衣原体激动素Ⅱ依赖性鞭毛内转运（IFT）：IFT颗粒含有纤毛组装所需的蛋白质秀丽隐杆线虫感觉神经元

Flagellar隔离

鞭毛分离自衣原体通过以下描述的pH冲击Witman等人（1972年）进行了如下小修改。使用Pellicon切向流过滤装置从8至32升液体培养基中收集细胞(Millipore公司和/或低速离心400克将细胞重新悬浮在新鲜的M中3分钟_我在～10⁷细胞/ml，并在23°C下在光下大力充气1–4小时。在33°C水浴中，在光照下进行限制性温度实验，并对细胞进行持续通风。细胞在400时沉淀克持续3分钟，然后在pH 7.2的10 mM Hepes中的5%蔗糖中重新悬浮。将细胞置于冰浴中后，立即用0.5 M的乙酸将pH值降至4.6，以脱落鞭毛。60秒后，使用相位显微镜确认变形，并在2分钟前用0.5 M KOH中和细胞。将EGTA添加到0.1 mM的最终浓度，并将以下蛋白酶抑制剂添加到1.0 mM PMSF、50μg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂、1μg/ml胃蛋白酶抑制素a、2μg/ml抑肽酶和1μg/ml亮肽的最终浓度。以下所有步骤均在4°C下进行。通过75毫升含25%蔗糖的缓冲垫在10 mM Hepes（pH 7.2）中离心，在250毫升锥形瓶中以600克5分钟。剩余的细胞体通过8-ml 25%蔗糖缓冲垫在pH 7.2的10 mM Hepes中离心，在50 ml锥形管中以600克用SS34转子（Sorvall Products，Newtown，CT）以10000 rpm的转速收集鞭毛10 min。将所得颗粒在2–5 ml 5%蔗糖和10 mM Hepes（pH 7.2）中用蛋白酶抑制剂彻底重新悬浮，然后通过2–4 ml 15%蔗糖和5 mM Hepe（pH 7.2，加上半强蛋白酶抑制剂，置于HB-4转子中的10-ml锥形管中，以8000 rpm的转速放置20分钟。此额外步骤通常产生由三层组成的分层颗粒。底层小而紧密，呈深绿色，主要含有细胞体。中间层为白色，主要由鞭毛组成。顶层呈浅绿色，絮状，易于去除，并含有鞭毛和未知的无定形物质。仅恢复了鞭毛的白色层，并将其重新悬浮在最小体积（0.1–1.0 ml）的HMDEK缓冲液（10 mM Hepes，pH 7.2，5 mM MgSO）中₄、1 mM DTT、0.5 M EDTA和25 mM KCl），包含上述蛋白酶抑制剂。用NP-40提取鞭毛或在液体N中快速冷冻₂最终再悬浮20分钟内。

FLA10激动素Ⅱ的分离

利用亲和纯化的抗FLA10T（一种针对FLA10基因产物的COOH末端部分（含有尾部结构域和大部分柄结构域的氨基酸416–688）产生的多克隆抗体）监测FLA10驱动蛋白II的纯化(Kozminski等人，1995年). NP-40的最低浓度(皮尔斯化学公司。伊利诺伊州罗克福德市）发现鞭毛释放FLA10驱动蛋白II所需的浓度为0.02%（数据未显示）。使用过量的NP-40（最终浓度1–2%）经常导致提取的FLA10驱动蛋白II的产率降低50%，可能是由于不可逆聚集。因此，为了确保FLA10驱动蛋白II的最大溶解性，通常在0.05%NP-40下进行提取。最初用0.05%NP-40和2 mM 5′-腺苷酸二磷酸（AMPPNP）提取鞭毛(西格玛化学公司。（密苏里州圣路易斯市）在HMDEK缓冲液中离心10分钟，然后在微型离心机中以12000 rpm离心10分钟。取下上清液“膜+基质”，保存以备日后分析。在HMDEK缓冲液中的0.5mM AMPPNP中洗涤轴突核颗粒，并再次以12000rpm离心10分钟。然后用10mM MgATP在冰上提取轴突核颗粒15分钟，然后以12000rpm离心10分钟。在Airfuge A-100/18转子中进一步澄清上清液（称为ATP洗脱液）10分钟(贝克曼仪器加利福尼亚州富勒顿），25 psi。然后使用1×90 cm S400通过凝胶过滤分离ATP洗脱液(法玛西亚生物技术公司瑞典乌普萨拉Sevrage）柱与HMDEK加蛋白酶抑制剂平衡。将FLA10驱动蛋白II峰馏分合并，使用Centricon-10（Amicon Corp.，Beverly，MA）浓缩至200μl，并在SWTi41转子中通过11 ml 5–20%蔗糖密度梯度进行沉淀进一步分离(贝克曼仪器)以41000 rpm的转速持续12小时。

IFT配合物A和B的制备

用0.05%NP-40和10 mM MgATP在HMDEK缓冲液或10 mM Hepes（pH 7.2）中提取新制备的鞭毛。或者，将HMDEK缓冲液中的新鲜鞭毛或pH 7.2的10 mM Hepes在液态N中快速冷冻₂并解冻以破坏鞭毛膜，如下所述Zhang和Snell（1995）冷冻/解冻制剂中的可溶性蛋白质被认为不包括膜蛋白和轴突蛋白，被称为“基质”。洗涤剂提取和冷冻/解救提取产生的复合物A和B的产量相似。在25 psi的Airfuge a-100/18转子中，用10分钟离心法去除轴索和其他不溶物。上清液、膜加基质（含NP-40）或基质（冷冻/解冻）在SWTi41转子中以38000 rpm通过11 ml 5–20%或10–25%的蔗糖密度梯度分馏12小时。梯度通常分为28份0.4毫升或18份0.6毫升等分样品，然后通过SDS-PAGE和Western blotting进行分析。

分子质量的测定

在不同缓冲液、离子强度和pH值的5–20%和10–25%蔗糖密度梯度上测定沉淀系数。离心前向样品中添加沉淀标准物，包括甲状腺球蛋白（19.4 S）、过氧化氢酶（11.3 S）、牛血清白蛋白（4.4 S）、卵清蛋白（3.66 S）和细胞色素c（2.1 S）。利用FPLC系统在S400（1.0×90 cm）开放柱（重力运行）或预填充S300柱（1.6×60 cm）上测定扩散系数(法玛西亚生物技术公司Sevrage）。所用标准为纤维蛋白原，1.98×10⁻⁷厘米²/s；甲状腺球蛋白，2.6×10⁻⁷厘米²/s；过氧化氢酶，4.1×10⁻⁷厘米²/s；乙醇脱氢酶，4.76×10⁻⁷厘米²/s；和BSA，6.3×10⁻⁷厘米²/第条。分别用蓝色右旋糖酐和线性质粒测定S400和S300的空隙体积。床容量用ATP测定。用Svedberg方程测定FLA10驱动蛋白II和IFT复合物A和B的表观分子质量，

(坎托和希梅尔，1980年)，其中R（右）是气体常数，T型是以开尔文为单位的温度，V（V） ₂是蛋白质的部分比体积，ρ是溶液密度秒和D类分别是实验得出的沉降系数和扩散系数。假设局部比体积为0.72 cm^三/g、 溶液密度假定为1.00 g/cm^三.

电泳

根据奥法雷尔（1975）使用3–10和4–6安瓿的1:4混合物（Serva，Westbury，NY）。将凝胶聚焦8000 V h，然后在800 V下聚焦1 h。在5–20%丙烯酰胺梯度凝胶上进行二维SDS-PAGE(莱姆利，1970年).

抗体

外臂动力蛋白中间链mAb，1869A(King等人，1985年)，购买自西格玛化学公司。泛驱动蛋白肽抗体、LAGSE和HIPYR(科尔等人，1992年;Sawin等人，1992年)从BABCO，Inc.（加州伯克利）购买。针对FLA10尾部结构域的抗体（抗FLA10T，Kozminski等人，1995年)和RSP3(Williams等人，1989年)亲和力被纯化(奥姆斯特德，1981年).

针对FLA10颈部结构域提出多克隆抗FLA10N抗血清，如下所示。将编码FLA10的假定颈部结构域和部分茎结构域的390-bp SalI片段Ser-342至Arg-472克隆到PGEX-5X2表达载体的SalI位点(法玛西亚生物技术公司Sevrage）产生FLA10N-GST融合蛋白。用3 mM异丙硫代-β诱导XL1-Blue细胞表达的融合蛋白-d日-半乳糖苷（IPTG），使用谷胱甘肽-琼脂糖树脂纯化(弗兰吉奥尼和内尔，1993年). 两只兔子皮下注射500μg FLA10N-GST融合蛋白，并在21天后和此后每28天注射250μg。在第三次和第四次增强后10天从血清中亲和纯化抗体。耶鲁生物技术服务公司（康涅狄格州纽黑文）对兔子进行了所有治疗和护理。

使用FLA10-His6融合蛋白亲和纯化抗FLA10N-GST抗血清，该融合蛋白包含大部分运动结构域和用于抗原的所有130氨基酸颈部/柄片段，称为FLA10M/N-His6。将编码Met-97到Arg-472的1122个FLA10碱基克隆到PQE-30表达载体（Qiagen，Chatsworth，CA）中。如上所述表达FLA10M/N-His6融合蛋白，并根据制造商的说明在Ni-NTA树脂（Qiagen）上纯化。纯化的FLA10M/N-His6与碳酸氢盐偶联缓冲液进行通宵透析，并与溴化氰活化的Sepharose 4B微球偶联(法玛西亚生物技术公司Sevrage），由制造商推荐。将抗FLA10N-GST抗血清（20 ml）与4 ml树脂在25°C下孵育2 h，用TBS洗涤两次，然后在25°C下将1.0 M NaCl放入TBS中。用0.1 M甘氨酸（pH 2.8）洗脱亲和纯化的抗FLA10N抗体，在0.1 M Tris（pH 8.5）中中和，然后针对1×TBS透析过夜。

针对所选IFT颗粒多肽的单克隆抗体如下所示。蔗糖密度梯度-纯化IFT复合物A和B（15–16S组分）于第0、21和35天皮下注射到balbc小鼠（每只小鼠总蛋白50μg）。第49天，给其中一只小鼠静脉注射40μg总蛋白。第52天，将小鼠处死，将脾脏细胞与sp2/0骨髓瘤细胞系融合，并将其置于10个96周的微量滴定板上。7至14天后，使用Miniblotter28（免疫学，马萨诸塞州坎布里奇）对约300个杂交瘤上清液进行蔗糖密度梯度-纯化IFT复合物A和B的帘幕印迹试验。七个阳性克隆产生了以他们识别的IFT颗粒多肽命名的抗体：172.1、139.1、81.1、81.2、81.3、81.4和57.1。按照顺序，用西格玛免疫分型试剂盒为IgG1、IgG2a、IgG1-无法测定、IgG1、IgGl和IgG2a-。使用组织培养上清液对这些抗体进行免疫荧光，而使用腹水纯化的抗体进行免疫沉淀（耶鲁免疫服务公司；缅因州波特兰市缅因生物技术服务公司提出172.1份腹水）。

间接免疫荧光显微镜

免疫荧光试验采用了两种不同的方案，两种方案都产生了相似的结果。第一个协议基于Huang等人的程序.（1988），其中3%的多聚甲醛用于固定细胞壁-较少的突变体(加拿大西部92)在连接到盖玻片和标签之前处于悬浮状态。第92周对数相液体培养的细胞在84℃下通过温和离心获得克将细胞重新悬浮在0.1 M KHPO中的3%多聚甲醛中6分钟（电子显微镜科学，宾夕法尼亚州华盛顿堡）₄pH 7.4，然后在室温下固定30分钟。固定细胞在PBS中清洗三次，方法是在4000 rpm的微型离心机中沉淀1.5 ml等分细胞2 min。将清洗后的细胞重新悬浮在0.5 ml H中₂O，并通过在一侧彻底涂覆细胞悬浮液并立即清除多余液体，吸附在1号玻璃盖玻片上。让细胞在盖玻片上风干，然后将盖玻片放入科普林罐中进行以下提取。细胞在PBS中的0.5%NP-40中渗透2分钟，然后用H冲洗数次₂用三次冰镇丙酮变化提取叶绿素，每次5min。在蒸馏H中短暂冲洗后₂O、 多余的液体被清除了，盖玻片被放在一个湿度室里，面朝上。150–250μl一级抗体在封闭缓冲液A（10 mM K）中稀释₂高性能操作₄，pH 7.2，5%正常山羊血清[Jackson Immunoresearch，West Grove，PA]，5%甘油和1%冷水鱼胶[西格玛化学公司。])在每个盖玻片上在37°C下孵育2 h。盖玻片用PBS在Coplin罐中清洗三次，每次5 min，然后返回湿度室。将封闭缓冲液A中150–250μl等分的二次抗体在盖玻片上在37°C下孵育1小时。二次抗体孵育后，用上述PBS清洗盖玻片三次，用蒸馏h短暂冲洗₂O、 然后装在含有2%的介质中的载玻片上N个-没食子酸丙酯(西格玛化学公司。)、30%0.1 M Tris、pH 9和70%甘油。

用于野生型染色的替代方案(cc125型),建筑物2、和fla10（火焰10）突变体，改编自桑德斯和索尔兹伯里（1995）此程序允许同时固定和提取具有细胞壁的细胞。盖玻片涂有1%聚乙烯-我-赖氨酸(西格玛化学公司。)5分钟，用蒸馏H冲洗₂O、 然后风干30–60分钟。将细胞放在盖玻片上5–10分钟，在新鲜M中短暂冲洗_我培养基，在−20°C甲醇中的Coplin罐中提取10分钟，然后风干10–15分钟。在室温下的湿度室中执行以下步骤。用PBS将干细胞复水10 min，然后用含有5%BSA和1%冷水鱼明胶的5×封闭缓冲液B处理30 min。用10%的正常山羊血清在PBS的5×封锁缓冲液B中再培养30 min。细胞与一抗在1×封闭缓冲物B中培养6–12 h，然后在1×封闭缓冲液B中与二级抗体孵育60分钟之前，用6次1×封闭缓冲器B进行清洗。盖玻片用1×封闭缓冲剂B清洗6次，然后用ProLong防褪色试剂（Molecular Probes、Eugene、OR）安装在玻片上。

染色细胞在尼康Diaphot 300倒置显微镜上观察。使用Image Point CCD相机（Photometrics，Tucson，AZ）和Metamorp成像系统软件收集图像(环球成像公司。（宾夕法尼亚州西切斯特），运行Windows 95（微软，华盛顿州雷蒙德）。使用Photoshop（Adobe Microsystems，Mountain View，CA）为最终发布准备图像。

IFT颗粒成分的鉴定

因为IFT颗粒似乎没有与FLA10驱动蛋白II结合，所以我们利用了IFT颗粒从ts突变体的鞭毛中耗尽的观察结果fla10（火焰10）识别颗粒的成分。什么时候？pf1 fla10双突变体（pf1 fla10使用双突变体是因为它有麻痹的鞭毛，这极大地促进了使用DIC显微镜观察IFT）在限制性温度下孵育1.5小时，IFT消失，并且通过电子显微镜可以看到很少的筏(Kozminski等人，1995年). 因此，我们寻找了从鞭毛中消失的蛋白质fla10（火焰10）33°C下的细胞与IFT颗粒的损失一致。

野生型和fla10（火焰10）细胞在23°C或33°C培养，并通过SDS-PAGE分析其鞭毛。鞭毛中一组显著的多肽减少fla10（火焰10）在限制温度33°C下培养后的细胞。虽然在完整鞭毛的SDS-PAGE凝胶上可以观察到这些变化（数据未显示），但在这些鞭毛的膜和基质提取物中更明显（图。​（图3三 A类). 一组特定的鞭毛多肽的损失伴随着鞭毛筏的减少，这表明这些多肽是IFT颗粒的成分。

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图3

野生型和野生型鞭毛提取物的多肽分析弗拉突变细胞。从23°C或限制温度33°C培养的细胞中分离出鞭毛。在0.05%NP-40和10 mM ATP存在下分离膜+基质，以优化FLA10驱动蛋白II的提取。(A类)考马斯染色7.5%凝胶膜加基质。箭头，在培养fla10（火焰10）和火焰833°C下的突变体最右边是一个乐队，M（M） _第页140 kD，减少fla3（火焰3）加热后，表明只有一部分多肽在火焰8和fla10（火焰10）似乎在鞭毛中减少亚麻3在33°C下培养。星号表示在～100 kD处增加的频带火焰8在33°C下孵育后。分子量标准物、动力蛋白和微管蛋白如右图所示。(B类)用抗FLA10T探针检测相应的免疫印迹。FLA10蛋白在fla10（火焰10）和火焰833°C孵育后的突变体。

其他ts弗拉突变体，比如fla10（火焰10）在33°C下重新吸收鞭毛，同样分析鞭毛蛋白在限制温度下的变化。鞭毛中减少的假定IFT颗粒多肽fla10（火焰10）在33°C下，另外两个ts的鞭毛中的细胞也显著减少弗拉突变体，火焰1和火焰8，在33°C下培养后（图。​（图3三 A类; 表​表II）。二). 相反，相同的一组多肽在ts的鞭毛中并没有同样的耗竭弗拉突变体fla2、3,4,9、和13（图。​（图3三 A类; 表​表II）二)在33°C下孵育后。的确，在fla3（火焰3）只有IFT颗粒多肽的一个子集在33°C时被还原（图。​（图3三 A类)和中fla2型所有IFT颗粒多肽的水平在33°C时增加（表​（表二）。二).

鞭毛膜和基质组分如图所示。​图3三 A类用抗FLA10T检测FLA10蛋白的存在（图。​（图3三 B类). 正如预期的那样，在33°C下培养不会影响野生型细胞中的FLA10水平；然而，在火焰1（未显示），火焰8、和fla10（火焰10）培养后FLA10水平下降。即使在允许的温度下，与野生型细胞相比，这三个ts突变体中的FLA10数量也减少了，这与之前的结果一致，即在fla10（火焰10）鞭毛在允许或限制温度下(Walther等人，1994年;Kozminski等人，1995年). 中FLA10行为的相似性fla10（火焰10）,火焰1、和火焰8，表明法兰1和火焰8可能是异三聚体FLA10驱动蛋白II复合物的100-kD和85-kD亚单位。在剩余的弗拉经测试的突变体，FLA10的量在限制温度下培养后保持相对恒定或增加（表​（表二）。二). 因此，假定IFT颗粒多肽的丢失与鞭毛中FLA10的丢失相关火焰1,火焰8、和fla10（火焰10）在限制温度下培养后。这种相关性进一步证明了上述一组多肽是IFT颗粒的成分。

从野生型细胞或弗拉通过蔗糖密度梯度离心分析突变体，以更好地表征IFT颗粒多肽。如野生型提取物的梯度所示（图。​（图4），4)，通过孵育而减少的一组多肽fla10（火焰10）33°C时（图。​（图3三 A类)在～16 S共沉淀。这些假定的IFT颗粒多肽的损失在从fla10（火焰10）（未显示数据）和火焰1（图。​（图5）5)在23°和33°C下培养后的突变体。请注意，与fla10（火焰10）（图。​（图3三 A类)IFT颗粒多肽的浓度法兰1鞭毛提取物在23°C下分离（图。​（图55 A类)与野生型提取物相比含量较低。

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图4

膜+基质的蔗糖密度梯度分布。野生型细胞鞭毛的膜+基质部分在pH 7.2的10 mM Hepes中以11-ml 5–20%蔗糖梯度进行分离。梯度剖面的考马斯染色凝胶显示，假定的IFT颗粒多肽在16S处共沉积（由两组箭头它们的明显活动性列在左边）。

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图5

鞭毛提取物中16S多肽的损失火焰1限制温度下的突变细胞。膜+基质火焰1在23°C和33°C的允许和限制温度下培养的突变细胞在HMDEK缓冲液中以11 ml 5–20%蔗糖梯度进行分馏。只有20%的梯度部分(左边)至10%(正确的)在考马斯染色7.5%凝胶上显示。在23°C时，与野生型相比，在15–16 S时IFT颗粒多肽减少(箭头). 这些多肽在33°C孵育后进一步耗尽(箭头). 从火焰8和fla10（火焰10）细胞在23°和33°C下培养。请注意，在上部凝胶中，由16S箭头突出显示的部分中140和122 kD处的多肽峰值，而其他突出显示的条带的沉积速度稍慢。

用野生型15–16 S组分的二维凝胶分析进一步表征IFT颗粒多肽（图。​（图6），6),火焰1、和fla10（火焰10）从23°C和33°C的细胞中分离出的鞭毛提取物。对这些提取物的一维和二维凝胶进行比较分析，鉴定出以下15种IFT颗粒多肽：p172、p144、p140、p139、p122、p88、p81、p80、p74、p72、p57/55、p52、p46、p27和p20。通常，除了74-/72-kD双链体外，所有双链体都可以在二维凝胶上识别，如图所示。​图6。6在一维凝胶上看到的140-kD双光子的下带（图。​（图44和​和5）5)在二维凝胶上进一步分解为p140和p139的双分子（图。​（图6）。6). 在一维和二维凝胶的免疫印迹上，p57和p55都与相同的单克隆抗体57.1反应，表明它们是同一基因的产物（数据未显示）。p80可以在一维凝胶上从p81中分离出来（图。​（图4）4)但在二维凝胶上经常不能从p81中分辨出来，如图所示。​图6。6考马斯染色的一维凝胶的密度扫描表明，IFT颗粒的多肽组分以～1的摩尔比存在（数据未显示），但p88和p46除外，它们经常以亚化学计量水平存在（例如，图。​图4，4,第88页; 图。​图6，6,第46页).

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图6

IFT颗粒多肽的二维凝胶。通过双向凝胶电泳分离野生型鞭毛提取物蔗糖密度梯度中的15–16 S组分，并用考马斯蓝染色。可识别的带是根据第二维的表观分子迁移率来标记的。星号可以表示p74。p57/55被分解为两个紧密迁移的带。p172和p122经常作为条纹运行。显示了二维凝胶标准的pIs。

IFT颗粒多肽的流体力学分析

15 IFT颗粒多肽最初在～16 S出现共沉淀（图。​（图4）。4). 然而，通过改变离子强度，这些多肽可以分离成两种复合物：复合物A，由p144、p140、p139和p122组成，在16.1–16.4S的低离子强度和中等离子强度溶液中沉淀；和复合物B，由剩余的11种多肽组成，在低离子强度（10 mM Hepes，pH 7.2）下，其在16 S沉淀，但随着离子强度的增加，沉淀速度较慢。表中列出了配合物A和B的组成和流体动力学行为三.图。​图77 A类显示了从法兰2(fla2型因为鞭毛来自fla2型细胞包含的复合物A和复合物B是野生型细胞鞭毛的两到三倍）。复合B多肽沉淀中的盐依赖性转移在图的相应免疫印迹中特别明显。​图77 A类用针对p172、p139、p81和p57/55的单克隆抗体进行检测（图。​（图77 B类). p172与其他复合物B的分离，在免疫印迹上最为明显（图。​（图77 B类)，解释了络合物B的S值和扩散系数（见下文）的变化。

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图7

15种IFT颗粒多肽的拆分。膜+基质法兰2在23°C培养的细胞在HMDEK缓冲液+50 mM NaCl中以11-ml 10–25%蔗糖密度梯度进行分馏。仅部分梯度来自馏分7（21%蔗糖，左侧)至馏分18（15%蔗糖，右侧)显示在5–20%SDS-PAGE上。(A类)银色凝胶。IFT颗粒多肽的一个子集p144、p140、p139和p122（复合物A）在分数11处达到峰值。～140 kD的宽带是144、140和139 kD未解析带的三重。p172多肽在级分14处达到峰值。其余10种IFT颗粒多肽，p88、p81、p80、p74、p72、p57/55、p52、p46、p27和p20（复合物B减去p172），在组分12和13之间达到峰值。～80和74 kD的谱带分别是81和80 kD以及74和72 kD的两组未解析双链（这两组双链在7.5%SDS-PAGE上常规解析，如图所示。​图4）。4). 注意，在这种离子强度下，p172的沉降速度明显慢于其余的络合物B(B类)用针对IFT颗粒多肽的单克隆抗体172.1、139.1、81.1、57.1进行相应的免疫印迹检测。

当通过凝胶过滤分离时，IFT颗粒多肽也表现为两种复合物：复合物A的扩散系数相对恒定，为2.5×10⁻⁷厘米²/s超过一系列离子强度（75–375 mM）。由于络合物B的不稳定性，特别是在需要将蛋白质与凝胶过滤支撑树脂之间的相互作用最小化的中等离子强度（100 mM）下，通过凝胶过滤很难获得准确的扩散系数。鉴于此警告，扩散系数约为1.8×10⁻⁷厘米²/对于离子强度为75 mM的配合物B，获得了s（表三). 根据这些流体力学数据，计算出配合物A和配合物B的分子质量分别为550 kD和710–760 kD。假设每个亚单位的化学计量比为1.0，则络合物a和B的复合分子质量分别估计为545和769 kD（表三)，与根据水动力数据进行的计算一致。这些结果表明，配合物A和B分别含有表中列出的每一个亚基三然而，我们不能排除一个或多个亚基可能以较高或较低的化学计量比存在。

配合物A和B的免疫沉淀

用抗FLA10N抗体和复合物A和复合物B单克隆抗体对整个细胞和整个鞭毛的一维免疫印迹进行检测，以证明抗体的特异性（图。​（图88 A类)并测量FLA10驱动蛋白II和IFT颗粒多肽在鞭毛和细胞体中的相对分布（数据未显示）。尽管大多数（90%）的FLA10总抗原是在细胞体内发现的，但鞭毛中FLA10抗原与总蛋白的比率是整个细胞的10倍。FLA10驱动蛋白II在鞭毛中的富集与报道的海胆囊胚相比，后者的驱动蛋白Ⅱ在纤毛中的浓度比细胞体低10-20倍(莫里斯和斯科利，1997年). 还观察到IFT颗粒多肽p172、p139、p81和p57/55相对于细胞体水平的类似鞭毛富集（数据未显示）。

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图8

抗FLA10N抗体和抗IFT颗粒多肽抗体的特异性以及复合物A的免疫沉淀(A类)整个野生型细胞和鞭毛分别在SDS-PAGE样品缓冲液中煮沸，澄清，然后在7.5%凝胶上分馏。用标记抗体检测相应的免疫印迹。(B类)配合物A与139.1的免疫沉淀。在蔗糖密度梯度上分离野生型鞭毛的膜+基质，并合并含有16个S蛋白的组分。在考马斯蓝染色的7.5%凝胶上分析来自该池的139.1抗体的免疫沉淀。车道1，16S池；车道2，与蛋白A–琼脂糖树脂孵育后的16S池；车道三16 S池免疫缺失139.1；车道4HMDEK缓冲液中16S池139.1免疫沉淀；车道5，经0.5 M NaCl洗涤后，16 S池中139.1个免疫沉淀物。

为了鉴定与复合物A和B弱结合的其他蛋白质，通过免疫沉淀法从野生型膜+基质以及膜+基质蔗糖梯度的16S部分快速纯化复合物。抗体139.1主要从膜+基质（数据未显示）和16S组分（图。​（图88 B类). 抗体172.1免疫沉淀了前面描述的172-kD多肽，在100 mM的离子强度下，剩余的复合物B多肽数量显著（尽管是亚化学计量的）。用0.2 M NaCl在10 mM Hepes（pH 7.2）中洗涤树脂，可以明显看出p172和剩余复合物B之间的相互作用不稳定，它释放了除p172外的几乎所有结合复合物B多肽（数据未显示）。因此，含172.1的复合物B的盐敏免疫沉淀与蔗糖梯度上的解离相一致。我们还通过抗FLA10N的Western blotting发现，在膜+基质的139.1免疫沉淀物中存在少量但可检测到的FLA10（数据未显示）。因此，尽管FLA10驱动蛋白II与配合物A和B在蔗糖梯度上有明显的分离，但FLA10和配合物A的共免疫沉淀增加了复合物A中一个或多个多肽与FLA10驱动蛋白II直接结合的可能性，尽管这种结合较弱。如果可以发生这种结合，则在使用的条件下，这种结合似乎很弱，并且使用长时间分离技术可能无法检测到这种弱结合，例如蔗糖密度梯度离心和凝胶过滤程序，这些程序用于纯化FLA10驱动蛋白II和复合物A和B。

FLA10激动素Ⅱ和IFT复合物A和B的免疫定位

使用免疫荧光和免疫金电子显微镜定位FLA10和复合A和B多肽（见图。​图99–11). 免疫荧光显微镜显示，在细胞体中，FLA10（图。​（图9，9,d–f日)，第172页（图。​（图9，9,a–c)，第81页（图。​（图99 克)，和p139（图。​（图99 小时)在基底体周围区域高度富集（图。​（图9，9,插入). 尽管这些抗原是从分离的鞭毛中纯化出来的。基底体区染色呈双倍或有时三倍半圆形，凹面面向细胞核。与基底体最靠近细胞核的点不同，FLA10和IFT颗粒多肽染色距离最远，最靠近细胞核。这些抗体还观察到鞭毛的弱点状染色。鞭毛的点状染色可能代表DIC和电子显微镜所见的筏状结构，但尚不确定。

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图9

FLA10、p172、p139和p81的免疫荧光定位第92周细胞（细胞壁缺乏，但其他类型为野生型）。(a–c) 172.1. (d–f日)抗-FLA10N。(克)p81:81.1、81.2、81.3和81.4的单克隆抗体池。(小时) 139.1. 注意鞭毛底部的双或三层染色a–h,插入. (我)多克隆抗α-微管蛋白。棒材，5μm(插入，10μm）。

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图11

野生型细胞中p172和FLA10的免疫金电子显微照片。所有的显微照片都显示了基底身体区域。(a–c)172.1染色仅限于基底体和周围区域，在鞭毛膜和外双重MT之间偶尔可见金颗粒(d日和e（电子）)抗-FLA10N染色与172.1染色相似。(e（电子）)小根MT的偶尔标记(百万吨)在基底体附近(BB公司).

虽然FLA10驱动蛋白II和复合物A和B似乎高度集中在基底体附近，但它们与这些细胞器的精确关系很难解决。为了进一步阐明这种关系，这些蛋白质在缺乏基底体的突变细胞系中的分布，建筑物2(Goodenough and St.Clair，1975年;Ehler等人，1995年)已检查。在建筑物2与野生型细胞一样，根据染色相对于细胞核和蛋白核体的位置判断，p172集中在细胞的前部（图。​（图10，10,一和c（c）). 然而，野生型细胞中常见的双或三层结构没有得到解决，与野生型细胞相比，染色的形状更为多变，也更具弥散性。与p172相反，FLA10分散在建筑物2细胞，没有显示细胞前部的定位（图。​（图10，10,b条和d日)如野生型（图。​（图9）9)和fla10（火焰10）细胞。因此，FLA10驱动蛋白II要么不是针对鞭毛的，要么不能积聚在鞭毛的底部，除非基底体本身存在；而p172不需要基底体在该区域靶向或聚集。通过以下方法获得了类似的结果fla10（火焰10）细胞在33°C下孵育24小时。在此孵育过程中fla10（火焰10）细胞从10%减少(t吨=0小时）至3%(t吨=24 h），导致基底体周围的抗FLA10N染色较弱。随着FLA10蛋白的减少，p172水平从100%下降(t吨=0小时）至50%(t吨=24 h）的野生型水平和172.1染色继续显示维持在23°C的细胞的三部分基底体区域定位特征（数据未显示）。在缺乏基底体的两个细胞中(建筑物2)以及FLA10驱动蛋白II失活的细胞(fla10（火焰10）在33°C）时，p172和可能的复合物B仍在与野生型细胞相同的细胞区域积聚。

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图10

p172和FLA10的免疫荧光染色建筑面积2细胞。(一和c（c）)172.1染色。(b条和d日)抗-FLA10N染色。抗FLA10N的背景叶绿体标记故意变亮，以指示细胞的方向，并证明FLA10驱动蛋白II没有集中在细胞的基底体区域（突出显示为箭头).

使用172.1和抗FLA10N进行免疫金电子显微镜检查，以提高p172和FLA10相对于基底体分布的分辨率（图。​（图11）。11). 正如薄片免疫金标记常见的那样，标记并不强烈，但具有特异性和可重复性。与免疫荧光相一致，172.1标记中的大多数位于基体附近，没有叶绿体或细胞核的标记（数据未显示）。有时，标签分散在距基底体一微米的地方，但更典型的是，在基底体上或100纳米范围内可以看到一到三个金颗粒（图。​（图11，11,a–c). 鞭毛膜和轴丝之间的鞭毛也很少有标记（图。​（图1111 c（c）). 同样，抗FLA10N标记集中在基底体周围（图。​（图11，11,d日和e（电子）)在罕见的偶然切片中，基底体附近可见小根微管标记（图。​（图1111 e（电子）).

IFT颗粒由两个大蛋白复合物组成

为了鉴定IFT颗粒的成分，我们寻找了在ts鞭毛中减少的膜加基质蛋白fla10（火焰10）在限制温度33°C下培养后的突变体（图。​（图3），三)IFT和由IFT颗粒组成的鞭毛筏的数量都显著减少(Kozminski等人，1995年). 两种蛋白质复合物，称为复合物A（550 kD）和复合物B（710-760 kD），从fla10（火焰10）鞭毛在限制性温度下。在低离子强度下，两种络合物都在～16 S沉淀（图。​（图4）；4); 在较高的离子强度下，配合物A在16S继续沉积，而配合物B分解成两个或多个S值较低的物种（图。​（图7）。7). 由于它们的大尺寸、存在于膜和基质部分、相对丰度以及鞭毛中的FLA10依赖性，这些复合物是IFT颗粒组分的理想候选成分。

复合物A和B构成IFT颗粒的其他证据来自对附带报告中描述的逆行IFT突变的分析(Pazour等人，1998年). 这个突变体，火焰14是动力蛋白轻链LC8的零突变，是鞭毛外臂动力蛋白的一种成分(金和帕特尔·金，1995年)也与细胞质动力蛋白有关(King等人，1996年)和肌球蛋白V（Espindola，F.S.，R.E.Cheney，S.M.King，D.M.Suter和M.S.Mooseker，1996）。分子生物学。单元格. 7:372一).烧瓶14细胞有短而不活动的鞭毛，通常在鞭毛的侧面或顶端出现隆起(Pazour等人，1998年). 对这些鞭毛的DIC显微镜观察表明，顺行IFT继续，逆行IFT停止。超微结构分析显示，由于顺行IFT继续将IFT颗粒运输到鞭毛，但没有逆行IFT，IFT颗粒（复合物A和B）和顺行运动蛋白（FLA10驱动蛋白II）都聚集在突变体的轴丝和鞭毛膜之间的空间中，因此有大量IFT筏堆积缺少离开鞭毛的机制。FLA10驱动蛋白II和IFT颗粒多肽水平在火焰14鞭毛超过野生型鞭毛(Pazour等人，1998年)提供了令人信服的证据，证明复合物A和B是构成筏的IFT颗粒的主要成分。

IFT络合物A和B的组成

IFT复合物A是一种550-kD四聚体，包含144、140、139和122 kD的亚单位，而IFT复合体B是一种750-kD复合物，包含20至172 kD的11个亚单位（表三). 最近，一组包括HSP70在内的13种多肽被鉴定为单一的17S复合物，其存在于衣原体鞭毛需要FLA10活性(Piperno和Mead，1997年). 尽管这13种多肽的表观分子量存在差异，但它们很可能是本文所述多肽的子集。然而，尽管我们检测到鞭毛HSP70在16S处沉积（数据未显示），但HSP70的16S部分水平增加，而IFT颗粒多肽从鞭毛中消失fla10（火焰10）细胞在33°C下培养，表明HSP70不是复合物a或复合物B的亚单位。

在较高的S值（>18 S；参见图的前四部分）下，也观察到少量络合物A和少量络合物B的沉积。​图4），4)这表明存在较大的复合物，可能与鞭毛前体结合。事实上，当从轴突中提取时，内臂动力蛋白的一部分沉积在11S，当从膜+基质中分离时，发现其沉积在18S，就像与IFT颗粒结合一样(Piperno和Mead，1997年). 我们还观察到，在用抗体探测的膜加基质（数据未显示）的蔗糖密度梯度的免疫印迹上，不同量的以下鞭毛抗原以出乎意料的重组分（15-20S）沉淀：(一)内臂动力蛋白中间链IC140（Yang，P.，and W.S.Sale.1996）。分子生物学。单元格。7:568一); (b条)外臂动力蛋白中间链IC78(King等人，1991年)和IC69(King等人，1985年); (c（c）)放射辐条蛋白3(Williams等人，1989年)和6（Diener，D.R.，D.G.Cole和J.L.Rosenbaum，手稿正在编写中）；(d日)actin（柯克·D·个人沟通）；和(e（电子）)HSP70（Savino，E.和J.L.Rosenbaum，未发表的观察结果）。然而，这些蛋白质并没有与复合物A和B同时消失fla10（火焰10）细胞在33°C下培养。从膜加基质共沉淀的复合物A或复合物B的免疫沉淀也不能检测到I1内臂动力蛋白或放射辐条复合物，这表明这些轴突蛋白与我们的制剂中的IFT复合物没有直接关联。尽管复合物A和B在>18S时的存在仍然无法解释，但较高的沉降与复合物A的弱自缔合以及复合物A和B之间的弱缔合一致。

FLA10激动素Ⅱ和p172在基底体的定殖

免疫荧光显微镜显示，复合物A多肽p139和复合物B多肽p172和p81最集中于基底体周围区域的半圆形双链或三链弧。这些抗体染色模式的相似性表明，复合物A和B在一个独特的亚细胞结构域中彼此非常接近（如果没有关联的话）。IFT复合体与基底体本身或来自基底体的微管根之间的确切关系尚不清楚。

正如对结合其货物的马达所预期的那样，FLA10和IFT颗粒多肽的定位基本一致（图。​（图9）。9). FLA10与间期细胞中的基底体相关，在有丝分裂期间随着这些细胞器成为中心粒而迁移(Vashishtha等人，1996年). FLA10未能集中在基底体前部，进一步表明FLA10与基底体之间存在直接的相互作用建筑物2缺乏基底体的细胞(Goodenough and St.Clair，1975年;Ehler等人，1995年). 然而，与FLA10不同，IFT多肽p172在建筑物2细胞，尽管其分布比野生型细胞更为分散。因此，p172和可能的复合物B靶向基底身体区域似乎与FLA10驱动蛋白II无关。同样，在限制性温度下24小时后，p172在fla10（火焰10）即使存在少量FLA10，细胞也可能处于非活性状态。因此，将IFT颗粒运输到鞭毛中需要FLA10活性，但不需要运输到基底身体区域。由于细胞质MT的负端非常靠近基底体，因此负端导向的MT马达（如细胞质动力蛋白）可能在其进入鞭毛之前将IFT复合物或其组成多肽传递到基底体区域。

FLA10激酶II介导的IFT模型

FLA10驱动蛋白II介导的IFT的工作模型如图所示。​图13。13.FLA10驱动蛋白II、复合物A和复合物B积聚在基底体周围的区域，可能是局部合成或转运到该区域的结果。每个复合物的多个拷贝结合，可能与其他未确定的分子一起形成IFT粒子。基底体可能是FLA10驱动蛋白II的停靠点，而驱动蛋白Ⅱ又与IFT颗粒结合。在这个位置，其他需要运输到鞭毛尖端的分子可能会结合。这些货物可能包括鞭毛前体（例如，放射状辐条复合体和内动力蛋白臂）、完整的膜蛋白(Bloodgood，1992年)，逆行IFT马达(Pazour等人，1998年)和ATP。IFT颗粒的大尺寸和复杂性可能是隔离鞭毛前体所必需的，因此它们在运输过程中不会相互关联或结合轴突MT。IFT复合体结合形成线性阵列或筏，可能发生在基体上或沿轴丝的过渡区。然后，筏被FLA10驱动蛋白II沿着外加倍体的B小管运输到鞭毛(Kozminski等人，1995年). 一旦前驱体被输送到尖端，筏就会被逆行的IFT马达（被认为是细胞质动力蛋白）运输，而筏似乎会分解成较小的低聚物(Pazour等人，1998年)回到鞭毛的底部。

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图13

IFT模型衣原体鞭毛。Fla10驱动蛋白II和IFT复合物A和B高度集中在细胞的基底体区域周围。复合物A和B的多个拷贝结合形成IFT颗粒。FLA10驱动蛋白II与基底体结合，然后IFT颗粒与FLA10驱动蛋白II结合。IFT颗粒也可能在与基底体对接之前与驱动蛋白结合。在IFT颗粒齐聚形成筏后，FLA10驱动蛋白II将IFT颗粒输送到鞭毛尖端。在顶端，筏分离成更小的IFT颗粒低聚物，并通过细胞质动力蛋白回到鞭毛的底部。

如果IFT在鞭毛组装期间将前体传递到尖端，为什么即使在全长鞭毛中也会持续运行？一些证据表明，蛋白质周转发生在全长鞭毛中。代谢标记的蛋白质迅速融入海胆和扇贝的全长纤毛，即使这些纤毛已经停止伸长(斯蒂芬斯1994,1996). 在衣原体双核体营救实验也表明，前体不断进入鞭毛。在交配过程中细胞融合的几分钟内，一个细胞的细胞质成分可以进入另一个细胞不动的鞭毛并恢复运动能力(勒温，1954年;斯塔林和兰德尔，1971年;Luck等人，1977年;约翰逊和罗森鲍姆，1992年)可能是由一个连续运行的机械装置运输的。最后，在由两个具有全长鞭毛的野生型细胞形成的双核体中，其中一个细胞表达表位标记的微管蛋白，表位标记的微管蛋白从末端开始结合到全长鞭毛中，并以与体外微管踩踏一致的速率向基部移动（Marshall，W.和J.L。Rosenbaum，未发表的意见）。有可能，像许多曾经被认为是稳定的其他微管结构一样，轴突不断翻转，需要IFT将轴突前体持续传递到鞭毛尖端。

IFT也可用于在鞭毛膜内运输蛋白质和/或脂质。支持这一假设的证据来自电子显微照片，显示IFT颗粒和鞭毛膜的周期性联系(Kozminski等人，1993年,1995;Pazour等人，1998年)研究表明fla10（火焰10）配子在被转换到32°C的限制温度后30–60分钟失去交配能力(Piperno等人，1996年). 配合衣原体取决于鞭毛粘附(伯格曼等人，1975年;斯内尔，1976年)鞭毛外膜糖蛋白（凝集素）向鞭毛尖端的运动(梅斯兰，1976年;Forest等人，1978年;Goodenough和Jurivich，1978年). FLA10的热失活和伴随的IFT丢失可能是fla10（火焰10）在33°C下保存的突变体破坏了成功交配所需的一个或多个鞭毛膜依赖过程。

秀丽线虫p172、p52和FLA10同源基因参与纤毛发生

13种IFT颗粒多肽的内部肽序列显示，其中至少6种在高等生物中具有同源物。p172和p52的肽序列与线虫蛋白OSM-1（Stone，S.和J.Shaw，个人通讯）和OSM-6的序列非常相似(Collet等人，1998年)，分别（图。​（图12）。12).渗透压-1和渗透压-6表型与渗透压-3(Shakir等人，1993年;Tabish等人，1995年)，一种影响与FLA10密切相关的驱动蛋白样蛋白的突变。喜欢渗透压-3,渗透压-1和渗透压-6被鉴定为对外界渗透梯度变化无反应的突变株(库洛蒂和罗素，1978年)由于位于感觉神经元树突远端的感觉纤毛的形成和功能缺陷(Perkins等人，1986年). 尽管线虫感觉纤毛的超微结构各不相同，但典型的纤毛是一种膜结合的非运动轴索结构，包含九个外部双MT和数量不等的中心MT，但缺乏运动纤毛中存在的许多蛋白质，如动力蛋白和放射状辐条复合物。在渗透压-1和渗透压-6突变体，所有感觉纤毛都比野生型短得多，但渗透压-3仅影响暴露在外部环境中的感觉纤毛，这表明虽然IFT颗粒在所有感觉纤毛中起作用，但OSM-3的作用可能由一些感觉纤毛的交替驱动蛋白-II承担。因此，在秀丽线虫感觉神经元、FLA10驱动蛋白II的同源物和复合B多肽p52和p172都是形成正常感觉纤毛所必需的（表​（表四）。四、).

在中看到的表型秀丽线虫IFT颗粒多肽同源物的突变表明，这些颗粒在不涉及纤毛搏动的线虫中起作用，因为这些纤毛是不动的，颗粒也不传递与轴丝中心结合的蛋白质，例如径向辐条和内动力蛋白臂，因为这些蛋白质不存在于感觉纤毛中。通过对p52同源物、OSM-6和NGD5的序列分析，提出了IFT的一个可能功能；OSM-6和NGD5都包含PxxP基序(Wick等人，1995年;Collet等人，1998年)，可能与多种蛋白质中发现的SH3结构域相互作用，包括信号转导和细胞骨架蛋白质(Cohen等人，1995年). 可以推测，除了睫状体组装外，OSM-6和p52还可能参与信号转导，例如，将来自鞭毛膜的外部信号传递到细胞体。

激动素-II与其他生物体纤毛结构的联系

虽然有免疫学证据表明衣原体鞭毛（查阅伯恩斯坦和罗森鲍姆，1994年;Bernstein等人，1994年;Fox等人，1994年;约翰逊等人，1994年)，已知鞭毛组装和维护只需要FLA10驱动蛋白II。有证据表明，除衣原体可能与睫状结构类似。与OSM-3类似秀丽线虫（如上所述），脊椎动物驱动蛋白II，KIF3A/3B-KAP3，也存在于神经元中，但被认为是小鼠的快速轴突运输马达(Aizawa等人，1992年;Kondo等人，1994年;Yamazaki等人，1995年,1996). KIF3A/3B-KAP3也可能在纤毛发生中起作用，因为在睾丸和肺等纤毛组织中单独亚基的表达非常高(Kondo等人，1994年;Yamazaki等人，1995年,1996). 在太阳鱼体内，针对KIF3A的抗体升高(Kondo等人，1994年)用于定位与感光细胞连接纤毛的驱动蛋白II同源物(Beech等人，1996年). 脊椎动物杆状光感受器是一种特殊的感觉神经元，由一个由膜结合的“连接纤毛”连接到细胞体或内节的感光外节组成(贝沙斯和霍斯特，1990年)包含9+0轴突结构。这些细胞中的KIF3样抗原最集中于基底体周围，一些抗原沿连接纤毛分布(Beech等人，1996年)，与衣原体此处报告了FLA10驱动蛋白II（图。​（图10）。10). 棘皮动物精子中也有类似的分布，其中驱动蛋白II（以前称为KRP85/95）集中在包含基底体和线粒体的中段周围，在鞭毛中分布较少(Henson等人，1997年). 这些分布表明，驱动蛋白II与多种生物中的纤毛相关。

将抗驱动蛋白II抗体微量注射到海胆胚胎中，显示驱动蛋白Ⅱ参与棘皮动物纤毛发生的直接证据(莫里斯和斯科利，1997年). 注射后的胚胎发育正常，直至达到纤毛囊胚阶段，此时细胞只能聚集不动的短纤毛，缺少中央对微管和不同数量的其他轴突成分。因此，就像衣原体FLA10驱动蛋白II和秀丽线虫OSM-3，海胆驱动蛋白II似乎直接参与纤毛发生。

我们感谢T.Ferguson提供了卓越的技术支持，感谢伍斯特生物医学研究基金会微测序设施的J.Leszyk博士，感谢J.Wolenski博士（耶鲁大学MCDB）在光显微成像方面的帮助，感谢P.Yang和W.Sale博士（埃默里大学），D.Kirk博士（华盛顿大学），E.Savino，C.Wilkerson和G。Witman（伍斯特基金会）慷慨分享抗体，G.Pazour和G.Witman博士（伍斯特基会），R.Herman和J.Shaw（明尼苏达大学），R.Morris和J.Scholey（加利福尼亚大学）进行有益的讨论并分享未发表的结果。

这项工作得到了美国国立卫生研究院拨款GM14642和美国国家科学基金会拨款45147的支持。