径的特征：药理学和显性阴性策略揭示了一种由p53调节、由cPLA激活的凋亡途径₂和PKCλ/l.，并耐CrmA。(A类)尽管GFP–FAT抑制FAK功能，但阻断p53的功能可使原发性RSF存活。将GFP–FAT共转染到铺在纤连蛋白上的成纤维细胞中，加入或不加入E1B 19K、Bcl2或对应于p53 COOH末端结构域的GSE（C术语p53），使p53功能失活（见材料和方法）。GFP–FAT转染细胞的凋亡指数较高，但与GFP–FAT和以下其中一种基因共同转染的细胞中的凋亡指数显著降低：E1B 19K、Bcl2或C-term p53。然而，含有突变的假定PKC磷酸化位点（mut C-term p53）的C端p53与GFP–FAT共同转染并不能拯救细胞凋亡。(B–D类)在缺乏血清的凤尾鱼依赖性RSF中，FAK功能失活触发的细胞凋亡需要PKCλ/Ⅰ。(B类)阻断PKC所有亚型功能的抑制剂（双吲哚基甲酰胺I和白屈菜红碱氯化物）抑制GFP–FAT诱导的凋亡，而仅阻断PMA敏感亚型（因此不阻断PKCλ/l.）的钙蛋白C则没有。(C类)RSF表达PKC的三种异构体。为了检测PKC异构体，细胞在蛋白酶抑制剂存在下使用RIPA缓冲液进行裂解。在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶中分离后，免疫沉淀PKC，并用抗PKCα、β、γ、δ、ε、ζ、o、φ、λ和μ抗体检测PKC（肯塔基州列克星敦的Transduction Laboratories）。仅检测到PKCε、λ和λ+控制，PKC亚型标准；−控制用非免疫IgG沉淀RSF裂解物；反PKC与PKC亚型特异性抗体沉淀。(D类). 显性与阴性的共表达(DN（公称直径）)PKCλ/1，而非DN PKCε，阻断GFP–FAT–触发的细胞凋亡。野生型PKC亚型与GFP–FAT共转染并不能拯救细胞凋亡。将野生型亚型转染到GFP转染细胞中不会促进细胞凋亡。(E类)去血清凤尾鱼依赖性RSF中FAK功能失活引发的细胞凋亡需要cPLA₂花生四烯酸诱导未转染或GFP转染RSF的细胞凋亡。磷脂酶催化磷脂释放花生四烯酸。AACOCF公司_三，cPLA抑制剂₂，但不是分泌和钙的抑制剂²⁺-独立解放军₂或PLC抑制剂，将细胞从GFP–FAT触发的凋亡中拯救出来。panPKC抑制剂双吲哚甲酰胺I阻断花生四烯酸引发的细胞凋亡，提示cPLA₂在该途径中位于PKCλ/l.上游。(F类)阻断大小前体蛋白酶caspase功能对GFP–FAT转染的初级RSF细胞凋亡的影响。RSF与GFP–FAT和CrmA共转染或单独与GFP-FAT共转染。16小时时，无论是否转染CrmA，转染GFP–FAT的RSF的凋亡指数都很高。小前体蛋白半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK抑制了无血清GFP–FAT转染的成纤维细胞在纤维连接蛋白上凝集和破碎细胞核的形成。

为了更直接地证明p53的参与，我们共转染了一种与p53的COOH末端结构域（C末端p53，大鼠p53的312-391氨基酸；Ossovskaya等人，1996年). 该构建体与GFP–FAT的表达显著降低了细胞凋亡指数（85%对38%：P（P）< 0.01). 然而，当丝氨酸和苏氨酸可能是PKC的磷酸化位点（T367、S372、T373和S374；Milne等人，1996年)被丙氨酸（mut C-term p53）取代，该结构不再能够拯救GFP–FAT诱导的凋亡（图。​（图66 A类). 该实验表明，C项p53 GSE通过干扰内源性p53磷酸化的显性负性机制发挥作用。试图通过R273和R175处DNA结合区的错义突变来干扰p53功能，并没有拯救细胞免受GFP–FAT诱导的凋亡（数据未显示）。总之，这些数据表明p53可以作为FAK在成纤维细胞和内皮细胞中转导的生存信号的监测。事实上，C端p53片段中假定的PKC磷酸化位点的突变消除了其干扰内源性p53调节凋亡的能力，这表明当缺乏适当的ECM或FAK时，这种p53调节的凋亡途径被一种或多种PKC亚型激活。

非典型PKCλ/l.和cPLA₂参与ECM生存信号中断后激活p53介导的细胞凋亡的途径

一些证据表明，一大群称为PKC的丝氨酸/苏氨酸激酶参与调节ECM上细胞的附着和扩散(Chun和Jacobson，1993年)以及调节细胞存活和死亡(Livneh和Fishman，1997年). PKC的许多亚型被分为三类：经典型（α、β和γ），即钙²⁺-和二酰甘油依赖型；新的（δ、ε、η和θ），即Ca⁺⁺-独立但依赖于二酰甘油的形式；和非典型（ζ和λ/l.），即Ca²⁺-和二酰甘油依赖型(Livneh和Fishman，1997年). 我们使用了几种方法来分析PKC亚型是否参与ECM生存信号的转导或在这些信号被撤回时诱导凋亡。在药理学方法中，我们确定影响所有PKC亚型的抑制剂双吲哚甲酰胺I和白屈菜红碱氯化物能够显著降低GFP–FAT转染RSF培养物中的凋亡指数（85 vs.25–30%）（图。​（图66 B类). 然而，钙磷蛋白C特异性地阻断二酰基甘油依赖性（经典和新型）PKC亚型，并没有抑制GFP–FAT诱导的凋亡。为了从RSF系统的角度评估这些结果，我们只检测到这些细胞中λ/1和εPKC亚型的表达（图。​（图66 C类). 这表明，对于RSF，非典型PKC亚型λ/l可能参与FAK功能被抑制时激活的凋亡途径。事实上，GFP或GFP–FAT与RSF中检测到的PKC亚型的主要负结构共同转染证实了这一观点。因此，显性负性λ/l能够将细胞从GFP–FAT介导的死亡中拯救出来，而显性负性PKCε则不能（图。​（图66 D类). 单独与GFP联合转染时，两种构建物均不影响存活率。

脂质介质激活PKC依赖于磷脂释放花生四烯酸。将100μM花生四烯酸添加到RSF中6小时，RSF在无血清培养基中附着并扩散到纤维连接蛋白上，触发了未转染细胞和仅转染GFP的细胞的凋亡，并增加了GFP–FAT转染引发的凋亡水平（图。​（图66 E类). 花生四烯酸可通过PLA从磷脂中水解去除₂或由可编程逻辑控制器（PLC）作用释放的二酰甘油生成。花生四烯酸对PKC的激活可以独立于二酰甘油，也可以与二酰甘油协同作用。由于上述λ/λPKC亚型是非典型的（Ca²⁺和不依赖二酰基甘油），我们可以预测PLA₂而不是PLC参与该途径中PKCλ/1的激活。对药物抑制剂的研究表明，U-73122是一种特异性PLC抑制剂，它无法拯救无血清培养基中培养在纤维连接蛋白上的RSF的GFP–FAT转染所触发的细胞凋亡（图。​（图66 E类). 然而，花生四烯酸三氟甲基酮（AACOCF_三)，cPLA₂抑制剂显著提高了GFP–FAT转染细胞的存活率（85 vs.40%：P（P）<0.01）（图。​（图66 E类).

这些研究暗示了cPLA₂当ECM生存信号缺失时，PKCλ/l参与激活p53调节的凋亡途径。为了确定它们是否属于同一途径的一部分，我们测试了pan-PKC抑制剂双吲哚基甲酰胺I是否能够抑制花生四烯酸引起的高水平凋亡；我们的结果表明，它可以（图。​（图66 E类). 因此，我们的数据与FAK在原代成纤维细胞中转导的ECM生存信号抑制cPLA激活的p53调节的凋亡途径的观点一致₂和PKCλ/l。

FAK是内皮细胞和成纤维细胞传递ECM生存信号所必需的

在纤维连接蛋白连接整合素后，在粘附位点形成含有FAK的信号复合物(宫本茂等人，1995年一 ,b条;Schlaepfer和Hunter，1998年). 先前的研究将生存维持与激活的FAK的存在相关联(Frisch等人，1996年;亨格福德等人，1996年). 我们对来自FAK+、FAK-EB和E8.0胚胎的内皮细胞的研究直接验证了这种相关性。他们最终证明，FAK是从复杂ECM和纤维连接蛋白传递生存信号所必需的。有趣的是，FAK和纤维连接蛋白基因敲除小鼠具有相似的表型，在E8-8.5表现出广泛的中胚层缺陷和胚胎死亡，这与这些分子具有相关功能的假设一致(George等人，1993年;Furuta等人，1995年).

我们对原代成纤维细胞（RSF）的研究证实了FAK在调节凤尾鱼依赖细胞存活方面的重要性。通过将GFP融合到FAK的FAT区域，使内源性FAK功能失活。我们选择转染FAT域作为干扰FAK功能的策略，有两个原因：第一，完整FAK中的FAT域负责将其靶向焦点接触(Hildebrand等人，1993年)第二，在Apo-2L介导的程序性细胞死亡的早期阶段，FAK被半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶活性裂解，产生一个与FAT大小相似的COOH末端片段(Wen等人，1997年;Levkau等人，1998年). GFP–FAT的表达在RSF中引起了高水平的凋亡。通过我们证明缺乏COOH末端13个氨基酸（包括关键的R1042残基）的FAT构建体的表达，揭示了局灶接触定位对GFP–FAT促凋亡作用的重要性(Tachibana等人，1995年)，导致细胞凋亡效应显著降低。有趣的是，FRNK是假货基因，转染成纤维细胞时不会引发高水平的细胞凋亡，尽管与FAT一样，FRNK缺乏激酶活性，可以将FAK从局灶性接触中置换出来(理查德森和帕森斯，1996年). 因此，FRNK NH中的序列₂-FAT末端必须抑制FAT结构域中的促凋亡信号。FRNK中这些序列抑制FAT中促凋亡信号的能力应能使FRNK以调节方式表达并调节FAK的某些功能，例如细胞扩散(理查德森和帕森斯，1996年)-而不会杀死表达它的细胞。

FAK抑制p53调节的凋亡途径

我们能够确定p53参与了FAK抑制凤尾鱼依赖性内皮细胞凋亡的机制，这是由于我们通过两种不同的方法使FAK+和FAK-内皮细胞永生：pmT感染和从携带突变p53的胚胎中衍生内皮细胞。因此，与FAK+p53+或FAK-p53−对应物相比，pmT转化的FAK−和p53+内皮细胞在退出血清后的凋亡率明显更高（图。​（图11 B类).

由于转化细胞可能改变了信号通路，特别是那些调节生存的信号通路，因此在原代成纤维细胞中，p53参与调节ECM/FAK生存信号抑制的凋亡通路的研究更为全面。在最直接的方法中，我们证明了p53的一个被截断的COOH末端部分可以以显性负向的方式干扰GFP–FAT触发凋亡的能力。p53的这一区域包含假定的PKC磷酸化位点，这表明PKC的磷酸化作用可能激活或增加p53的半衰期(Milne等人，1996年). 相反，DNA结合功能所需的p53区域的突变不会干扰GFP–FAT–触发的凋亡。这些数据表明，当FAK功能被抑制时，p53直接作用于凋亡级联的下游成分，而不是通过结合DNA和反式-激活靶基因。我们的数据表明，当FAK失活时，E1B 19K和Bcl2均抑制细胞凋亡，也支持p53在该程序性细胞死亡途径中的作用(Debbas和White，1993年;Ko和Prives，1996年;莱文，1997年). 因此，p53在原代成纤维细胞和内皮细胞中调节凋亡途径，以响应ECM和FAK的生存信号丢失。

FAK可能在多条生存途径中发挥作用

该系统中的两个重要研究领域涉及识别作用于FAK下游的ECM生存途径中的成分，以及识别作用于p53上游和下游的FAK功能丧失所触发的凋亡途径中的因素。虽然本文的工作重点是描述p53调节的凋亡途径，但我们确实确定PI3K及其下游靶点AKT不参与在缺乏血清、依赖凤尾鱼的成纤维细胞中从FAK传递生存信号。这与来自Khwaja等人（1997年）提供证据表明PI3K/AKT在生存途径中位于FAK的下游熊和帕森斯（1997）显示组成性激活的PI3K或AKT可以拯救FAK相关分子PYK2过度表达引发的细胞凋亡。这些后一结果表明，在某些细胞类型中可能存在平衡，通过PI3K/AKT在FAK下游传输的生存信号可以抑制PYK2的促凋亡信号。PYK2研究中描述的系统在几个方面与此处所示的不同，这表明FAK可能参与多条生存途径。首先，PYK2研究中的细胞在血清中培养；因此，它们不依赖于来自ECM的存活信号。由于FAK可以被几种可溶性因子的受体以及ECM受体激活，因此涉及FAK和PI3K/AKT的不同途径可能会从这些因子传递生存信号。其次，PYK2过表达触发的凋亡途径可被CrmA抑制，并对Bcl2的过表达具有抗性，与本文报道的途径相反。显然，还需要进一步研究来阐明FAK在从ECM和可溶性因子传递生存信号中的作用。

我们感谢Steven Hanks博士、Thomas Parsons博士、Eileen White博士、Vishva Dixit博士、Zena Werb博士、Thea Tlsty博士、Valeria Ossovskaya博士、Jorge Moscat博士、Shigeo Ohno博士、Martin Haas博士、Bert Vogelstein博士、Allison Stewart博士、Christina Leslie博士、Elisabetta Dejana博士、Christopher Fennie博士和Laurence Lasky博士提供有用的质粒、抗体和试剂。我们还感谢Vishva Dixit、Mark Israel、Holly Ingraham、Clifford Lowell、Thea Tlsty、Valeria Ossovskaya和Olga Genbacev博士对手稿的有益讨论和评论，以及Evangeline Leash的专家编辑协助。

这项工作得到了关节炎基金会生物医学科学拨款和美国心脏协会对C.H.Damsky的资助，以及国家癌症研究所对D.D.Schlaepfer的公共卫生服务拨款R29 CA75240的支持。D.Ilić得到了美国心脏协会博士后奖学金的支持。E.A.C.Almeida由美国国立卫生研究院资助T32-DE07204。