细胞生物学杂志。1998年4月6日；141(1): 199–208.
ZO-3是发现于紧密连接处的MAGUK蛋白家族的一个新成员，与ZO-1和Occludin相互作用
加拿大艾伯塔省埃德蒙顿市艾伯塔大学细胞生物学和解剖学系T6G 2H7
地址：Bruce R.Stevenson，细胞生物学和解剖学系，加拿大阿尔伯塔省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学医学大楼5-14号，T6G 2H7。电话：（403）492-1841。传真：（403）492-0450。电子邮件：ac.atreblau@nosnevets.eurb
1997年9月19日收到；1998年1月16日修订
摘要
从Madin-Darby犬肾（MDCK）细胞中批量纯化一种与紧密连接蛋白ZO-1共免疫沉淀的130-kD蛋白，并进行部分内肽酶消化和氨基酸序列测定。得到的19个氨基酸序列为筛选犬cDNA文库奠定了基础。五个重叠克隆包含一个2694 bp的开放阅读框，编码898个氨基酸的蛋白质，预测分子量为98414道尔顿。序列分析表明，该蛋白包含三个PSD-95/SAP90、大圆盘、ZO-1（PDZ）结构域、型钢混凝土同源性（SH3）结构域，以及一个类似于鸟苷酸激酶的区域，使其与ZO-1、ZO-2同源，ZO-1、ZO-2是果蝇属以及MAGUK蛋白质家族的其他成员。与ZO-1和ZO-2一样，该新蛋白包含一个COOH末端酸性结构域和一个位于第一和第二PDZ结构域之间的碱性区域。与ZO-1和ZO-2不同，该蛋白在PDZ2和PDZ3之间显示出富含脯氨酸的区域，并且明显不包含选择性剪接结构域。稳定转染表位标记结构的MDCK细胞表达的外源性多肽的表观分子质量为～130 kD。此外，该蛋白通过免疫荧光和免疫电子显微镜在紧密连接处与ZO-1共定位。体外亲和力分析表明，重组130-kD蛋白直接与ZO-1和闭塞素的细胞质域相互作用，而与ZO-2不相互作用。我们建议将该蛋白命名为ZO-3。
T型他紧密连接可限制物质通过细胞旁间隙的运动，并作为上皮细胞和内皮细胞组成不同的顶端和基底外侧质膜域之间的边界。近十年来，紧密连接的分子结构引起了人们极大的兴趣。肌动蛋白丝(17,29)和外周膜蛋白ZO-1(40)，扣带蛋白(10)、ZO-2(21)，7小时6(48)，拉布3B(43)，辛普利金(22)和AF-6(47)现在已知在紧密连接处发现。闭塞素是一种跨膜蛋白，也定位于紧密连接处(14). 关于这些元素在紧密连接生理学中所起作用的信息有限。例如，肌动蛋白丝被认为在调节连接通透性中起作用(30)尽管发生这种情况的分子联系尚不清楚。来自几个实验室的数据表明，闭塞素作为细胞旁通透性屏障的一部分发挥作用(6,31,45)并参与细胞间粘附(42); 然而，仍有可能涉及其他未知的跨膜成分。
ZO-1和ZO-2是首批发现的紧密连接蛋白(16,21,40). 这些蛋白质的克隆和序列分析表明，它们是可能参与肿瘤抑制和/或信号转导的更大蛋白质家族的一部分(21,44). 这个家族包括椎间盘大肿瘤抑制基因产物(数据链接组-A） 第页，共页果蝇属(46); 红细胞膜蛋白p55(35); 和PSD-95/SAP90，一种突触膜蛋白(9,25). 塔玛，等一下果蝇属与ZO-1同源的蛋白质也已被鉴定(41). 鸟苷酸激酶（GUK）的同源区域是所有家族成员的共同特征1，一个型钢混凝土同源（SH3）结构域和可变数量的PDZ结构域。后一类结构域已被证明在结合整体膜蛋白（如突触的离子通道）中起作用(23,27). 此外，PSD95/SAP90的GUK结构域已被证明能结合一种新的突触蛋白(24)ZO-1的SH3结构域结合丝氨酸蛋白激酶，该激酶磷酸化蛋白质COOH末端的一个区域(4). 膜的结合和GUK结构域在这个蛋白质集合中的存在使它们被命名为MAGUK家族(1).
关于紧密结合蛋白之间直接相互作用的信息也很有限。亲和力分析表明ZO-1与闭塞蛋白结合(15)和Ras目标AF-6(47). 其他观察结果表明，ZO-1具有结合光谱蛋白的能力(15,20)虽然这种细胞骨架蛋白在紧密连接处的定位还没有文献报道。这些观察结果，再加上MAGUK结构域的蛋白结合能力，很可能表明紧密连接符合粘附连接和桥粒的结构范式，即通过外周膜蛋白复合体与细胞骨架相连的跨膜成分的结构范式。
在设计用于保存蛋白质相互作用的条件下进行的ZO-1免疫沉淀表明，130 kD的额外蛋白质与含有ZO-1和ZO-2的复合物相互作用(5). 尽管已知该蛋白被磷酸化，但迄今为止尚未对其进行进一步表征。在这里，我们报道了130kD蛋白的分离、鉴定和部分表征。我们发现该蛋白是MAGUK蛋白家族的一个新成员，直接与ZO-1和闭塞素相互作用。当蛋白质定位于紧密连接处时(闭塞带)，我们将其命名为ZO-3。
材料和方法
细胞培养
如前所述，培养MDCK株II细胞并进行代谢标记(2,37). MDCK细胞系MDCK/Z3是通过使用脂蛋白转染pBK-CMV（见下文）中全长ZO-3构建物的亲本系而产生的(直布罗陀（马里兰州盖瑟斯堡）和G418根据既定协议进行选择(三). MDCK/Z3细胞的传代和生长与亲本细胞相同。Sf9昆虫细胞(GIBCO巴西雷亚尔)在无血清培养基（Sf-900 II SFM；GIBCO巴西雷亚尔)在以125 rpm旋转的轨道平台上的非增湿环境空气培养箱中，温度为28°C。细胞密度保持在4×10之间5至2×106细胞/ml，存活率>90%。
免疫沉淀
在保持某些蛋白-蛋白质相互作用（“低严格性”）的条件下，通过修改先前公布的技术进行免疫沉淀(16,21). MDCK细胞的汇合单层在冰镇TBS中用1 mM CaCl冲洗两次2，0.5 mM氯化镁20.2 mM PMSF和1μg/ml抑肽酶。将细胞溶解于1%Triton X-100、0.5%脱氧胆酸钠、0.2%十二烷基硫酸钠、150 mM NaCl、20 mM Hepes、pH 7.4、2 mM EDTA、1μg/ml抑肽酶、0.2 mM PMSF、1μ/ml凝乳抑素、1μg/ml亮氨酸肽和1μg/ml胃蛋白酶抑素中。在13000℃下离心溶解材料克在4°C下保持30分钟以清除细胞碎片。大鼠抗ZO-1单克隆抗体R40.76(2)添加到上清液中，然后添加山羊抗鼠IgG(杰克逊免疫研究实验室。，宾夕法尼亚州West Grove）与溴化氰活化的Sepharose 4B偶联(法玛西亚生物技术公司。新泽西州皮斯卡塔韦）。作为阴性对照，R5.21是一种与R40.76同源的鼠单克隆抗体(40)已使用。按照以下程序清洗Sepharose珠Pasdar和Nelson（1989）并在凝胶样品缓冲液中溶解。
如前所述，从热的1%十二烷基硫酸钠中溶解的细胞中进行ZO-1、ZO-2和ZO-3的高度免疫沉淀（标记有来自水疱性口炎病毒G蛋白胞质域的11个氨基酸表位；见下文）(39)使用R40.76 anti-ZO-1/抗鼠IgG–Sepharose、兔多克隆抗ZO-2（参考21; R9989，来自马萨诸塞州波士顿哈佛医学院Lynne Jesaitis和Dan Goodenough的礼物）/蛋白质a–Sepharose(Pharmacia生物技术公司。)、小鼠抗VSV-G胞质域单克隆抗体（克隆P5D4；博林格曼海姆公司。印第安纳波利斯，印第安纳州）/蛋白质G–Sepharose(法玛西亚生物技术公司。).
ZO-3的分离与克隆
批量免疫沉淀和纯化。
ZO-1从104个滚筒瓶（1600厘米）中进行免疫沉淀2每个）MDCK细胞在低严格条件下。将溶解在凝胶样品缓冲液中的免疫沉淀物混合，在过滤浓缩器（Centriprep 100；Amicon Corp.，Danvers，MA）中离心浓缩，并在制备的SDS-PAGE上运行。将约25μg ZO-3（通过比较考马斯蓝染色标准品确定）转移到PVDF上，在Hoeffer TE42转移装置中，在90伏电压下操作6小时，并通过温控水浴将其保持在20°C。4 h后改变转移缓冲液（25 mM Tris，pH 8.3，190 mM甘氨酸，0.01%十二烷基硫酸钠）。用氨基黑染色，观察聚偏二氟乙烯（PVDF）上的蛋白质。通过使用代谢标记物质进行转移试验，优化了ZO-3的缓冲液和转移条件。
氨基酸测序和RT-PCR。
将含有聚偏氟乙烯的ZO-3提交给洛克菲勒大学蛋白质测序设施进行Lys-C内肽酶微消化(12)氨基酸（aa）测序。我们获得了以下19个氨基酸序列：TAEMPDQFGIADSVLRTDN。合成了两端6个氨基酸对应的简并引物：正向，5′-AC（AC）GC（CT）GAG ATG CC（CT）GA 3′；背面，5′-GTT GTC（GT）GT（GCT）CG（GC）AG（GC”AC-3′。用这些引物对用TRIZOL从MDCK细胞中分离的总RNA进行RT-PCR(GIBCO巴西雷亚尔)根据制造商说明。PCR产物亚克隆到TA载体中（Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA）。PCR产物的真实性在Southern blots上用一种简并合成的寡核苷酸（5′-GA（CT）CA（AG）TT（CT）GG（AGCT）AT（ACT）GC-3′）进行验证，末端标记有δ-[32P] ATP（ICN制药公司，加利福尼亚州欧文）。该寡核苷酸对应于原始肽的内部aa。Southern blots上的阳性产物进行了双链测序。获得了验证整个原始19aa肽的57mer。
图书馆筛选。
合成了57-mer，末端标记为δ-[32P] ATP，用于在λ-ZAP（由德国海德堡欧洲分子生物学实验室Marino Zerial提供）中使用以下方法筛选定向寡核苷酸（dT）引物MDCK细胞cDNA文库：Ausubel等人（1992年）在筛选～500000个噬菌体后，分离出10个阳性杂交噬菌体。按照制造商的指示，从噬菌体纯化噬菌体中切下含有插入物的pBluescript（加利福尼亚州拉霍亚市斯特拉赫纳）。最长的插入物（A1，1.6 kb）进行双链测序。该序列的分析，以及蛋白质的分子量和通过Northern blot测定的成熟ZO-3 mRNA的大小（～3.4 kb，见图。)表明A1克隆包含开放阅读框的3′端，但不包含5′端。为了扩展ZO-3序列的5′端，我们构建了Uni-ZAP XR（Stratagene）中ZO-3的定向MDCK cDNA文库。MDCK细胞聚（A）+用PolyATract mRNA System III分离RNA(Promega公司。（威斯康星州麦迪逊），并用含有XhoI位点的ZO-3特异性反义连接蛋白引物（5′-GAG AGA GAG AGA GAA CTA GTC TCG AGC TCC TGG ATG-3′）进行反向转录。该引物位于克隆A1 5′端下游173 bp处。cDNA用EcoRI适配器连接，用XhoI消化，大小分级，并连接到Uni-ZAP XR载体。用寡核苷酸5′-CAG CTA TGA CAT CTA CAG GGT GCC CAG CCA GAG CGC AGA GGA CCG TG-3′末端标记δ-[32P] ATP。该序列是A1克隆已知区域的补充，该克隆位于用于创建文库的引物的173 bp 5′中。筛选了大约200000个斑块，纯化了6个阳性克隆斑块。通过限制性消化确定插入物的大小，并对3′200–300 bp进行测序，以验证克隆是否具有ZO-3特异性。选择最长的克隆进行双链测序。所有测序均通过使用Sequenase Version 2.0（美国生化公司，俄亥俄州克利夫兰）、Fidelity DNA测序系统（Oncor公司，马里兰州盖瑟斯堡）或阿尔伯塔大学DNA测序设施进行。
ZO-3和ZO-2的北方斑点。5μg MDCK细胞聚（A）+针对ZO-3的RNA探针显示了一个～3.4-kb的转录本。ZO-2的印迹剥离和重制显示预期的5.2-kb转录本(21). 右侧的RNA标准（kb）。
序列分析。
使用威斯康星大学遗传计算机组（GCG）软件包分析了核苷酸序列、各个域的aa组成和等电点以及蛋白质的总分子量。氨基酸序列比较以确定百分比一致性和百分比相似性（百分比一致性+百分比保守替换），使用GCG GAP比对程序中的默认参数，基于Needleman和Wunsch（1970）使用GCG PILEUP进行序列比对。比较序列的氨基酸数如表所示。
表一
| | hZO-1型 | | cZO-2型 | | cZO-3型 | | 塔马 | |
数据链接组-A类 |
|---|
| 起点 | | 1–10 | | 1–9 | | 1–10 | | | | |
| PDZ1型 | | 11–97 | | 10–96 | | 11–92 | | 23–110 | | 40–122 |
| 链接 | | 98–173 | | 97–290 | | 93–185 | | | | |
| PDZ2型 | | 174–251 | | 291–368 | | 186–263 | | 167–251 | | 154–244 |
| 链接 | | 252–411 | | 369–495 | | 264–371 | | | | |
| 客运专线3 | | 412–490 | | 496–574 | | 372–450 | | 408–486 | | 486–567 |
| 链接 | | 491–507 | | 575–591 | | 451–467 | | | | |
| 第3页 | | 508–569 | | 592–650 | | 468–535 | | 500–563 | | 604–667 |
| 链接 | | 570–634 | | 651–713 | | 536–606 | | | | |
| GUK公司 | | 635–782 | | 714–863 | | 607–753 | | 629–787 | | 770–948 |
| 链接 | | 783–805 | | 864–882 | | 754–772 | | | | |
| 酸性 | | 806–876 | | 883–947 | | 773–835 | | | | |
| 终点 | | 877–1736 | | 948–1174 | | 836–898 | | | | |
北方和南方印迹
通过一步法从MDCK细胞中分离出总RNA用于Northern blotAusubel等人（1992年）和聚（A）+mRNA由PolyATract System III生成(Promega公司。). RNA被转移到Magna（MSI）尼龙膜上，并与紫外线辐射交联（Stratalinker；Stratagene）。通过EcoRI/PstI消化产生的ZO-3 A1 cDNA的5′端有一个230-bp片段（见图。)PCR产生的850-bp片段（引物：正向，5′-GCACGAGAGAGAGA-3′；反向，5′-TTCTTCATGCCAGATC-3′）被随机引物标记并用作探针。斑点在68°C下杂交过夜，并根据之前公布的方案进行清洗(18). 根据既定技术进行Southern杂交(三)使用Duralon UV（Stratagene）并如上所述进行探测。
全长ZO-3 cDNA的示意图。(一)带有EcoRI的3072-bp cDNA(E类)和XhoI(X（X）)5′端和3′端的限制位点。(实线)未翻译区域。框中显示的开放阅读框，带有XcmI、EagI、PstI（A1 cDNA特有）和内部XhoI限制位点。(b条)从文库筛选中获得的单个克隆。对所有部分cDNA进行双链测序。(c（c）)以1kb片段表示的比例尺。
ZO-3表位标记
从重叠克隆中组装出全长ZO-3 cDNA并亚克隆到真核表达载体pBK-CMV（Stratagene）中。为了去除ZO-3 cDNA的241 bp 5′非翻译区，用以下引物对5′区进行PCR扩增：正向，5′-GGG-AAT-TCC-AGG-TGC-ACA-TGG-AGG-A-3′；反向5′-CGG CAC CAC ATC GGA CAC GAC C-3′（图的核苷酸380–359。). 正向引物包含一个EcoRI限制位点和紧邻ZO-3起始密码子上游的12 bp。扩增的DNA片段用于通过用EcoRI和XcmI限制性消化取代ZO-3的原始5′非翻译区（见图。). 使用以下引物通过PCR将ZO-3的COOH末端标记为11-aa VSV-G表位：反向，5′-CAA TCT AGA TTA CTT AAG TCG GTT CAT CTC TAT GTC TGT ATA CAG GTC GGT GGC CGG GCC-3′，正向5′-TAC GAG ACG GAC GGC GAG GG-3′（图中的核苷酸2634–2653。). 反向引物编码一个XbaI限制位点、一个终止密码子和紧邻ZO-3末端亮氨酸下游的VSV-G细胞质结构域的11 aa。扩增的DNA片段被用于用XhoI和XbaI限制性酶切取代ZO-3的原始3′端（见图。). PCR扩增片段的所有序列均经DNA测序验证。
免疫印迹法
使用ECL进行免疫印迹(Amersham公司。（伊利诺伊州阿灵顿高地）。根据以下要求制备全细胞裂解物史蒂文森等人（1994）使用了以下主要抗体：抗ZO-1单克隆抗体R40.76(2); 兔抗ZO-2(21); 兔抗VSV-G细胞质结构域（马里兰州巴尔的摩约翰霍普金斯大学卡罗琳·马查默赠送）；一种抗人ZO-1多克隆抗体(Zymed Laboratories，Inc.公司。加利福尼亚州旧金山南部）；以及针对与PDZ1和PDZ2之间的连接区（aa 95–185）对应的ZO-3融合蛋白生成的部分特征化豚鼠抗血清。这种抗ZO-3抗血清对融合蛋白（数据未显示）、重组全长ZO-3和整个MDCK细胞裂解液中存在的130kD条带显示出较强的反应性（见图。
c（c）). 然而，在MDCK细胞裂解物的免疫印迹上，它也显示出微弱的反应性，其带与ZO-1结合。这种反应性的性质尚未完全阐明，但与使用它的结合研究无关（抗血清未用于免疫定位；见下文）。过氧化物酶偶联的山羊抗大鼠IgG、山羊抗豚鼠IgG(杰克逊免疫研究实验室。)和山羊抗兔IgG（加州Hercules Bio-Rad实验室）用作二级抗体。
重组ZO-3与紧密连接蛋白的结合。(一)ZO-3结合MDCK细胞提取物中的ZO-1和ZO-2。含有全长ZO-3（车道）的亲和树脂1)或阴性对照肽（lanes2)与MDCK细胞膜的高盐提取物孵育，清洗、溶解并免疫印迹ZO-1(左边)或ZO-2(正确的). 含有ZO-3的树脂特别保留了ZO-1和ZO-2。(b条)ZO-3直接与ZO-1结合。体外转录/翻译产生的放射性标记ZO-1（lane1)用含有全长ZO-3（lane）的亲和树脂培养2)或阴性对照肽（lane三). 对树脂进行清洗、溶解并进行SDS-PAGE。含有ZO-3的树脂特别保留了215 kD的带。该条带通过免疫印迹法确认为ZO-1，方法是在lane中对相同的一份结合材料进行免疫印迹2含抗人ZO-1抗血清（lane4). 车道1–3，放射自显影；车道4、ECL。(c（c）)抗ZO-3抗血清的部分特征。针对部分ZO-3产生的豚鼠抗血清与整个MDCK细胞裂解液（lane）中存在的130kD带反应1). 它还显示出与ZO-1结合的带的微弱反应性(箭头). 免疫前血清（lane）未检测到与MDCK细胞蛋白的反应2). (d日)ZO-3直接与闭塞素的细胞质尾部结合。重组ZO-3与亲和树脂孵育，亲和树脂含有闭塞素（lane）的COOH末端148 aa1)或阴性对照肽（lane2). 将结合材料从洗涤过的树脂中洗脱，并用抗ZO-3抗血清进行免疫印迹。含有闭塞素的树脂特别保留ZO-3。(e（电子）)ZO-3未绑定到ZO-2。重组ZO-2（车道1)用含有ZO-3（lane）的亲和树脂培养2)或阴性对照肽（lane三). 结合物从洗涤树脂中洗脱，并用抗ZO-2抗血清进行免疫印迹。在这两种情况下均未检测到结合。从含有ZO-3（车道）的树脂中收集的未结合部分4)或阴性对照肽（lane5)用抗ZO-2抗血清进行免疫印迹。车道树脂上ZO-3的存在2通过剥离印迹并用抗ZO-3抗血清（lane6).
ZO-3的本地化
根据先前公布的方案进行免疫荧光(18)使用R40.76抗ZO-1大鼠单克隆抗体/FITC-结合的山羊抗鼠IgG(杰克逊免疫研究实验室。)和兔抗VSV-G/罗丹明结合驴抗兔(杰克逊免疫研究实验室。). MDCK/Z3细胞在染色前用2.5%多聚甲醛固定并用-20°C甲醇渗透。
根据免疫电镜技术在分离的MDCK/Z3细胞膜上进行Jesaitis and Goodenough（1994年）除了用2.5%多聚甲醛将膜固定在冰上15分钟，然后在50 mM甘氨酸中淬火，在抗体孵育前用1%牛血清白蛋白在PBS中冰上淬火20分钟。然后将膜与R40.76抗-ZO-1/10 nm金结合山羊抗-大鼠（英国生物细胞国际，英国加的夫）和兔抗-VSV-G/5 nm金结合羊抗-兔共标记(西格玛化学公司。（密苏里州圣路易斯），然后处理薄型EM(40).
地缘关系绑定
蛋白质表达。
全长犬ZO-2(7)和ZO-3 cDNA亚克隆到杆状病毒真核表达系统的pFastBac HT载体系列中(GIBCO巴西雷亚尔马里兰州盖瑟斯堡）。结果构建物（pHTb/ZO-2或pHTc/ZO-3）编码NH处带有6-组氨酸标签的蛋白质2终点站。pHTb/ZO-2和pHTc/ZO-3转化为大肠杆菌含有杆状病毒基因组的DH10Bac细胞。利用脂蛋白将从转化的DH10Bac细菌中分离的DNA转染到Sf9昆虫细胞中。在感染后48小时（ZO-2）或60小时（ZO-3）收集转染的Sf9细胞。采集的细胞在500下离心克在需要之前，将细胞颗粒保持在−70°C下5分钟。亲本载体pFastBac HTc单独（pHTc）编码6-组氨酸标签和36个非特异性aa，作为阴性对照。
将全长ZO-3 cDNA亚克隆到原核表达载体pGEX-3X中，生成GST/ZO-3融合蛋白。编码鸡闭塞素细胞质COOH末端尾部（aa 358–505）的cDNA(14)pGEX-2T中是Alan Fanning和James Anderson（耶鲁大学，纽黑文，CT）赠送的礼物。根据制造商说明制备GST融合蛋白(Pharmacia生物技术公司。). 简言之，在100μg/ml氨苄西林存在下，用5 ml过夜培养液接种50 ml培养基。将培养物在37°C下孵育1.0 h，以250 rpm的转速摇晃，然后添加IPTG至最终浓度0.1 mM，并继续孵育3.0 h。细胞在5000℃离心收集克持续10分钟，并在含有1.0 mM DTT、1.0 mg/ml BSA、1μg/ml抑肽酶、0.2 mM PMSF、1μ/ml凝乳抑素、1μg/ml亮氨酸肽和1μg/ml胃蛋白酶抑素的2 ml PBS中再次悬浮。对细胞进行短暂的超声波处理，然后与10%Triton X-100混合至最终浓度1.0%。细胞裂解液在10000时澄清克在4°C下保持30分钟，以去除不溶性物质。将上清液转移到新试管中，与0.1 ml 1:1谷胱甘肽/琼脂糖浆液（用PBS预洗）混合，并在室温下培养30分钟。将珠子在冷PBS中洗涤4×1.0 ml。仅编码GST的载体作为阴性对照。
根据制造商的说明，通过体外转录/翻译制备重组ZO-1(Promega公司。)在T7启动子的控制下，从全长人ZO-1 cDNA亚克隆到pBluescript SK+中（从Anderson博士和Fanning博士处获得）。简言之，25μl TNT兔网织红细胞裂解物、2μl TNT反应缓冲液、1μl TNT-T7 RNA聚合酶、1μl氨基酸混合物减去蛋氨酸（1 mM）、40 U RNasin、1μg模板DNA和4μl[35S] 每次反应均使用总体积为50μl的蛋氨酸（1000 Ci/mMol，10 mCi/ml；ICN Pharmaceuticals Inc.，Irvine，CA）。反应混合物在30°C下孵育90分钟，蛋白质产物立即用于结合分析。
间接绑定。
根据对MDCK全细胞提取物中ZO-1和ZO-2与重组ZO-3的结合技术的改进，测定了ZO-3与ZO-1及ZO-2的结合Furuse等人（1994年）将来自50 ml培养的pHTc/ZO-3/Sf9或pHTc/Sf9细胞的细胞颗粒在冰上解冻，并重新悬浮在含有50 mM NaH的2 ml裂解缓冲液中2人事军官4，300 mM氯化钠，10 mM氯化镁2，10 mM咪唑，pH 8.0，1μg/ml抑肽酶，0.2 mM PMSF，1μg/ml糜蛋白酶抑制素，1μg/ml亮肽和1μg/ml肽抑制素。将溶菌酶添加到最终浓度为1 mg/ml。将细胞悬浮液在冰上培养30 min，此时将DNase添加到5μg/ml，并将悬浮液在冰面上培养15 min。超声处理后，将NP-40添加到细胞裂解液中，使最终浓度为1%，混合物在4°C下旋转30分钟，以溶解过度表达的ZO-3蛋白。悬浮液在10000下离心克持续20分钟，然后丢弃颗粒。对于每个结合反应，用3 ml裂解缓冲液清洗50μl Probond珠（Invitrogen Corp.）。将500μl pHTc/ZO-3/Sf9或pHTc/Sf9上清液添加到珠子中，并在4°C下轻轻摇晃培养30分钟。然后用3 ml洗涤缓冲液（50 mM NaH）洗涤珠子2人事军官4、300 mM NaCl、50 mM咪唑、pH 8.0、1μg/ml抑肽酶、0.2 mM PMSF、1µg/ml凝乳抑素、1μg/ml亮氨酸肽和1μg/ml胃蛋白酶抑素），并用于结合分析。
将2×15-cm培养皿中的汇合MDCK细胞刮除、造粒并在3 ml溶液K（140 mM KCl、10 mM Hepes、pH 7.5、1 mM MgCl）中均质2、1μg/ml抑肽酶、0.2 mM PMSF、1μ/ml凝乳抑素、1μg/ml亮氨酸肽和1μg/ml胃蛋白酶抑素）。悬浮液以100000离心克在4°C下保持60分钟。将所得颗粒重新悬浮在1 ml高盐溶液中（1 M KCl、10 mM Hepes、pH 7.5、1μg/ml抑肽酶、0.2 mM PMSF、1μg/ml凝乳抑素、1μgml亮氨酸肽和1μg/ml胃蛋白酶抑素），并在冰上培养60 min，然后再培养10万克离心60分钟。含有细胞提取物的上清液用4.65 ml 10 mM Hepes、pH 7.5、30 mM咪唑、1μg/ml抑肽酶、0.2 mM PMSF、1μg/ml凝乳抑素、1μ/ml亮氨酸肽和1μg/ml胃蛋白酶抑素稀释。稀释成低盐时形成的蛋白质聚集体被去除10000克10分钟，4°C离心。在Triton X-100中制备1 ml所得上清液，其中1%用于ZO-1的结合，或在Brij 58中制备1%用于ZO-2的结合。然后将1ml样品加入50μl ZO-3或阴性对照肽结合珠中，并在4°C下温和旋转孵育过夜。用0.2%Triton X-100和0.2%Tween 20的洗涤缓冲液洗涤珠子3倍。然后将珠再次悬浮在45μl洗涤缓冲液和6μl 10×凝胶样品缓冲液中，以及在SDS-PAGE上运行的等效5μl样品中，并如上所述对ZO-1和ZO-2进行免疫印迹。
直接绑定。
体外转录/翻译[35S] 将蛋氨酸标记的人ZO-1添加到结合缓冲液中杆状病毒表达的ZO-3或与Probond树脂结合的阴性对照肽中（140 mM KCl、25 mM咪唑、pH 8.0、1.5%Brij 58、1μg/ml抑肽酶、0.2 mM PMSF、1μ/ml凝乳抑素、1μg/ml亮氨酸肽和1μg/ml胃蛋白酶抑素）。允许在4°C下旋转过夜进行捆扎。用洗涤缓冲液洗涤珠子4×1ml，再悬浮在等体积的2×凝胶样品缓冲液中，并在SDS-PAGE上运行。使用抗人ZO-1多克隆抗体通过免疫印迹法确认与ZO-3珠结合的ZO-1的身份。细菌表达的ZO-3也获得了类似的结果（数据未显示）。为了检测ZO-3与闭塞素的结合，将杆状病毒表达的ZO-3用300 mM咪唑从Probond树脂中洗脱出来，添加到GST/闭塞素中，或在溶液K中单独与谷胱甘肽琼脂糖结合的GST中。在4°C下培养过夜后，用4×1 ml溶液K清洗谷胱甘素琼脂糖。用25 mM谷胱甘肽洗脱结合蛋白，在SDS-PAGE上溶解，转移到硝化纤维素中，并用抗ZO-3抗血清进行免疫印迹。将300 mM咪唑从Probond树脂中洗脱出来的杆状病毒表达的ZO-2添加到GST/ZO-3或GST单独与溶液K中的谷胱甘肽琼脂糖结合来评估ZO-3与ZO-2的结合。珠子在4°C下培养2小时，并用4×1 ml溶液K冲洗，结合蛋白用25 mM谷胱甘肽洗脱，未结合组分在SDS-PAGE上溶解，转移到硝酸纤维素中，并用抗ZO-2抗血清进行免疫印迹。通过剥离印迹并用抗-ZO-3抗血清重制来确认珠子上存在ZO-3。
结果
ZO-3是MAGUK家族的成员
先前的研究表明，一种130 kD的蛋白质在设计用于保持蛋白质-蛋白质相互作用的条件下与ZO-1和ZO-2特异性共沉淀(5,21). 我们重复了这些观察结果，并注意到130-kD蛋白的数量明显少于ZO-1或ZO-2（图。). 然而，通过整体免疫沉淀分离和凝胶电泳纯化可为内肽酶消化提供足够的130-kD多肽(12)和aa测序。合成了基于一个独特的19aa片段每个末端的6aa的变性引物，并从MDCK细胞RNA中RT-PCR产生了一个57bp的寡核苷酸，该寡核苷酸证实了整个原始的19aa。然后使用该57mer筛选MDCK cDNA文库。获得的第一个克隆A1随后用于筛选相同的库。为了获得cDNA的5′端，我们创建了一个针对该蛋白的定向MDCK cDNA文库。
在保持蛋白质-蛋白质相互作用的条件下，从代谢标记的MDCK细胞提取物中用抗ZO-1单克隆抗体（+）或非特异性但相同的亚类单克隆抗体进行免疫沉淀，结果表明ZO-2（160 kD）和ZO-3（130 kD）与ZO-1（215 kD）特异性共沉淀。右侧分子质量标记（kD）。
总共获得了五个重叠克隆（图。). 测序表明，这些cDNA包含一个2694 bp的开放阅读框，编码898 aa（图。). 获得的cDNA的总大小（～3.1 kb）与Northern blot检测到的蛋白质的～3.4 kb mRNA很好地对应（图。). 该aa序列的预测分子量为98414 D，表明该蛋白在SDS-PAGE上异常运行，正如之前对其他蛋白质（包括ZO-1和ZO-2）所观察到的那样(21,44)，或经翻译后修饰。130-kD蛋白先前被证明是磷酸化的(5). 序列分析表明，预测的aa序列包含3个PDZ域、一个SH3域和一个GUK区域（图。)，表明与ZO-1、ZO-2、大型果蝇盘(数据链接组-A） 以及塔木（TamA）和其他MAGUK家族成员。来自ZO-1、ZO-2、ZO-3、TamA和数据链接组-说明ZO-3在所有三个域以及整个序列中与ZO-1和ZO-2具有高度相似性（表，图。). 此外，ZO-3与数据链接组-A为ZO-1。然而，ZO-3，尤其是ZO-1与TamA的相似程度高于数据链接组-A、 表明TamA更接近果蝇属家庭成员。我们得出结论，ZO-3是MAGUK蛋白质家族的一个新成员。
表二
ZO-1、ZO-2、ZO-3、dlg-A和TamA的MAGUK结构域的氨基酸比较
| | | | ZO-3公司 | | ZO-1号机组 |
|---|
| PDZ1型 | | ZO-1号机组 | | 57（72） | | - |
| | ZO-2型 | | 61(76) | | 71(82) |
| | 塔马 | | 46(66) | | 63(78) |
| |
数据链接组-A类 | | 35(60) | | 44(68) |
| | | | | | |
| PDZ2型 | | ZO-1号机组 | | 50(72) | | - |
| | ZO-2型 | | 55(74) | | 65(86) |
| | 塔马 | | 31(57) | | 43(71) |
| |
数据链接组-A类 | | 22（30） | | 44(78) |
| | | | | | |
| 客运专线3 | | ZO-1号机组 | | 63(81) | | - |
| | ZO-2型 | | 59(75) | | 70(86) |
| | 塔马 | | 48(68) | | 48(69) |
| |
数据链接组-A类 | | 42(66) | | 42(69) |
| | | | | | |
| 第3页 | | ZO-1号机组 | | 58(76) | | - |
| | ZO-2型 | | 59(80) | | 69(85) |
| | 塔马 | | 41(62) | | 53（76） |
| |
数据链接组-A类 | | 34(58) | | 29(58) |
| | | | | | |
| GUK公司 | | ZO-1号机组 | | 52(69) | | - |
| | ZO-2型 | | 52(71) | | 67(82) |
| | 塔马 | | 40(66) | | 43（68） |
| |
数据链接组-A类 | | 34(53) | | 31(54) |
| | | | | | |
| 总体 | | ZO-1号机组 | | 47(64) | | - |
| | ZO-2型 | | 47(65) | | 51（67） |
| | 塔马 | | 34(57) | | 31(52) |
| |
数据链接组-A类 | | 27(48) | | 26(47) |
犬ZO-3和人ZO-1的MAGUK结构域的多重序列比对(44)，犬只ZO-2(7),果蝇属塔马(41)和dlg-A(46)采用GCG PILEUP建造。GUK结构域也与酵母鸟苷酸激酶序列进行了比较(8). 深色阴影区域表示与ZO-3序列一致，浅色阴影是保守的aa替换。PDZ结构域中的氨基酸被认为在蛋白质-蛋白质相互作用中很重要(32)标记为（+），以及ATP中涉及的aa(酒吧)、GMP（*）和Mg2+（o） GUK域中的绑定(26). # 表示假定亮氨酸拉链图案的aa。
aa被认为在PDZ结构域介导的蛋白质-蛋白质相互作用中起作用(32)如图所示。这些aa在ZO-1、ZO-2、ZO-3、TamA和dlg公司-A、 表示共同的功能重要性。然而，18个氨基酸中有8个涉及ATP、GMP和Mg2+酵母鸟苷酸激酶的结合(8,26)ZO-1、ZO-2、ZO-3和TamA中缺失（图。)这使得这些蛋白质中的任何一种都不太可能显示GUK酶活性。ZO-3和ZO-1一样(44)和ZO-2(7,21)，包含GUK域内假定亮氨酸拉链基序中的亮氨酸残基（图。).
除了MAGUK结构域之外，ZO-3与ZO-1和ZO-2在PDZ1和PDZ2之间存在一个碱性结构域，该结构域富含精氨酸残基（ZO-3 pI=11.92，17%arg），并且在GUK区域的COOH末端存在一个酸性结构域（ZO-3pI=3.75）。然而，有几个特征将ZO-3与ZO-1和ZO-2区分开来。ZO-1和ZO-2在分子的COOH末端都含有富含脯氨酸的区域（ZO-1=14%脯氨酸，ZO-2=13%；参考文献21,44). 尽管ZO-3在该区域仅为5%的脯氨酸，但ZO-3的PDZ2和PDZ3之间的联系是独特的，因为它包含14%的脯氨酸残基。此外，尽管ZO-1和ZO-2的3′端都包含交替拼接区域(7,44)，使用MDCK细胞mRNA和从酸性域内到COOH末端附近的引物（引物：正向，核苷酸2633-2652；反向，2861-2841；图。; 数据未显示）。最后，ZO-1、ZO-2和ZO-3所有区域的aa序列比较表明，MAGUK和酸性域的相似性水平通常最高，而大多数连接子区域的保守度较低（表). 这种分析还表明，在几乎所有地区，ZO-1和ZO-2的关系都比ZO-3更密切。
表III
| | ZO-3/ZO-1号机组 | | ZO-3/ZO-2号机组 | | ZO-1/ZO-2 |
|---|
| 起点 | | 80(80) | | 89(89) | | 56(56) |
| PDZ1型 | | 57(72) | | 61(76) | | 71(82) |
| 链接 | | 25(54) | | 27(53) | | 29(53) |
| PDZ2型 | | 50(72) | | 55(74) | | 65(86) |
| 链接 | | 34（46） | | 29(48) | | 39(55) |
| 客运专线3 | | 63(81) | | 59(75) | | 70(86) |
| 链接 | | 53（82） | | 35（65） | | 53(76) |
| 第3页 | | 58(76) | | 59(80) | | 69(85) |
| 链接 | | 55(74) | | 53(76) | | 72(84) |
| GUK公司 | | 52(69) | | 52(71) | | 67(82) |
| 链接 | | 26(42) | | 16(47) | | 47(58) |
| 酸性 | | 43(60) | | 51(61) | | 60(71) |
| 终点 | | 17(41) | | 24（41） | | 25(43) |
ZO-3定位于紧密连接
ZO-3、ZO-1和ZO-2之间的同源性损害了抗ZO-3抗体的产生。注射与低相似度连接子结构域相对应的融合蛋白产生了与ZO-1和/或ZO-2交叉反应的抗体（见图。
c（c）). 为了避免这些困难，我们构建了一个全长ZO-3的cDNA，在COOH末端带有VSV-G细胞质域表位标签。然后将该构建物转染到MDCK细胞中，生成稳定的MDCK/Z3细胞系。用抗-VSV-G抗体对MDCK/Z3细胞的全细胞裂解物进行免疫印迹，结果显示约130kD的外源蛋白表达（图。
一，车道1). 在未转染的亲本细胞系中未检测到这种带（图。
一，车道2)或在单独用载体稳定转染的细胞系中（数据未显示）。来自MDCK/Z3细胞系的高强度抗-VSV-G抗体免疫沉淀同样会产生一种多肽，该多肽与低强度ZO-1免疫沉淀中存在的原始130-kD带的位置大致相同（图。
b条，比较MDCK/Z3车道1带车道LS（负载感应）). 表位标签的额外1338D可以解释MDCK/Z3细胞中外源蛋白分子量稍高的原因。抗VSV-G的亲本细胞系没有免疫沉淀出类似的条带（图。
b条，MDCK/P车道1).
MDCK/Z3细胞系表达约130 kD的外源性蛋白。(一)MDCK/Z3株（lane）全细胞裂解物的免疫印迹1)或母代MDCK细胞（车道2)用抗VSV-G探针检测表位标记的ZO-3结构。反应带仅出现在MDCK/Z3细胞系中，在～130 kD处运行。(b条)代谢标记MDCK细胞中ZO-1的低活性免疫沉淀(LS（负载感应）)显示了ZO-2和ZO-3的共沉淀（另请参见图。). 使用抗VSV-G（lanes）从代谢标记的MDCK/Z3或亲代（MDCK/P）细胞进行高效免疫沉淀1)，防–ZO-2（车道2)或反ZO-1（车道三)证明仅在MDCK/Z3细胞中存在比内源性130-kD带高一部分的带。这种分子量上的微小差异可以通过表位标签的额外1338D来解释。
为了确定ZO-3在上皮细胞中的定位，我们对带有表位标记的ZO-3和内源性ZO-1的MDCK/Z3单层进行了免疫荧光共染色，内源性ZO-1是该细胞类型中广泛使用的紧密连接标志物(6,38,40). 图。表明ZO-3定位于细胞-细胞相互作用的位点，与ZO-1的分布相同。在ZO-3染色的细胞中可以看到细胞质的额外染色（图。
一). 目前尚不清楚这是否是由于外源性过度表达或蛋白质的新分布所致。
MDCK/Z3细胞对ZO-3的免疫荧光共染(一)和ZO-1(b条). ZO-3和ZO-1在细胞边界上分布相同。对于ZO-3，可以看到细胞质的额外染色。棒材，5μm。
使用分离的MDCK/Z3细胞膜制剂的免疫电镜来确定ZO-3和ZO-1的超微结构共定位。先前通过免疫电镜证实ZO-1仅存在于MDCK细胞紧密连接处(38,40). 如图所示。，ZO-1和ZO-3都局限于这些膜中的紧密连接，而所有其他膜，包括其他细胞间连接，都没有标记。
ZO-1（10 nm金）和ZO-3（5 nm金）在MDCK/Z3细胞分离膜上的免疫电镜共定位。(a–c)显示了三种不同的标记图像，显示ZO-3和ZO-1在紧密连接膜接触部位共定位，而所有其他膜，包括桥粒(天)英寸b条，没有标签。棒材，100 nm。
ZO-3直接结合ZO-1和Occludin，但不结合ZO-2
我们在体外结合分析中测试了ZO-3 cDNA是否编码能够与紧密连接的其他蛋白质相互作用的蛋白质。首先，将全长重组ZO-3或阴性对照肽与亲和珠结合。然后将树脂与MDCK细胞膜的高盐提取物孵育，清洗，并将结合蛋白进行SDS-PAGE和免疫印迹与抗-ZO-1或ZO-2抗体。如图所示。
一，ZO-3，但不是对照肽，结合MDCK细胞提取物中的ZO-1和ZO-2。尽管该结果表明存在包含ZO-1、ZO-2和ZO-3的蛋白质复合物，但它并不测试蛋白质之间的直接相互作用。因此，我们使用重组ZO-1、ZO-2和ZO-3进行了直接结合测试。我们还检测了ZO-3和闭塞素COOH末端148 aa之间的直接相互作用，该蛋白的结构域被认为位于细胞质中(14,15). 如图所示。
b条，重组ZO-3在体外特异性结合转录/翻译的ZO-1。ZO-3还直接与闭塞素的细胞质尾部结合（图。
d日). 然而，在我们的分析条件下，未检测到重组ZO-3和ZO-2之间的结合（图。
e（电子）).
讨论
紧密连接的表征进展迅速，并刺激了细胞-细胞相互作用和上皮细胞生物学领域的进展。除了现在在紧密连接处发现的蛋白质列表外，我们还了解到，两个先前表征的紧密连接成分ZO-1和ZO-2是一个更大的蛋白质家族的成员，似乎在细胞表面特定区域的组织中起作用(11,21,23,24,27,41,44). 此外，数据表明该家族的一些成员参与信号转导和/或肿瘤抑制(1,41,46,47)强调了分析这些分子的重要性。
在这里，我们提供了在紧密连接处发现的MAGUK蛋白质家族的一个新成员的证据。这种130kD的多肽由于与ZO-1和ZO-2同源而被命名为ZO-3（图。，表格和)以及紧密接合处的定位（图。和)，包含3个PDZ域、一个SH3域和一个GUK区域（图。). 这些结构域沿分子长度的排列与ZO-1和ZO-2以及果蝇属蛋白质数据链接组-A和塔玛。与ZO-1和ZO-2相同，但与其他MAGUK成员不同，ZO-3在分子的COOH末端包含一个酸性结构域。所有三种蛋白质（以前在ZO-1中未被标记）也包含PDZ1和PDZ2之间的碱性区域。尽管所有三个紧密连接的分子都含有富含脯氨酸的区域，但ZO-1和ZO-2中的那些位于分子的COOH末端，而ZO-3中的那些则位于PDZ2和PDZ3之间。最后，使用来自ZO-3 cDNA 3′端的引物，没有证据表明该区域存在替代剪接位点（数据未显示）。报道了ZO-1和ZO-2的COOH末端区域中的替代剪接区域(7,44).
ZO-3最初是在特定条件下与ZO-1共免疫沉淀的基础上鉴定的，其中一些蛋白质-蛋白质相互作用被保留（参考文献5; 图。). 我们从MDCK细胞中分离并纯化了足够的这种蛋白，用于aa测序和后续克隆。这与用于识别ZO-2的方法类似(21)，尽管我们的任务有些困难，因为在这些条件下共沉淀的130-kD带数量较少（图。). 目前尚不清楚这是否反映了细胞中存在较少的ZO-3或共沉淀效率降低。尽管通过序列分析可以明显地将ZO-3鉴定为另一种MAGUK元素，但由于我们无法生成与ZO-1和/或ZO-2无交叉反应的抗-ZO-3抗血清，蛋白质的继续表征变得复杂（图。
c（c）). 这个问题通过将与ZO-1或ZO-2相似性最低的区域对应的多个融合蛋白注射到各种抗体生成物种中而得以扩展。虽然我们正在努力实现这一目标，但我们构建了一个全长版本的ZO-3，在COOH末端包含一个表位标签。该版本使我们能够通过免疫印迹和免疫沉淀法确定稳定转染该构建物的MDCK细胞在预测的分子量上表达外源蛋白（图。). 此外，这种方法允许我们使用抗表位抗体的免疫组织化学技术定位ZO-3。两种免疫荧光（图。)和免疫电镜（图。)表明ZO-3与ZO-1在紧密结合处共定位。
为了进一步证明ZO-3是一种连接蛋白，并阐明紧密连接处的结合相互作用，我们使用体外亲和力结合分析探索了重组ZO-3和紧密连接蛋白之间的相互作用（图。). 我们的结果表明，ZO-3结合MDCK细胞提取物中的ZO-1和ZO-2（图。
一)根据最初的共免疫沉淀观察结果预测。这表明，当这些蛋白质在不同的蛋白质混合物中以低浓度存在时，我们的ZO-3结构会结合这些蛋白质。然而，这些结果并没有说明ZO-3是直接结合还是通过中间成分结合这两种蛋白质。为此，使用纯化的重组蛋白，我们确定ZO-3直接与ZO-1结合，但不与ZO-2结合。这表明，在MDCK细胞提取物的共沉淀ZO-1/ZO-2/ZO-3复合物中，ZO-2的存在是由于ZO-2和ZO-1或另一未知中间蛋白之间的直接相互作用。然而，应谨慎解释ZO-3和ZO-2之间缺乏约束。重组蛋白表达过程中或结合条件本身发生的错误折叠可能会阻止相互作用的检测。我们还证明了ZO-3直接与闭塞素的胞质148-aa尾部结合。我们的结果，结合之前的研究，表明闭塞素直接与ZO-1相互作用(15)和ZO-3（图。
d日). ZO-2可能通过ZO-1与该复合体结合（5、16、21；图。). ZO-1也直接与AF-6相互作用(47). 目前尚未确定ZO-2是否直接与闭塞素结合，或者AF-6是否与任何其他连接成分相互作用。
关于任何紧密连接蛋白的功能的信息有限。数据明确表明，闭塞素在细胞旁通透性屏障中起作用(6,31,45)正如预期的那样，位于冻裂紧密连接处可见的纤维的跨膜元件(13). 证据还表明，紧密连接处可能存在额外的跨膜成分(6). 紧密连接处发现的外周膜蛋白簇的功能不太明显。肌动蛋白丝在紧密连接处的存在(29)表明其中一些蛋白质可能参与将跨膜元件连接到细胞骨架，最近发表的证据表明ZO-1可能在这方面发挥作用(19). 然而，正是在紧密连接处发现的MAGUK蛋白家族成员，根据本文提供的数据，目前共有三个成员，是当前许多研究的重点。
MAGUK家族的创始成员是致命的（1）盘-大-1(数据链接组)抑癌基因产物(数据链接组-A） 第页，共页果蝇属，并从该基因的遗传分析中获得了信息。GUK域的突变果蝇dlg-导致幼虫影像盘中正常上皮细胞极性丧失和肿瘤过度生长，表明该结构域对正常蛋白功能很重要，并且该蛋白在肿瘤抑制中起作用(46). PDZ、SH3或GUK结构域的突变数据链接组也会破坏神经肌肉接头处的正常突触结构(28)与PDZ结构域结合突触离子通道的证据一致(23,27). 还定义了SH3的结合相互作用(4)和GUK域(24)以及其他地区(19)MAGUK蛋白。总的来说，能够进行特定蛋白质-蛋白质相互作用的多个结构域的存在表明，紧密连接处的MAGUK蛋白质充当质膜细胞质表面的连接分子。
除MAGUK域外，ZO-1、ZO-2和ZO-3还有其他共同和独特的特征（图。). 在紧密连接处存在三种同源蛋白引发了几个问题。这些蛋白质是否具有独特的功能，或者它们的同源性是否表明功能冗余与整体关键作用有关？如果这些蛋白质的功能有独特的方面，则可能属于连接MAGUK结构域或COOH末端尾部的区域，其中它们之间的aa相似性最低（表). 这些分子如果结构改变或消融，是否会导致数据链接组-A？哺乳动物系统的遗传分析，尽管比果蝇属，将很明显具有指导意义。哪些蛋白质结构域负责紧密连接蛋白之间的特异性结合相互作用？几个实验室正在进行这方面的研究，重点显然是紧密连接MAGUK亚家族的PDZ域。最后，这些蛋白质在正常紧密连接门和栅栏生理学中可能发挥什么作用？现在有证据表明，细胞旁通透性与ZO-1的酪氨酸磷酸化有关(36)，但没有关于ZO-1、ZO-2或ZO-3功能的直接信息。尽管紧密连接的分子组成现在已经被了解，但对紧密连接分子生物学的理解仍处于初级阶段。
示意图显示了在紧密连接处发现的三个MAGUK家族成员的域排列。PDZ，斜条纹；SH3，水平条纹；GUK，黑色；基本域，点（+）；酸性域，水平虚线（−）；富含脯氨酸的波浪状水平线，交替拼接，α（ZO-1）和β（ZO-2）。
致谢
我们感谢詹姆斯·安德森（James Anderson）、霍尼·陈（Honey Chan）、阿兰·范宁（Alan Fanning）、乔·费尔南德斯（Joe Fernandez）、丹·古德努（Dan Goodenough）、汤姆·霍布曼（Tom Hobman）、林恩·耶赛提斯（Lynne Jesaitis）、布里吉特·基恩（Brigitte Keon）、卡罗琳·马查默（Carolyn Machamer）、希娜·米奇（Sh。
本文中使用的缩写
| 美国 | 氨基酸 |
| GUK公司 | 鸟苷酸激酶 |
| 聚偏氟乙烯 | 聚偏二氟乙烯 |
| 第3页 |
型钢混凝土同源性 |
| VSV-G型 | 水疱性口炎病毒G蛋白 |
脚注
洛克菲勒大学蛋白质测序设施部分由美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）共享仪器拨款以及美国陆军和海军提供的用于购买设备的资金支持。这项工作得到了加拿大医学研究委员会和加拿大肾脏基金会向B.R.Stevenson提供的经营资助。B.R.史蒂文森是艾伯塔省传统医学研究基金会的高级学者。
工具书类
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