V（V）实际上所有真核细胞都含有线粒体，线粒体产生了大多数需要生长和分裂的ATP细胞。线粒体的形状和分布都可以根据细胞的特殊能量需求进行调整。例如，在肌肉纤维中，线粒体被组织成规则的柱状排列在肌动蛋白束之间(Bakeeva等人，1978年). 在昆虫的精子发生过程中，线粒体融合成几个大的细胞器，然后沿着生长的鞭毛延伸(富勒，1993年). 许多其他类型的细胞包含一个由相互连接的管状线粒体膜组成的网状物，遍布细胞质(Bereiter-Hahn，1990年;Bereiter-Hahn和Voth，1994年). 产生和/或维持这些不同线粒体形态和分布所需的分子机制尚不清楚。
芽殖酵母酿酒酵母包含线粒体小管的分支网络，位于质膜附近，均匀分布在外周细胞质中（有关综述，请参阅赫尔曼和肖，1998年). 维持这种管状网络需要线粒体室和细胞骨架结构之间的相互作用，包括肌动蛋白(Lazzarino等人，1994年;Simon等人，1995年;赫尔曼等人，1997年)和中间丝(麦康奈尔和亚菲，1992年). 两种线粒体外膜蛋白，Mmm1p(毫米,1
米伊托软骨米形态学米维护；Burgess等人，1994年)和Mdm10p(多学科发展模型,米伊托软骨d日分配和米形态；Sogo和Yaffe，1994年)，似乎介导线粒体与肌动蛋白丝的连接(Boldogh等人，1998年)在缺乏这些或另一种膜蛋白Mdm12p的菌株中(Berger等人，1997年)线粒体网络转化为巨大的球形细胞器。另外两种外膜蛋白，与动力相关的GTPase Mgm1p(亿立方米;米伊托软骨克烯醇米维持）和跨膜GTPase Fzo1p(fzo公司;（f）u个z（z）zy公司o个离子），也调节线粒体形态。Mgm1p的功能尚不清楚，但缺乏该蛋白的细胞含有严重聚集的线粒体膜(琼斯和方曼，1992年;Guan等人，1993年; Shepard，K.A.和M.P.Yaffe。1997分子生物学。单元格.8:444a；Gorsich，S.和J.M.Shaw，未出版）。Fzo1p GTPase调节线粒体融合，Fzo1 p功能的丧失导致线粒体网络迅速断裂(赫尔曼等人，1998年).
我们之前报告了一组多学科发展模型线粒体分布和形态缺陷的突变体(赫尔曼等人，1997年). 在这些菌株中，mdm29-1型线粒体网络塌陷到细胞的一侧，形成一个功能正常的细长线粒体膜团，保留线粒体DNA，并在分裂期间有效地运输到芽中。MDM29型与相同DNM1（DNM1）并编码酵母中三种动力蛋白相关蛋白之一(Gammie等人，1995年). 动力蛋白包含一个高分子量GTPase家族，定位于多种不同的细胞结构(Chen等人，1991年;范德布利克和梅耶罗维茨，1991年;De Camilli等人，1995年;Liu和Robinson，1995年;沃诺克和施密德，1996年;施密德，1997年;Urrutia等人，1997年). 哺乳动物动力蛋白是该家族成员中最具特征的一种，已被证明能在涂有氯氰菊酯的凹坑底部周围组装成项圈(Takei等人，1995年). 这些衣领中的动力蛋白随后水解GTP被认为可以刺激膜断裂活性，从而释放内吞小泡(Herskovits等人，1993年;范德布利克等人，1993年;Damke等人，1994年,1995;Hinshaw和Schmid，1995年;Takei等人，1995年;斯威策和欣肖，1998年). 酵母Dnm1蛋白（Dnm1p）最初被认为是哺乳动物动力蛋白的同源物。然而DNM1（DNM1）不要阻止信息素受体的内吞作用酿酒酵母(Gammie等人，1995年). 此外，dnm1突变不影响其他细胞运输途径，包括分泌途径和液泡蛋白分选途径。因此，Dnm1p在体内的确切功能尚不清楚。
在本报告中，我们提供证据表明Dnm1p控制酵母线粒体膜的形态和皮层分布。突变分析表明，Dnm1p的预测GTPase结构域是其体内活性所必需的。在野生型细胞中，Dnm1蛋白分布在与线粒体网络共定位的细胞皮层均匀分布的斑块中。这些含有Dnm1p的结构可以调节线粒体的分支或分裂，也可以作为附着位点在细胞外围均匀分布线粒体网络。
材料和方法
酵母方法
标准方法用于生长、转化和基因操作S公司.酿酒如前所述制备富培养基（YP-葡萄糖和YP-甘油）、合成培养基（合成葡萄糖[SD]和合成半乳糖[SGal]）和含有5-氟有机酸（5-FOA）的培养基(Sherman等人，1986年).
菌株
大肠杆菌菌株DH5α和JM109(Promega公司。）用于克隆和质粒的细菌操作。表中列出了本研究中使用的酵母菌株JSY1542（含基因组DNM1-HAc（c）)通过集成3×HA生成-URA3公司-密码子756和757之间的3×HA（血凝素）盒DNM1（DNM1）JSY1539中的编码区域(Schneider等人，1995年). 经过重组和丢失的细胞URA3公司通过在5-FOA上生长来选择盒的一部分（通过PCR确认）。由此产生的JSY1542菌株表达了一个全长Dnm1蛋白，该蛋白包含插入在多肽链最后一个氨基酸之前的3×HA表位（通过Western blotting和多克隆抗HA抗体进行确认；加州里士满伯克利抗体公司）。JSY1678（含基因组镀锌-DNM1)也是通过集成GAL1-URA3-GAL1磁带的上游DNM1（DNM1）JSY1238中的编码区域(Schneider等人，1995年)并为选择URA3公司5-FOA损失。起始密码子上游−100 bp至−10 bp的基因组区域被替换为镀锌1发起人。
表一
| 应变 | | 基因型*
| | 来源/参考 |
|---|
| 2010财年 | |
材料αura3-52 leu2Δ1
| |
Winston等人，1995年
|
| 250财年 | |
材料αura3-52 leu2Δ1 his3Δ200 trp1Δ63
| |
Winston等人，1995年
|
| JSY1236型 | |
马塔·乌拉3-52 mdm29-1
| | 本研究 |
| JSY1943型 | |
MATa URA-352亮2Δ1 his3Δ200 mdm29-2
| | 本研究 |
| MS3031号 | |
材料αura3-52 ade2-101 leu2-3112 his3Δ200 dnm1：：his3
| |
Gammie等人，1995年
|
| JSY1238型 | |
MATa ura3-52 leu2Δ1 his3Δ200
| | 本研究 |
| JSY1361型 | |
MATa ura3-52 leu2Δ1 his3Δ200 dnm1：：his3
| | 本研究 |
| JSY1542型 | |
MATa ura3-52 leu2Δ1 his3Δ200 DNM1-HAc（c）
| | 本研究 |
| JSY1678型 | |
MATa ura3-52 leu2Δ1 his3Δ200 GAL1-DNM1
| | 本研究 |
| JSY1781型 | |
MATa/MATαura3-52/ura3-52 leu2Δ1/leu2△1 his3Δ200/his3 DNM1-HAc（c） /DNM1-HAc（c）
| | 本研究 |
| JSY1729型 | |
MATαhis3 leu2 mdm10:：URA3 DNM1-HAc（c）
| | 本研究 |
| 6210瑞典克朗 | |
MATαleu2-3112 his3Δ200 ura3-52 trp1-Δ901 lys2-801 suc2-Δ9 GAL
| | S.埃姆 |
| RH268-1C型 | |
MATa his4 leu2 ura3酒吧1-1端
| |
Raths等人，1993年
|
| RH266-1D型 | |
MATa ura3 leu2他的酒吧1-1端
| |
Raths等人，1993年
|
| JSR18Δ1 | | 6210瑞典克朗；vps18Δ1:：TRP1
| |
Robinson等人，1991年
|
| 百万分之三 | | 6210瑞典克朗；vps4:：TRP1
| |
Babst等人，1997年
|
| BWY18型 | |
MATa leu2-3112 his3Δ200 ura3-52 trp1-Δ901 pan1-20
| |
Wendland等人，1996年
|
| JSY1914型 | |
材料αura3 his3
| | 本研究 |
| JSY1916型 | |
MATa ura3 his3 mdm10:：ura3
| | 本研究 |
质粒
第RS415页-DNM1（DNM1）（pDO7）包含DNM1（DNM1）编码区两侧有419 bp上游序列和401 bp下游序列，通过将PCR产物克隆到pRS415的BamHI位点而制备(欧洲标准化委员会,LEU2级; Stratagene，La Jolla，CA）。含有DNM1（DNM1）已测序。第425页-DNM1（DNM1）通过克隆pRS415中的BamHI片段构建（pDO13）-DNM1（DNM1）进入BamHI消化的pRS425（2微米，LEU2级; Stratagene）。第213页-DNM1（DNM1）通过克隆pRS415中的BamHI片段构建-DNM1（DNM1）进入BamHI消化的pYEp213（2微米，LEU2级). pRU1型-DNM1（DNM1）和pRL1-DNM1（DNM1）通过从pRS415克隆BamHI片段构建-DNM1（DNM1）分别放入BamHI消化的pRU1和pRL1中（见下文）。上述所有质粒补充了dnm1零应变JSY1361（见表).
来自YCp50的质粒(Rose等人，1987年)和p366（P.Hieter，Johns Hopkins University，Baltimore，MD）穿梭载体被修改以删除ARS1中唯一的BglII位点。YCp50型(欧洲标准化委员会URA3)和第366页(欧洲标准化委员会LEU2)用BglII消化，末端填充以形成钝端，并结扎以使载体再循环（在结扎的载体中创建新的ClaI位点）。所得质粒命名为pRhinoURA3公司/1（pRU1）和pRhinoLEU2级/1（pRL1）。这两种质粒都保持低拷贝E类.大肠杆菌和酵母。
在一些实验中，用质粒pDO10转化菌株，以可视化标记有Cox4–GFP（绿色荧光蛋白）的线粒体隔室。为了构建pDO10，一个来自pOK29的NotI-XhoI限制性片段（包含Cox4p在框架内融合到NH的线粒体靶向序列）2GFP末端；由R.Jensen提供）连接到pRS415(LEU2级).
mdm29-1突变到DNM1位点的定位
的遗传作图mdm29型分几个步骤进行。第一，mdm29-1型与含有trp1型突变等位基因。对该交叉产生的四分体的分析表明mdm29-1型着丝粒连锁（1.35 cM，37个四分体）。第二，mdm29-1型在与从美国类型培养库（马里兰州罗克维尔）获得的定位菌株集合的杂交中，定位于染色体XII（与asp5/aat2位点相连；14.29 cM，28个四分体）。第三，通过交叉进行互补分析mdm29-1型在靠近第十二染色体着丝粒的基因中含有突变的菌株。随后的研究表明，在mdm29-1型未在二倍体杂合子中补充mdm29-1型和dnm1（MS3031；Gammie等人，1995年). 减数分裂分离分析mdm29-1/dnm1二倍体证实mdm29-1型与dnm1. Thednm1Rose实验室的零株（MS3031）显示出线粒体形态缺陷，与在mdm29型突变体。含有野生型的质粒pDO7和pDO13（见上文）DNM1（DNM1）基因完全补充了线粒体形态缺陷mdm29-1型和dnm1无效突变株。
mdm29突变等位基因的测序及mdm29/DNM1的破坏
的重叠段DNM1（DNM1）从酵母基因组DNA中扩增出的基因MDM29型/DNM1（DNM1）（JSY1238），mdm29-1型（JSY1236），以及mdm29-2型（JSY1943）株。将来自三次重复反应的PCR产物汇集、纯化（加利福尼亚州查茨沃斯Qiagen），并在两条链上测序（犹他大学卫生科学测序设施）。野生型DNM1（DNM1）FY菌株背景的基因序列与酵母菌属基因组数据库（SGD）。然而，我们的DNM1（DNM1）序列和SGDDNM1（DNM1）序列与报告的不同Gammie等人（1995年）从蛋氨酸起始密码子的第一（1）个核苷酸开始计算，序列由Gammie等人（1995年）包含9个额外的核苷酸（5′-TATCACCTG-3′），插入DNM1（DNM1）顺序。此外，核苷酸370，在Gammie等人（1995年）序列，是我们序列和SGD中的C。这些变化改变了F区预测的氨基酸序列122我ISPD公司IPG至F122我H（H）IPG。本研究中使用的所有图谱、质粒和菌株都包含较短的DNM1（DNM1）SGD中列出的顺序。
A类dnm1FY菌株背景中的零突变(Winston等人，1995年)通过使用包含HIS3型基因（pRS403；地层基因）与DNM1（DNM1）-侧翼序列。产生的结果dnm1：：HIS3中断（缺少所有DNM1（DNM1）编码序列）通过从His中分离的基因组DNA的Southern印迹证实+转化剂。
定点突变
包含DNM1（DNM1）编码区和侧翼5′和3′序列亚克隆到p-ALTER-1载体的BamHI位点(Promega公司。). 使用寡核苷酸进行定点突变，以产生制造商描述的不同点突变(Promega公司。). GTPase缺失结构是通过在起始密码子后添加BglII位点1014核苷酸生成的。野生型中存在一个额外的BglII站点DNM1（DNM1）在Dnm1p起始密码子之后排列15个核苷酸。随后去除BglII消化/再消化DNM1（DNM1）编码序列对应于氨基酸8-338，并导致编码氨基酸7-339的序列的帧内融合（GTPase缺失）。突变体dnm1通过限制性消化和序列分析确认的序列亚克隆到pRU1（如上所述）或YEp213(LEU2级)并引入JSY1238（野生型）、JSY1361(dnm1Δ)和JSY1678(镀锌-DNM1)菌株。按照对mdm29型突变等位基因。
在缺乏尿嘧啶的合成葡萄糖培养基中生长的菌株中检测GTP结构域突变对线粒体形态的影响（以保持低拷贝pRU1欧洲标准化委员会质粒）或缺乏亮氨酸的合成葡萄糖培养基（以保持高拷贝YEp213 2μ质粒）。野生型Dnm1p在镀锌-DNM1该菌株是通过在缺乏尿嘧啶（pRU1）或亮氨酸（YEp213）的合成半乳糖培养基中培养过夜而获得的。
Dnm1p诱导和耗竭研究
为了检测Dnm1p诱导时间过程中的线粒体形态变化，JSY1678细胞（携带基因组镀锌-DNM1基因）在含有2%葡萄糖的合成培养基中在30°C下培养16小时，以耗尽细胞内源性Dnm1蛋白。稀释并生长3小时以获得对数期培养物后，将细胞制成颗粒，用dH清洗2O、 并重新悬浮在含有2%半乳糖的新鲜合成培养基中，以诱导镀锌-DNM1基因。在耗尽时间过程中，将JSY1678细胞在含2%半乳糖的合成培养基中在30°C下培养16 h，稀释成含半乳糖培养基，生长到对数相，造粒，在dH中洗涤2O、 并重新悬浮在含葡萄糖的合成介质中，以关闭镀锌-DNM1基因。对100μl等分DiOC的线粒体形态进行评分6-在转移到新培养基后，染色细胞在不同时间被去除。培养物的密度保持在0.5–2.0 OD之间600在实验过程中。在对照实验中，含有DNM1（DNM1）由其自身启动子（JSY1238）表达的基因在同一时间段内维持野生型线粒体网络。
用SDS-PAGE和Western blotting分析从等量细胞制备的蛋白质提取物(哈洛和莱恩，1988年)使用针对Dnm1p的COOH末端（如下所述）产生的亲和纯化兔多克隆抗血清的1:2500稀释液。为了控制蛋白质负载量的差异，剥离印迹并用细胞溶质标记物3-PGK（分子探针，尤金，OR）的抗体进行重制。使用ECL（NEN™生命科学产品，马萨诸塞州波士顿）进行检测。使用密度测定法（NIH Image软件）测定Dnm1p表达水平镀锌1启动子（JSY1678）相对于内源性DNM1（DNM1）启动子（JSY1238）。
亲和纯化抗Dnm1p抗体的制备
将编码Dnm1p的COOH末端氨基酸412-757的1-kb EcoRI片段亚克隆到pGEX-2T（128/129）表达载体（M.Blanar，Bristol-Myers Squibb，Princeton，NJ）中，以创建pGEX-2-T-DNM1-C质粒。E类.大肠杆菌含有pGEX-2T-DNM1-C的BL21-（DE3）细胞表达65-kD谷胱甘肽-S-转移酶（GST）-DNM1412–757融合蛋白，在谷胱甘肽Sepharose 4B珠上纯化(法玛西亚生物技术公司（新泽西州皮斯卡塔韦），在8%SDS-PAGE凝胶上运行，切除并用于免疫兔子（伯克利抗体公司）。在COOH末端融合到6×HIS残基的可溶性Dnm1p（pET23a-DNM1-3）表达于E类.大肠杆菌BL21-（DE3）细胞，在His-Bind树脂（威斯康星州麦迪逊Novagen公司）上通过亲和层析纯化，并按照制造商的建议与溴化氰活化的Sepharose 4B偶联(法玛西亚生物技术公司). 兔多克隆抗-GST-Dnm1412–757融合蛋白抗体在Dnm1-6XHISp-Sepharose柱上亲和纯化，在PBS中平衡，pH 7.2，浓缩至0.35 mg/ml（使用Centricon-30过滤装置；Amicon Corp.，Easton，TX），并在添加5 mg/ml BSA（第五组分；西格玛化学公司。，密苏里州圣路易斯）。
Dnm1-HA的免疫定位C类和野生型Dnm1蛋白质
基本上按照所述进行间接免疫荧光(罗德和肖，1996年)除表达Cox4–GFP（pDO10）的细胞在4.4%甲醛中固定2h以保持GFP荧光外。为了检测HA表位，用以下抗体培养细胞：(一)1:1000稀释1 mg/ml小鼠单克隆抗HA抗体14小时（目录号MMS-101P-500；伯克利抗体公司）(b条)2.4 mg/ml山羊抗鼠多克隆抗体（目录号115-005-003；Jackson ImmunoResearch，West Grove，PA）的1:10稀释液(c（c）)1.8 mg/ml鼠抗羊多克隆抗体（目录号205-005-108；Jackson ImmunoResearch）的1:10稀释液，以及(d日)1.5 mg/ml CY5-结合山羊抗鼠多克隆抗体（目录号115-175-003；Jackson ImmunoResearch）的1:100稀释液。为了检测野生型Dnm1蛋白（缺少COOH末端HA表位），用以下物质培养细胞：(一)1:50稀释0.345 mg/ml亲和纯化兔抗-GST-Dnm1412–757抗体和(b条)1:25稀释1.5 mg/ml CY5-结合山羊抗兔多克隆抗体（目录号111-175-144；Jackson ImmunoResearch）。
为了量化Dnm1p/线粒体共定位的程度，通过与Dnm1p（CY5）和线粒体基质标记物（Cox4–GFP）共定位的固定酵母细胞生成1-μm光学切片。生成单个细胞的三维投影以及分离和合并的CY5和Cox4–GFP荧光图像。相对于GFP染色的线粒体网络，对5–10个细胞中的单个CY5点进行打分，以定位于非线粒体位置或线粒体网络，数据表示为与线粒体网络共定位的总点的百分比。
差异沉降和蔗糖梯度分馏
如前所述，在SGal培养基中生长的细胞通过差异沉淀进行分离(Daum等人，1982年;辛塞尔和达姆，1995年;赫尔曼等人，1998年)，除了P10,000线粒体颗粒经过额外的洗涤步骤。简言之，P10,000在破胶缓冲液中再次悬浮（0.6 M甘露醇，20 mM Hepes-KOH，pH 7.4，加上蛋白酶抑制剂混合物），并在1500℃下纺丝克持续5分钟以产生P1,500和S1,500.S系列1,500旋转速度为10000克保持10分钟，得到一个清洗过的P10,000小球和第二个S10,000上清液。使用Bio-Rad Protein Assay（Hercules，CA）测定蛋白质浓度，并使用以下抗体稀释液通过Western blotting分析每个组分中的2μg蛋白质：抗Dnm1p（1:5000）、抗菌素（1:1000；分子探针）和抗3-PGK（1:1000，分子探针）。
P10,000线粒体颗粒进行蔗糖梯度分级，如下所述Walworth等人（1989）.S10,000上清液在100000下旋转克1小时（SW50.1型转子；贝克曼仪器，Fullerton，CA）生成S100,000和P100,000分数。等量梯度分数或等量S100,000和P100,000用以下抗体稀释液通过Western blotting进行组分分析：抗Dnm1p（1:1000）、抗霉素（1:1000。纳2一氧化碳三和Triton X-100治疗P10,000分数基本上按照描述执行(赫尔曼等人，1998年).
显微镜
用显微镜（Axioplan模型；卡尔蔡司公司。（纽约州桑伍德市）配备了差分干涉对比光学系统、外荧光功能和100×（NA 1.3）物镜（Acroplan-Neofluar型号；卡尔蔡司公司。). 在一些实验中，用连接到显微镜（Optiphot型号；尼康公司。纽约州梅尔维尔），配备60×平面复消色差物镜（NA 1.3；卡尔蔡司公司。). 使用Bio-Read图像捕获软件收集图像，并使用Confocal Assistant软件生成投影（版权归Todd Clark Brelje所有）。按照描述进行电子显微镜检查(赫尔曼等人，1998年).
结果
酵母线粒体形态维持所需的类动力蛋白GTPase Dnm1p
这个mdm29-1型和mdm29-2型突变导致酵母线粒体形态缺陷。使用遗传方法绘制地图mdm29型靠近第十二染色体着丝粒的区域。对该着丝粒附近的开放阅读框的分析表明mdm29型映射到以前分离的一个名为DNM1（DNM1），酵母中三个动力相关基因之一(Gammie等人，1995年). 序列分析表明mdm29-1型突变导致保守NH中氨基酸120后截断2-Dnm1蛋白（Dnm1p）的末端GTPase结构域。这个mdm29-2型等位基因引入一个终止密码子，删除Dnm1p的COOH端26个氨基酸。我们还生成了一个dnm1基因破坏导致的无效等位基因(dnm1Δ). 观察到的表型dnm1Δ与中的相同mdm29-1型和mdm29-2型表明这两个突变等位基因都导致Dnm1p功能完全丧失。
在dnm1Δ细胞，野生型菌株中观察到的高度分支的线粒体网络（图。,通配符)塌陷形成一个长管状结构，仍然局限于细胞皮层（图。,dnm1Δ). DNA特异性染料DAPI染色(Pringle等人，1989年)表明这些细长的细胞器含有线粒体DNA核仁（图。
D类). 线粒体表型由dnm1Δ突变与先前分离的毫米1,mdm10型、和中密度12突变，将线粒体网络转化为一个或几个大的球形细胞器(Burgess等人，1994年;Sogo和Yaffe，1994年;Berger等人，1997年; 例如，参见图。
G公司).
野生型线粒体形态(DNM1（DNM1）)以及dnm1Δ突变菌株。线粒体形态学DNM1（DNM1）（JSY1238，左边)以及dnm1Δ（JSY1361，正确的)使用基质靶向形式的绿色荧光蛋白（Cox4–GFP）对菌株进行可视化。芽位于每个面板的左上角。棒材，2μm。
折叠dnm1Δ线粒体保留线粒体DNA核仁。DNM1（DNM1）（JSY1238，A类和B类)以及dnm1Δ（JSY1361，C类和D类)Cox4–GFP标记菌株(A类和C类)可视化线粒体隔室和DAPI(B类和D类)使细胞核可视化(N个)和线粒体DNA(B类和D类,白色箭头). 芽位于每个面板的右上方。棒材，2μm。
Dnm1p与酵母线粒体网络共定位。野生型（JSY1781，A–F; JSY1238，M–R（M–R）)或mdm10型突变型（JSY1729，G–L)表达Dnm1–HA的细胞C类第页(A–L)或野生型Dnm1p(M–R（M–R）)固定并孵育，无一级抗体(A–C,G–I型、和M–O型)，抗HA抗体(D–F型和J–L型)，或反Dnm1p412–757抗体(P–R（P–R）). CY5结合二级抗体（红荧光B类,E类,H（H）,K（K）,N个、和问)用于可视化Dnm1–HAc（c）和Dnm1蛋白。通过表达基质靶向Cox4–GFP蛋白（绿色荧光A类,D类,G公司,J型,M（M）、和P（P）)在同一个单元格中。合并的CY5和GFP图像如所示C类,F类,我,我,哦、和对.巴，2μm。
透射电镜证实线粒体的分布和形态在dnm1Δ应变（图。). 在野生型细胞中，横切面上的线粒体小管大小均匀，均匀分布在外周细胞质中，并含有明显的嵴（线粒体内膜内陷）（图。
A类). 尽管在dnm1Δ细胞含有正常的嵴，隔室通常表现为一系列较大的小管，局限于细胞的一半（图。,B类和C类). 这些线粒体小管通常相互连接或分支，表明dnm1Δ线粒体膜仍然保留着线粒体网络或网的一些特征（图。,B类和C类)并且没有融合形成一个单一的细长线粒体隔室。
透射电子显微镜DNM1（DNM1）和dnm1Δ细胞。(A类)线粒体图谱(黑色箭头)英寸DNM1（DNM1）细胞（JSY1238）均匀分布于外周细胞质中，含有可见的嵴。(B类和C类)线粒体图谱(黑色箭头)英寸dnm1Δ细胞（JSY1361）含有正常嵴，但在细胞一侧出现聚集的扩大小管。条形，500 nm。
尽管它们的形态异常，但许多观察结果表明dnm1Δ线粒体没有严重受损。首先，线粒体异常dnm1Δ细胞在分裂期间被有效地运输到芽中（图。,dnm1Δ). 其次，这些线粒体可以用潜在依赖性染料DiOC标记6只会污染活跃的呼吸细胞器(Pringle等人，1989年). 第三，Cox4–GFP融合蛋白（靶向基质；由R.Jensen慷慨提供）也可使染色塌陷dnm1Δ线粒体（图。和)表明线粒体蛋白质输入机制没有受到严重影响。第四，在我们的菌株背景下，细胞dnm1突变在不可发酵的碳源甘油、乳酸和乙醇/乙酸盐上生长得和野生型一样好，这些碳源只能在具有功能线粒体的细胞中代谢。此外dnm1Δ细胞对线粒体具有特异性，不影响其他膜结合结构的形态，包括细胞核（图。
D类)内质网（图。
F类)高尔基体（图。,C类和D类)和液泡（图。
D类). 此外，间接免疫荧光研究表明肌动蛋白的组织（图。
D类)和微管蛋白（图。
H（H）)细胞骨架在dnm1Δ。这些结果表明DNM1（DNM1）在酵母中生成和/或分布分支线粒体网络中起着重要而特殊的作用。
ER形态学为野生型dnm1Δ细胞。驾驶员信息中心(A类和D类)、DAPI(B类和E类)和间接免疫荧光图像(C类和F类)第页，共页DNM1（DNM1）（JSY1238，A–C)以及dnm1Δ（JSY1361，D–F型)用抗Kar2p抗血清染色的细胞。芽位于每个面板的上部。白色箭头C类和F类用抗Kar2p抗血清标记核周ER。棒材，2μm。
高尔基体形态为野生型dnm1Δ细胞。共聚焦显微镜图像DNM1（DNM1）（JSY1238，A类和B类)以及dnm1Δ（JSY1361，C类和D类)用外周高尔基体膜标记物Sec7p-EGFP标记的细胞。白色箭头A类和C类指示放大的单元格，如B类和D类分别是。棒材，2μm。
液泡形态为野生型dnm1Δ细胞。差分干涉对比度(A类和C类)和荧光图像(B类和D类)第页，共页DNM1（DNM1）（JSY1238，A类和B类)以及dnm1Δ（JSY1361，C类和D类)用液泡膜特异性苯乙烯染料FM4-64标记细胞。棒材，2μm。
肌动蛋白和微管蛋白细胞骨架组织为野生型dnm1Δ细胞。差分干涉对比图像(A类,C类,E类、和G公司)，罗丹明-球蛋白染色肌动蛋白(B类和D类)和抗管蛋白染色(F类和H（H）)第页，共页DNM1（DNM1）（JSY1238；A类,B类,E类、和F类)以及dnm1Δ（JSY1361；C类,D类,G公司、和H（H）)单元格。芽位于每个面板的上部。棒材，2μm。
Dnm1p在酵母细胞中被诱导或抑制时，线粒体形态发生显著变化
为了进一步描述DNM1（DNM1）在体内，我们检测了只携带一个染色体拷贝的细胞的线粒体形态DNM1（DNM1）在镀锌1启动人（JSY1678）。当该菌株在含有葡萄糖的培养基中培养过夜时（该培养基抑制镀锌1启动子），则无法检测到Dnm1p（图。
B类，0分钟；U型，未检测到），并且>95%的细胞包含崩溃的线粒体网络（图。
B类,闭合三角形; 和8E类,空). 转移到含半乳糖的培养基中诱导Dnm1p表达15分钟后，线粒体形态为空的群体中细胞的百分比开始下降，并且出现了具有更多分支“中间”形态的细胞（图。
B类,开放式广场; 和8E类,中级). 如图中的共焦显微镜投影所示。
E类，具有这种中间形态的细胞似乎正在沿着细胞外围延伸线粒体膜的小管，形成一个环。到140分钟，延伸到皮层的小管开始形成野生型线粒体网络特有的额外分支，在稍后的时间点（200分钟），在种群中，几乎100%的细胞表现出野生型线粒体形态（图。
B类,闭合的圆; 和8E类,重量). 线粒体形态的这些变化与Dnm1蛋白细胞内水平的增加有关。如下图所示。
B类，感应中Dnm1p的稳态水平镀锌-DNM1未检测到应变增加(U型，在时间零点）至1.1（在200分钟）DNM1（DNM1）菌株（包含DNM1（DNM1）基因从其自身的启动子表达）。在对照实验中，DNM1（DNM1）细胞在同一时间过程中维持野生型线粒体网络（图。
A类,闭合的圆).
线粒体形态变化对DNM1（DNM1）基因表达。空(闭合三角形)，中间(开放式广场)、和野生型(闭合的圆)线粒体形态通过DiOC进行定量6含有野生型单个基因组拷贝的细胞染色DNM1（DNM1）（JSY1238；A类和C类)或镀锌-DNM1（JSY1678；B类和D类)基因。(A类)DNM1（DNM1）细胞从葡萄糖转移到半乳糖。(B类)镀锌-DNM1细胞从葡萄糖转移到半乳糖。(C类)DNM1（DNM1）细胞从半乳糖转移到葡萄糖。(D类)镀锌-DNM1细胞从半乳糖转移到葡萄糖。表示为镀锌-DNM1相对于DNM1（DNM1）下图显示了选定时间点的应变B类和D类.（重量=DNM1（DNM1）= 1.0;U型，未检测到）。(E类)Null的典型示例(闭合三角形)，中间(开放式广场)和WT(DNM1（DNM1）;闭合的圆)线粒体形态。芽位于每个面板的上部。棒材，2μm。
我们还发现，当细胞从半乳糖转移到葡萄糖以关闭细胞的转录时，野生型线粒体网络崩溃镀锌-DNM1基因（图。
D类). 在这些实验中，>95%生长在半乳糖培养基中的细胞含有高度分支的野生型线粒体网络（图。
D类,闭合的圆; 和8E类,重量). 虽然Dnm1p的初始稳态水平由染色体表达镀锌-DNM1构建体比在野生型中观察到的高1.9倍DNM1（DNM1）应变（图。
D类Dnm1p的过表达水平似乎不会在其他野生型细胞中产生额外的线粒体表型。转移到葡萄糖中60分钟后，Dnm1p的细胞内水平下降到DNM1（DNM1）控制应变（图。
D类，相对蛋白质水平=0.9），支链开始从线粒体网络中消失，产生中间线粒体形态（图。
D类,开放式广场; 和8E类,中级). 在稍后的时间点，这些细胞中的线粒体形态会进一步塌陷，从而产生具有以下特征的细长线粒体结构：dnm1零单元（图。
D类,闭合三角形; 和8E类,空). 同样，包含DNM1（DNM1）从其自身启动子表达的基因在相同的时间过程中维持野生型线粒体网络（图。
C类,闭合的圆). 这些结果表明，线粒体形态的变化与Dnm1p表达水平的变化直接相关。
线粒体形态维持中Dnm1p功能需要预测的GTPase结构域
与动力蛋白家族的其他成员一样，NH2-Dnm1p的末端结构域包含一个预测的GTP结合基序和保守序列元件GSQSSGKS42（图。
A类,G1号)、DLPG178（图。
A类,G3型，未显示顺序）和TKLD247（图。
A类,第四集团，未显示顺序）(Bourne等人，1991年). 虽然G2基序包含保守的苏氨酸(Bourne等人，1991年)Dnm1p未在dynamins中进行实验定义，它在位置62处含有苏氨酸，可能充当G2结构域（图。
A类). 为了确定预测的GTP结合基序是否在DNM1（DNM1）对改变GTPase的核苷酸结合和/或水解特性的功能、点突变很重要（图。
A类)被引入DNM1（DNM1）低拷贝（pRU1）或高拷贝（YEp213）中包含的基因(《玫瑰和花椰菜》（Rose and Broach），1990年)质粒并在酵母中表达（图。
B类). G1dnm1K41A公司预计突变将消除核苷酸结合(Bourne等人，1991年;范德布利克等人，1993年)，G1dnm142N系列预计突变会降低GTP的亲和力(费格和库珀，1988年;Herskovits等人，1993年)和G2dnm1T62A型突变相当于p21中的突变ras（拉斯维加斯）被认为干扰p21的GTP酶ras（拉斯维加斯）GAP绑定(Adari等人，1988年;Cales等人，1988年)和raf激酶相互作用(Vojtek等人，1993年). A类dnm1缺少整个NH的突变体2-还构建了末端GTP结合域(dnm1−GTP酶). 这些都没有变异dnm1从低拷贝（pRU1，未显示）或高拷贝质粒（YEp213）表达的基因可以修复线粒体形态缺陷dnm1零应变（图。
C类,dnm1：：HIS3)表明体内Dnm1p功能需要GTP结合和/或水解。此外，所有四个突变体dnm1当在含有野生型拷贝的细胞中表达低拷贝（pRU1，未显示）或高拷贝数质粒（YEp213）时，构建物诱导显性线粒体形态缺陷DNM1（DNM1）基因（图。
D类,阴影条). 这些突变体构建物不会在过度表达野生型Dnm1蛋白的细胞中造成跨显性线粒体形态缺陷。（比较实心钢筋在图中。
E类具有阴影条从图。
D类; 野生型Dnm1p由基因组表达镀锌-DNM1在稳态水平上构造大约是野生型的两倍DNM1（DNM1）单元格。）所有四种GTP-结合域突变在野生型细胞中诱导线粒体形态缺陷的能力进一步支持了Dnm1p在控制线粒体形态方面起主要作用的观点。此外，这些显性表型表明Dnm1p与线粒体形态维持所需的额外细胞成分有关。
GTPase结构域突变DNM1（DNM1）在体内引起显性干扰表型。(A类)四个NH的位置2-显示了不同dynamin家族成员之间保守的末端GTP-结合共有元件（G1–G4）。点突变(箭头)以及缺失突变(支架)指出了本研究中使用的方法。G1dnm1K41A公司突变和缺失突变预计会消除核苷酸结合，G1dnm142N系列预计突变将比GTP更紧密地结合GDP，G2dnm1T62A型突变相当于ras GTPase中的一个突变，它消除了效应器相互作用（参考文献见正文）。(B类)Dnm1p野生型和GTPase突变形式的内源性和质粒表达水平。用抗Dnm1p抗血清进行Western blotting分析每个菌株的总细胞提取物。车道1,DNM1（DNM1）（JSY1238）；车道2,dnm1Δ(dnm1:：HIS3JSY1361）；车道三,dnm1Δ+pRU1型-dnm1K41A公司(欧洲标准化委员会，单个副本）；车道4,dnm1Δ+是213-dnm1K41A公司（2μ，多拷贝）；车道5,dnm1Δ+pRU1型-dnm1T62A型; 车道6,dnm1Δ+是213-dnm1T62A型; 车道7,dnm1Δ+pRU1型-dnm142N系列; 车道8,dnm1Δ+是213-dnm142N系列黑色箭头表示野生型和突变型Dnm1蛋白的全长形式。Dnm1p细分产品(支架)在过表达Dnm1蛋白的细胞中积累。的表达式dnm1/-pRU1和YEP213质粒中的GTPase缺失突变蛋白与其他突变体的类似（未显示）。(C类)DiOC公司6染色用于量化多拷贝载体单独的能力（YEP213；LEU2级)，或包含野生型的向量(DNM1（DNM1）)或突变(dnm1/K41A、，dnm1/T62A、，dnm1/S42N，dnm1/-GTPase）形式DNM1（DNM1）恢复野生型线粒体形态的基因dnm1：：HIS3空单元格（JSY1361）。在每种情况下显示野生型线粒体形态的细胞百分比(开放式钢筋). (D类)中描述的构造的功能C类诱导野生型线粒体形态表型DNM1（DNM1）DiOC对菌株（JSY1238）进行了定量6染色。在每种情况下显示野生型线粒体形态的细胞百分比(阴影条). (E类)中描述的突变结构C类(dnm1/K41A、，dnm1/T62A、，dnm1/S42N和dnm1/-GTPase）未能在基因组中过度表达Dnm1p的细胞中诱导线粒体形态缺陷镀锌-DNM1基因（JSY1678）(封闭式钢筋; 过度表达的Dnm1p水平大约是野生型的两倍DNM1（DNM1）应变）。在野生型水平表达Dnm1p的菌株中这些突变引起的显性干扰表型(D类;DNM1（DNM1），JSY1238；阴影条)显示以进行比较。
FM 4-64在dnm1Δ细胞中以野生型动力学发生胞吞作用
Dynamin突变已被证明可导致两种细胞的内吞缺陷黑腹果蝇和哺乳动物细胞(Poodry和Edgar，1979年;Herskovits等人，1993年;范德布利克等人，1993年). 相反，细胞缺乏DNM1（DNM1）FM4-64是一种亲脂性苯乙烯染料，用作酵母内吞的标记物，在其内化过程中没有表现出缺陷(Vida和Emr，1995年). 野生型和dnm1Δ在0°C下用FM 4-64标记细胞30分钟，使染料积聚在质膜中（表; 图。,A类和B类). 随后清洗细胞以去除游离染料，并将其移至30°C，在60分钟的时间过程中监测FM 4-64的内化。如表所示和图。，FM 4-64在dnm1Δ菌株和一个等基因野生型菌株是相同的。在30°C下10分钟后，质膜中的FM 4-64信号（表,颗粒物)仍然可见，并且有小的荧光内体样中间产物(E类)开始在细胞质中积聚（图。,C类和D类). 20分钟后，PM相关信号降低，大多数FM 4-64荧光集中在这些内吞体样隔室中（表; 图。,E类和F类). 在40分钟的时间点，FM 4-64信号开始在液泡膜中积聚（表,V（V）)，尽管仍然可以看到一些点状细胞质结构（图。,G公司和H（H）). 到60分钟时，大多数FM 4-64信号与液泡膜有关（表; 图。,我和J型). FM 4-64内化动力学的发现dnm1Δ这些细胞和野生型细胞无法区分，这表明酵母质膜的大量内吞不需要Dnm1p。
表二
| | | | FM 4-64本地化 |
|---|
| 时间 | | 应变 | | 颗粒物 | | 项目经理+工程师 | | 电子+视频 | | V（V） |
|---|
|
最小值
| | | | | | | | | | |
| 0*
| | 重量 | | 50/50 (100%) | | 0/50 (0%) | | 0/50 (0%) | | 0/50 (0%) |
| |
dnm1Δ
| | 50/50 (100%) | | 0/50 (0%) | | 0/50 (0%) | | 0/50 (0%) |
| 10 | | 重量 | | 0/68 (0%) | | 68/68 (100%) | | 0/68 (0%) | | 0/68 (0%) |
| |
dnm1Δ
| | 0/55 (0%) | | 55/55 (100%) | | 0/55 (0%) | | 0/55 (0%) |
| 20 | | 重量 | | 0/67 (0%) | | 67/67 (100%) | | 0/67 (0%) | | 0/67 (0%) |
| |
dnm1Δ
| | 0/58 (0%) | | 58/58 (100%) | | 0/58 (0%) | | 0/58 (0%) |
| 40 | | 重量 | | 0/56 (0%) | | 0/56 (0%) | | 56/56 (100%) | | 0/56 (0%) |
| |
dnm1Δ
| | 0/50 (0%) | | 0/50 (0%) | | 50/50 (100%) | | 0/50 (0%) |
| 60 | | 重量 | | 0/57 (0%) | | 0/57 (0%) | | 0/57 (0%) | | 57/57 (100%) |
| |
dnm1Δ
| | 0/60 (0%) | | 0/60 (0%) | | 0/60 (0%) | | 60/60 (100%) |
FM 4-64内化动力学。DNM1（DNM1）（JSY1238）和dnm1Δ在YPD培养基中生长的（JSY1361）细胞在0°C下用FM 4-64标记30分钟，清洗，并在30°C的新鲜培养基中追逐60分钟(A类和B类), 10 (C类和D类), 20 (E类和F类), 40 (G公司和H（H）)、和60(我和J型)FM 4-64分布的最小得分（见表)并拍照留念。典型差分干涉对比度(A类,C类,E类,G公司、和我)和荧光(B类,D类,F类,H（H）、和J型)图中显示了dnm1Δ菌株和与野生型相同。棒材，2μm。
细胞内吞缺陷不会引起酵母线粒体形态的改变
为了进一步研究线粒体形态缺陷在dnm1这是内吞缺陷的继发结果，我们检测了在内吞过程中不同阶段被阻断的特征良好的酵母突变体中的线粒体网络。这个结束3和结束4突变阻断了内吞作用的内化步骤(Raths等人，1993年;Benedetti等人，1994年).结束13/vps4不影响内化，但会影响内化物质向液泡的传递(Munn和Riezman，1994年;Babst等人，1997年).第18版突变体完全缺乏类似液泡的结构（末端内吞室）(Robinson等人，1991年)、和面板1突变体积累类似早期内体的隔室(Wendland等人，1996年). 我们观察了这些突变体中的线粒体形态（图。,B–F类)以及它们的等基因野生型亲本（图。
A类数据未显示），线粒体形态无缺陷。因此，在dnm1突变不是内吞缺陷的间接结果。
线粒体形态是阻碍内吞作用的突变株中的野生型。用Cox4–GFP对野生型线粒体形态进行可视化(A类),结束3(B类),结束4(C类),第4版(D类),第18版(E类)、和面板1(F类)在突变体中产生内吞缺陷的细胞。野生型线粒体形态观察A类在>95%的突变细胞中也观察到。芽位于每个面板的上部。棒材，2μm。
Dnm1p发现于细胞皮层与线粒体网络共染的点状结构中
Dnm1p在野生型细胞中的定位与其在线粒体形态维持中的作用一致。我们进行了间接免疫荧光研究，以定位Dnm1-HA标记蛋白（Dnm1-HAC类p） 在酵母中（图。,B类,E类,H（H）、和K（K）). 用Cox4–GFP融合蛋白同时显示同一细胞中的线粒体网络（图。,A类,D类,G公司、和J型). 共焦显微镜用于评估Dnm1–HA的程度C类p合并图像中线粒体网络的共定位（图。,C类,F类,我、和我). 在野生型菌株中，Cox4–GFP显示的酵母线粒体网络位于细胞皮层，并均匀分布在细胞周围（图。,A类和D类、绿色荧光、Cox4–GFP）。在表达Dnm1–HA的细胞中C类p蛋白，HA表位特异性单克隆抗体（图。
E类、红色荧光、CY5-结合二级抗体）染色的点状结构也定位于细胞皮层。此外，在整个细胞中观察到荧光雾，这表明还存在细胞质Dnm1–HA池C类蛋白质。Dnm1–HAC类在没有初级抗HA抗体的情况下进行的对照实验中未检测到p染色（图。
B类). 当图中的图像。,D类和E类，被合并（图。
F类)，大多数Dnm1–HAC类CY5显示的p斑点（85%）出现在线粒体小管侧面、线粒体网络分支点或线粒体小管尖端。（黄色区域对应于红色和绿色信号叠加的区域。）当针对Dnm1蛋白的抗体用于染色野生型细胞时，获得了类似的结果（图。,P–R（P–R）). 这些抗体再次染色了细胞皮层的点状结构（图。
问)与线粒体网络共定位（图。
P（P）)在合并图像中（图。
对; 75%共同定位）。
我们担心，一些共定位可能是巧合，因为线粒体形态复杂，线粒体网络和Dnm1p都存在于细胞外周。因此，我们还本地化了Dnm1–HAC类a中的pmdm10型突变菌株(Sogo和Yaffe，1994年)它缺乏线粒体网络，而是含有一个或几个巨大的球形线粒体（图。,G公司和J型). Dnm1–HA的重要部分（57%）C类p融合蛋白（图。
K（K）)仍位于球形线粒体或其附近mdm10型电池（图。
我)，表明这些Dnm1–HAC类含磷结构直接或间接与线粒体室结合。此外，Dnm1–HA的一部分C类p（43%）保留在大脑皮层的点状斑点中mdm10型这表明Dnm1p可能定位于细胞皮层，与线粒体网络无关。
Dnm1p的亚细胞定位
酵母亚细胞组分的免疫印迹分析表明，Dnm1p的一部分与富集的线粒体颗粒有关。从野生型菌株（JSY1238；图。
A类，车道1)进行差异沉降以产生P10,000颗粒（图。
A类，车道2)和一个S10,000上清液（图。
A类，车道三). 用抗Dnm1p、抗-3-PGK（胞浆）和抗霉素（线粒体外膜）抗血清进行免疫印迹，对这些组分进行表征，结果表明，大量的Dnm1p要么是可溶的，要么是与非线粒体膜组分相关的，在10000℃时无法粒化克（图。
A类，车道三). 然而，Dnm1p的一部分与P共分馏10,000颗粒，一种富含线粒体膜的部分（图。
A类，车道2). 清洗P10,000第二次造粒和沉淀物10000克向上清液中释放额外的Dnm1p，表明该蛋白质与该级分中的膜没有紧密结合（图。
A类，比较清洗过的P10,000车道内6使用S10,000清洗车道7). 事实上，最初的P10,000含0.1 M Na的分数2一氧化碳三pH 11.5，释放外周膜蛋白完全破坏了Dnm1p与膜颗粒的结合（图。
G公司).
差异沉淀后Dnm1p在野生型和突变酵母细胞中的分布。酵母细胞被球状化、溶解并在1500℃沉淀克以去除未裂解的细胞和碎片。可溶性提取物在10000克生成（车道1)提取，（车道2)P（P）10,000（含线粒体）和（lane三)S公司10,000.P10,000小球在1500年再次悬浮并沉淀克清除产生的骨料和碎屑（车道4)P（P）1,500和（车道5)S公司1,500.S系列1,500旋转速度为10000克生成（车道6)水洗P10,000和（车道7)S公司10,000用SDS-PAGE分离组分（2μg蛋白质），并用抗Dnm1p、抗-3-PGK（细胞质）和抗菌素（线粒体）血清进行Western blotting分析。菌株：(A类)DNM1（DNM1）（JSY1238）(B类)DNM1（DNM1）+pRU1型-DNM1（DNM1）, (C类)DNM1（DNM1）+pRU1型-dnm1K41A公司, (D类)dnm1Δ（JSY1361）+pRU1-dnm1K41A公司, (E类)MDM10型（JSY1914）(F类)mdm10Δ（JSY1916）。(G公司)P（P）10,000颗粒(M（M）)含有线粒体的细胞被处理以分离外周膜蛋白（0.1 M Na2一氧化碳三)或溶解分离成颗粒的完整膜蛋白（1%Triton X-100）(P（P）)和上清液(S公司)组分，用SDS-PAGE和Western blotting分析抗Dnm1p、抗-3-PGK和抗菌素血清。可溶性细胞色素的释放b条
2和外围设备F10.1M Na后上清液部分的βATP酶亚基2一氧化碳三经Western blotting证实治疗有效（数据未显示）。
在野生型和dnm1Δ菌株。与P相关联的Dnm1p的相对量10,000当额外复制野生型时，差异沉积期间的分数没有显著增加或减少DNM1（DNM1）（图。
B类)或者变异的dnm1K41A公司（图。
C类)该基因通过低拷贝质粒导入野生型细胞。当低拷贝质粒发生突变时，也得到了类似的分离结果dnm1K41A公司（图。
D类),dnm142N系列（未显示），或dnm1T62A型（未显示）基因被引入dnm1Δ应变。此外，当对野生型或dnm1Δ表达DNM1（DNM1）,dnm1K41A公司,dnm142N系列、和dnm1T62A型来自高拷贝质粒的基因（数据未显示）。最后，Dnm1p在mdm10型突变菌株（图。
F类)与野生型没有显著差异（图。
E类).
上述分馏研究并未揭示Dnm1p是否与线粒体膜或P中的其他细胞膜相关10,000颗粒。此外，这些研究并没有解决Dnm1p在离心过程中形成非特定沉淀或被膜截留的聚集体的可能性。为了区分这些可能性，我们分离了P10,000颗粒（图。
A类，车道2)通过在蔗糖密度梯度中浮选（图。;Walworth等人，1989年). 如图所示。
B类，Dnm1p在P中占大多数10,000可溶并保持在梯度的底部（图ii（ii），分数18–20)细胞质蛋白3-PGK（图三，分数20). 然而，部分Dnm1p与分数15中的线粒体外膜蛋白孔蛋白共分馏（图。
B类，图形ii（ii）). 分数15中的Dnm1p峰与高尔基体的标记峰不完全一致（图iv（四），Mnn1p），液泡（图v（v）或质膜（图v（v），气体1p）。尽管ER标记物Dol-P-Man合成酶在梯度中的两个分离良好的峰中被发现（图。
B类，图形iv（四），分数处的峰值7和15)，Dnm1p仅局限于分数15中的ER峰。由于在组分15中也发现了通道蛋白线粒体标记，并且由于在间接免疫荧光实验中Dnm1p与完整的线粒体网络共定位，因此Dnm1p似乎与该组分中的线粒体膜相关。
蔗糖浓度分级后Dnm1p和细胞器膜标记的洗脱曲线10,000来自野生型细胞。(A类)（车道1)提取，（车道2)P（P）10,000、和（车道三)S公司10,000按照图的图例所述，生成并分析馏分。. (B类)P10,000颗粒来自A类重悬于60%蔗糖中，并装载在35-60%蔗糖梯度的底部。将梯度旋转至平衡并分馏，并通过Western blotting和密度测定法分析每个组分的等体积。结果表示为每个分数的总信号百分比。密度（g/ml）；蛋白质（μg/ml）。分数1是梯度的顶部，分数20是梯度颗粒。虚线横切每个图中的分数15。(C类)S公司10,000上清液A类以100000的速度旋转克和生成S的等效体积100,000（车道1)和P100,000（车道2)用SDS-PAGE和Western blotting分析各组分的抗Dnm1p、抗3-PGK、抗霉素、抗Dol-P-Man（内质网）、抗Mnn1p（高尔基体）、抗ALP（液泡）和抗Gas1p（质膜）血清。星号（*）表示液泡腔内的可溶性碱性磷酸酶分解产物，在分馏过程中部分释放(Stepp等人，1997年;元音和佩恩，1998).
确定是否在初始S中找到Dnm1p10,000上清液（图。
A类，车道三)与额外的细胞膜有关，该上清液在100000下进一步分级克以产生S100,000和P100,000虽然ER（Dol-P-Man）、高尔基体（Mnn1p）、液泡（ALP）和质膜（Gas1p）标记在这些条件下沉积，但在P100,000颗粒（图。
C类，车道2)，大多数Dnm1p是可溶的，并留在S中100,000上清液和可溶性细胞质蛋白3-PGK（图。
C类，车道1).
讨论
本文所述的研究确立了Dnm1p是酵母线粒体形态的重要调节器。在dnm1突变体，线粒体膜未能在皮层正确分布，并塌陷到细胞的一侧。相反，Dnm1p功能的丧失对其他细胞质细胞器的形态和分布没有明显影响，包括细胞核、内质网、高尔基体和液泡。尽管它们的形态不同寻常，dnm1线粒体能够产生膜电位并将Cox4–GFP标记蛋白导入线粒体基质，表明基本细胞器功能没有严重受损。与其他酵母线粒体形态突变体不同，它们会迅速丢失线粒体DNA并表现出线粒体遗传缺陷(赫尔曼和肖，1998年),dnm1线粒体保留线粒体DNA，并在分裂期间有效地运输到芽中。总之，我们的结果表明Dnm1p在确定酵母线粒体膜的形状和分布方面起着非常特殊的作用。
Dnm1p在完整细胞中的免疫定位与该蛋白在控制线粒体形态和分布中的作用一致。在野生型细胞中，Dnm1p存在于细胞皮层的点状结构中，与线粒体网络中的分支点以及线粒体小管的尖端和侧面共同定位。这些含有Dnm1p的结构的一部分仍然与mdm10型突变体，表明Dnm1p与细胞器直接或间接相关。这一解释得到以下观察结果的支持：少量Dnm1p在蔗糖密度梯度下与线粒体膜可重复分馏。在这些梯度中（以及在差异沉积研究中），与线粒体相关的总细胞Dnm1p的比例可能因细胞裂解期间线粒体网络的断裂而被低估。我们的亚细胞分馏研究表明，也存在大量Dnm1p的细胞质池。虽然我们很容易推测GTP结合和水解的循环调节Dnm1p与线粒体的可逆结合，但我们没有检测到野生型和GTPase突变型Dnm1蛋白的亚细胞分布差异。然而，我们不能排除Dnm1p的GTP-结合形式与线粒体膜相关的可能性，因为我们无法做出预测结合但不水解GTP的突变。需要进一步的实验来确定GTP结合和水解对Dnm1p–线粒体相互作用的影响。
预测的Dnm1p的GTP结合域中的一个缺失突变和三个不同的氨基酸替换未能修复dnm1应变。其中两个突变是在G1基序中产生的，并预测会降低该蛋白对GTP和GDP的亲和力(dnm1K41A公司;Bourne等人，1991年;范德布利克等人，1993年)，或预测与GTP的亲和力降低(dnm142N系列; Feig等人，1988年；Herskovits等人，1993年). 这些突变蛋白未能拯救dnm1突变表型表明，酵母线粒体网络的维持需要一个功能性Dnm1p-GTPase结构域。为了支持这一解释，我们实验室的初步研究表明，在体外试验中，野生型Dnm1p的细菌表达形式可以结合并水解GTP（Brisch，E.和J.M.Shaw，未发表的数据）。
Dnm1p-GTPase结构域突变也会导致野生型细胞的显性线粒体形态缺陷。通过在同一菌株中过度表达野生型Dnm1蛋白，可以完全修复这些缺陷。哺乳动物动力蛋白的类似突变(Herskovits等人，1993年;范德布利克等人，1993年;Damke等人，1994年)和酵母类动力蛋白Vps1p(Vater等人，1992年)分别在胞吞作用和液泡蛋白分选中引起类似的显性阴性缺陷。就哺乳动物动力蛋白而言，显性负性内吞表型被认为与该蛋白的自组装特性有关(Warnock等人，1996年). 突变型和野生型Dnm1蛋白的共组装可能会产生寡聚体或更高阶结构，这些结构无法被分解，并阻断野生型细胞中Dnm1p的功能。或者，突变的Dnm1蛋白可以通过滴定出其他生理上重要的结合伴侣，在野生型细胞中产生显性表型。目前正在进行研究，以确定Dnm1p同源寡聚物和/或是否与其他蛋白结合伙伴相互作用。
许多蛋白质的GTPase结构域包括带有保守苏氨酸残基的G2基序(Bourne等人，1991年). 在第21页ras（拉斯维加斯），苏氨酸与催化镁直接相互作用2+GTP的离子和γ-磷酸盐(Pai等人，1990年). 第21页ras（拉斯维加斯）影响该残基的突变阻止了GTP依赖性与p21的相互作用ras（拉斯维加斯）-GAP和raf激酶(Adari等人，1988年;Cales等人，1988年;Bourne等人，1991年;Vojtek等人，1993年). 尽管dynamins在G1基序下游含有保守的苏氨酸20残基，但该区域尚未被定义为G2基序。在这项研究中，我们发现Dnm1p中的T62A突变未能修复线粒体形态缺陷dnm1并诱导野生型细胞线粒体网络崩溃。这些结果表明，苏氨酸62在Dnm1p-GTPase结构域中构成真正的G2元件。为了与最初用于定义GTPase结构域的命名保持一致，我们将Dnm1p中的保守苏氨酸重命名为“G2”，并将更多的羧基末端元素G3和G4（见图。
A类).
早期的一项研究表明，在缺乏DNM1（DNM1）基因(Gammie等人，1995年). 虽然我们在Gammie等人（1995年）
dnm1Δ突变体，我们在我们的dnm1Δ应变。观察到这两种细胞的不同内吞表型dnm1Δ突变体可能反映了两个实验室使用的菌株背景或分析的差异。在形式上，Dnm1蛋白也可能在内胚体运输和线粒体形态维持中具有双重作用。或者Gammie等人（1995年）应变可能是线粒体形态缺陷的次要后果。在这项研究中，我们发现五个突变体的线粒体形态是野生型的，它们在内吞途径中以不同的步骤被阻断。这些数据表明，内吞作用的缺陷不会导致线粒体膜形状或分布的二次缺陷，并进一步支持了dnm1突变细胞是Dnm1蛋白功能丧失的直接结果。
目前尚不清楚Dnm1 GTPase是如何控制细胞内线粒体形态和分布的。线粒体双层膜上特定位置的含Dnm1p结构的组装可能负责启动或调节线粒体小管或分支的形成。我们的TEM分析dnm1线粒体表明，这些细胞器中仍存在一些管状和分支膜。因此，虽然Dnm1p可以在生成线粒体小管和分支中发挥作用，但它可能不是这一过程所需的唯一分子。另一种可能性是，含有Dnm1p的结构需要在细胞外周铺开并固定线粒体网络的部分。后一种模型与Dnm1p在细胞皮层的离散斑块定位、这些Dnm1p斑块与线粒体网络的共定位以及当Dnm1b缺失时外周线粒体网塌陷到细胞皮层的限制区域的观察结果一致。最后，与哺乳动物动力蛋白一样，Dnm1p GTPase也可能在调节线粒体网离散位置的膜断裂事件中发挥作用。这些模型并不是相互排斥的，这些事件的某些组合可以在体内同时受到Dnm1p的调节。无论Dnm1p功能的机制如何，我们的结果表明，该蛋白在控制线粒体膜的形状和分布方面起着核心作用。
最近发现了一个与Dnm1p密切相关的人类基因，并将其命名为各种DVLP（Dnm1p/Vps1p-like protein；Shin等人，1997年)Dymple（dynamin家族成员富含脯氨酸的羧基末端结构域较少；Kamimoto等人，1998年)DLP1（动力蛋白样蛋白1；Yoon等人，1998年)和DRP1（动力相关蛋白1；参见Smirnova等人1998年的相关文章；Imoto等人，1998年). 有趣的是，具有GTP-结合域改变的Drp1突变蛋白的瞬时表达会导致COS-7细胞中线粒体小管聚集，但不会影响其他细胞器的形态或蛋白质通过分泌和内吞途径的运输（参见Smirnova等人的相关文章，1998年）。虽然目前尚不清楚哺乳动物Drp1是否是S公司.酿酒Dnm1p，突变体Drp1在哺乳动物细胞中诱导线粒体表型的能力，提出了一种有趣的可能性，即Dnm1p-like GTPases在调节线粒体分布和形态方面发挥进化保守的作用。
Dnm1p加入了一个不断增长的动力学相关蛋白家族，该家族定位于哺乳动物的不同细胞器(Henley和McNiven，1996年; Jones等人，1998年；Yoon等人，1998年)，酵母(Rothman等人，1990年;琼斯和方曼，1992年;Guan等人，1993年)和植物（Gu和Verma，1996；Park等人，1998年). 未来的研究应揭示这些不同的GTPase在重塑细胞膜中的作用。
