磷脂酰肌醇3-激酶和胰岛素受体底物-1在脂肪细胞中的细胞内定位：膜骨架的潜在参与

抗体

本研究中使用的抗体来自以下来源：B.Druker（俄勒冈州波特兰俄勒冈健康科学大学）的抗磷酸酪氨酸抗体（4G10）；来自G.Lienhard（英国达特茅斯达特茅思大学）的抗IRS-1多克隆抗体；抗Grb2多克隆抗体圣克鲁斯生物技术公司。（加利福尼亚州圣克鲁斯）；来自D.Bowtel的抗mSos多克隆抗体（澳大利亚墨尔本Peter MacCallum癌症研究所）；来自M.Robinson（英国剑桥大学）的抗γ-适应素多克隆抗体；抗Shc和抗p85^聚丙烯腈多克隆抗体来自Upstate Biotechnology Inc.。GLUT4抗体（R820）已在前面详细描述(James等人，1989年).

细胞培养

3T3-L1成纤维细胞在补充有10%新生小牛血清、L-谷氨酰胺（2 mM）、青霉素（50 U/ml）和硫酸链霉素（50 mg/ml）的DME中培养。如前所述，细胞生长汇合并分化形成脂肪细胞(Piper等人，1991年). 分化后10–20天常规使用脂肪细胞。实验前，3T3-L1脂肪细胞在Krebs-Ringer磷酸盐溶液（2.5 mM Hepes，pH 7.4，120 mM NaCl，6 mM KCl，1.2 mM MgSO）中培养₄，10 mM氯化钙₂，0.4 mM NaH₂人事军官₄，0.6 mM钠₂高性能操作₄)，在37°C下用2%BSA补充2小时以建立基础条件。

CHO细胞，过度表达胰岛素受体（IR）和IRS-1（CHO/IR/IRS-1）；Sun等人，1992年)是M.White（哈佛大学，马萨诸塞州剑桥）慷慨赠送的礼物。CHO/IR/IRS-1细胞常规培养于含有10%FCS、L-谷氨酰胺（2 mM）、青霉素（50 U/ml）和补充有基因素（0.8 mg/ml）的硫酸链霉素（50 mg/ml）。实验前，汇合的CHO/IR/IRS-1细胞在37°C的无添加剂二甲醚中培养2小时，达到基本条件。

细胞渗透性

在一些实验中，通过用细菌内毒素SLO处理细胞，使在100mm培养皿中培养的细胞透化。初步实验确定，促进100%CHO细胞和脂肪细胞细胞核碘化丙啶染色所需的SLO浓度分别为0.5μg/ml和2.0μg/ml。在渗透之前，将细胞置于上述基本条件下，并在预冷的细胞内（IC）缓冲液中清洗一次（20 mM Hepes，pH 7.2，140 mM谷氨酸钾，5 mM EGTA，5 mM-MgCl，5 mM/NaCl）。为了促进SLO与细胞表面的结合，在4°C的2 ml IC缓冲液中用适当浓度的SLO培养细胞5分钟，然后用冷IC缓冲液清洗一次。通过在含有1 mg/ml BSA、1 mM二硫苏糖醇和ATP再生系统（40 IU肌酸激酶、5 mM磷酸肌酸和1 mM ATP）的2 ml IC缓冲液中孵育细胞15分钟，在37°C下启动细胞的通透性。随后对细胞进行清洗，获得如下所述的亚细胞组分。

3T3-L1脂肪细胞的亚细胞分离

从35 mm组织培养皿中培养的3T3-L1脂肪细胞制备全细胞裂解物。生长因子处理后，细胞在冰冷的PBS中漂洗两次（137 mM NaCl，2.7 mM KCl，1.5 mM KH₂人事军官₄，1.5 mM千赫₂人事军官₄，8 mM钠₂高性能操作₄pH值为7.4）。将洗涤过的细胞冷冻在液体N中₂，并在−70°C下储存。在分析之前，将冷冻细胞单层刮入500μl含有磷酸酶抑制剂（2 mM原钒酸钠、10 mM氟化钠、1 mM氯化钠）的冰冷裂解缓冲液A（20 mM Tris，pH 7.5，1 mM EDTA、137 mM NaCl、10%甘油、1%NP-40、1 mM-PMSF）中四分之一-焦磷酸钠和1 mM钼酸铵），并在4°C下混合15分钟。细胞裂解物在12500℃离心克在微型离心机中(贝克曼仪器公司。（加利福尼亚州帕洛阿尔托市），在4°C下保持15分钟，通过0.45-μm过滤装置过滤，所得上清液清除脂肪颗粒(Millipore公司。马萨诸塞州贝德福德）。

亚细胞组分由3T3-L1脂肪细胞制备，如前所述，在100 mm组织培养板中培养(Piper等人，1991年)，稍作修改。生长因子处理后，在冰冷TES中快速冲洗细胞（20 mM Tris，pH 7.4，5 mM EDTA，250 mM蔗糖），然后在含有蛋白酶抑制剂（10μg/ml抑肽酶，10μg/ml亮氨酸蛋白酶，250μM PMSF）和磷酸酶抑制剂的冰冷TES中收获细胞，如上所述。通过圆柱形细胞均质器（加利福尼亚州红木市H和Y企业）将悬浮液均质10道，并通过顺序差速离心步骤制备亚细胞组分。简单地说，匀浆在13000进行离心克在4°C下使用SS-34转子（Sorvall Instruments Division，Newton，CT）20分钟。将所得颗粒清洗并重新悬浮在1 ml TES中，分层在1.12 M蔗糖垫上，并在77000下离心克使用SW-41转子1小时(贝克曼仪器公司。)获取PM。13000克上清液以30000离心克使用SS-34 Rotor（Sorvall Instruments Division）30分钟，获得指定为颗粒的高密度微粒体（HDM）。通过0.45-μm过滤器过滤，清除上清液中残留的脂肪颗粒(Millipore公司。)175000离心克使用Ti-80转子(贝克曼仪器公司。)以获得上清液、指定的胞质溶胶（CYT）和高速沉淀（HSP）。在以前的研究中，这种颗粒被称为低密度微粒体部分(Piper等人，1991年). 然而，本文所述的研究表明，该组分中的大部分蛋白质与微粒体膜没有直接关联，在这种情况下，HSP是一个更合适的名称。

在一些实验中，使用PM草坪技术评估了生长因子对GLUT4亚细胞分布的影响(Robinson等人，1992年). 简言之，在盖玻片上培养的脂肪细胞经过添加或不添加生长因子的处理，然后进行超声波处理，以去除大部分细胞成分，但仍附着于盖玻片的质膜碎片除外。然后在GLUT4特异性抗血清中孵育盖玻片，然后用FITC-结合二级抗体进行第二次孵育。使用轴镜荧光显微镜通过荧光显微镜观察免疫标记(蔡司（德国奥伯科钦）。

CHO细胞的亚细胞分级

使用简化的差速离心程序从CHO/IR/IRS-1细胞中获得亚细胞组分。未经处理或胰岛素处理的细胞在预冷分馏缓冲液中洗涤两次（HES:20 mM Hepes，pH 7.4，1 mM EDTA，250 mM蔗糖），并在HES中用特氟隆均质器进行15次均质，补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂。然后在15000下对匀浆进行离心克使用SS-34转子在4°C下保持15分钟（索瓦尔仪器公司）。15000人克上清液在175000下离心克使用Ti-80转子在4°C下保持1小时15分钟(贝克曼仪器公司。)产生指定为HSP的颗粒和指定为CYT的上清液。对部分进行免疫印迹或速度沉淀分析，如下所述。

免疫沉淀和PI 3-激酶测定

从处理过的细胞制备的全细胞裂解物（500μg）、亚细胞膜组分（25-100μg蛋白质）和CYT（200μg蛋白质。免疫沉淀2–4小时，或在4°C下过夜。通过13000离心收集免疫沉淀复合物克持续10秒，然后依次在1%NP-40中的PBS中清洗，pH值7.4，50 mM LiCl中的100 mM Tris，pH值7.5，然后在100 mM NaCl中清洗两次，100 mM Tris中的pH值7.5。在一些实验中，在最后一次清洗过程中去除了一小份免疫复合物，并保留用于蛋白质印迹分析。如前所述，对其余免疫复合物进行PI 3-激酶活性分析(Hara等人，1994年)以磷脂酰肌醇为底物。将反应产物点在涂有二氧化硅-60的板（Merck，Darmstadt，Germany）上，并进行TLC。放射性标记磷脂产品通过放射自显影术进行可视化，然后从硅胶板上切下并通过闪烁计数进行定量（Packard 1900CA；帕卡德仪器公司。伊利诺伊州唐纳斯·格罗夫公司）。放射性标记的磷脂酰肌醇3-磷酸（PIP）是根据其在沃特曼处理的细胞中的消失而确定的（数据未显示）。

免疫印迹法

蛋白质经过SDS-PAGE并转移到Immobilon-P PVDF膜(Millipore公司。). 将膜与5%脱脂奶粉或3%BSA在TBST中孵育（20mM Tris，pH 7.6，150mM NaCl，0.05%吐温-20），随后与第一抗体孵育，洗涤并与适当的辣根过氧化物酶连接的第二抗体孵育(阿默沙姆国际，英国Little Chalfont）在室温下放置1小时。为了可视化免疫反应蛋白，用增强化学发光底物培养细胞膜(阿默沙姆国际）或Supersignal（Pierce），并通过将每个膜暴露在胶片上进行放射自显影（X-OMAT；日本东京富士）。

洗涤剂或离子缓冲液处理3T3-L1脂肪细胞HSP组分

HSP部分由未经处理和胰岛素处理的3T3-L1脂肪细胞在含有上述蛋白酶和磷酸酶抑制剂的分馏缓冲液（20 mM Hepes，pH 7.4，1 mM EDTA，250 mM蔗糖；HES）中制备，并分为五等分体积。将等分样品放在冰上培养1小时，使用以下五种溶液中的每一种溶液，得到最终的洗涤剂或NaCl浓度，如图所示：仅HES，pH 7.4；1%Triton®声波风廓线仪X-100（T_x个-100）在HES中，pH值为7.4；在HES中的60mMβ-辛基葡糖苷，pH 7.4；HES中的1 M NaCl，pH 7.4；HES中0.5 M NaCl，pH 7.4。每次处理产生的热休克蛋白的不溶性成分通过175000离心造粒克，使用TLA 100.3转子(贝克曼仪器公司。)在4°C下保持1 h 15 min。在Western blotting分析之前，用Laemmli样品缓冲液溶解所得颗粒，并在−20°C下储存过夜。

还使用稍微修改的程序制备了经洗涤剂处理的热休克蛋白，用于电子显微镜分析。30000人克上清液是通过上述亚细胞分离方法从未经处理或胰岛素刺激的脂肪细胞中获得的。将等分上清液与等量的分馏缓冲液或含2%T的分馏-缓冲液混合_x个-100，在冰上孵育1小时。如上所述，通过离心法收集不溶性成分。免疫印迹显示，无论使用何种方法，HSP的洗涤剂不溶性成分中都存在相关蛋白质（数据未显示）。

蔗糖梯度分馏

在浮选和速度沉降分析中，梯度或蔗糖层是使用冷冻蔗糖原液在含有磷酸酶和蛋白酶抑制剂的缓冲液（20 mM Hepes，pH 7.4，1 mM EDTA）中制备的，如上所述。所有蔗糖浓度均以百分比（wt/vol）表示。为了进行浮选分析，将未经处理或胰岛素处理的细胞制备的热休克蛋白重新悬浮在200μl HES中。将等分的再悬浮膜（165μl）与835μl 70%蔗糖溶液混合，得到最终浓度为60%的蔗糖。然后依次用1 ml 50%蔗糖、1 ml 30%蔗糖、1 ml10%蔗糖和400μl 5%蔗糖覆盖，得到4.4 ml的最终体积。离心梯度（90000克持续18小时），在4°C下使用SW60转子(贝克曼仪器公司。). 通过用27英寸量规针刺穿每根管子的底部，收集梯度部分（400μl）。将颗粒重新悬浮在400μl HES或裂解缓冲液中（视情况而定）。然后对每个组分的等分样品进行免疫印迹（25μl）或免疫沉淀和PI 3-激酶分析（100μl）。

在连续（5–30%）蔗糖梯度（4.2 ml）下对热休克蛋白部分进行速度沉降分析。HSP部分由未经处理或胰岛素处理的细胞制备而成，并重新悬浮在20 mM Hepes和1 mM EDTA的5%蔗糖中，并在梯度顶部分层。梯度离心（90000克90分钟），使用SW60转子(贝克曼仪器公司。). 如上所述收集每个梯度的部分，并对等分（25μl）进行免疫印迹。对于电子显微镜，将感兴趣的组分混合并在缓冲液中稀释，补充蛋白酶和磷酸酶抑制剂，以得到最终浓度为250 mM（等渗）的蔗糖。然后在175000下对每个样品进行离心克使用TLA 100.3转子(贝克曼仪器公司。)在4°C下放置1 h 15 min。制备从该离心获得的颗粒用于电子显微镜。

胰岛素与PDGF作用下PI3-激酶的差异定位

为了研究胰岛素和PDGF对PI 3-激酶细胞内定位的影响，使用3T3-L1脂肪细胞进行了一系列亚细胞分离研究。脂肪细胞为这些研究提供了一个有用的模型系统，因为使用差速离心建立了一个相对简单的分馏程序，可以分离富含PM特异标记物的组分；线粒体/细胞核（M/N）；内体和内质网（HDM）；以及细胞内膜，其包含再循环内体、高尔基体和细胞内GLUT4储存囊泡（HSP；Simpson等人，1983年;James和Pilch，1988年;Piper等人，1991年;Martin等人，1996年). 上清液中含有所有在175000℃时不会沉淀的元素克并被指定为CYT。在大多数研究中，M/N部分被排除在分析之外，因为初步实验表明，该部分中不存在显著水平的相关信号分子。

在从与胰岛素或PDGF孵育的细胞亚细胞部分获得的抗pY免疫复合物中测量PI 3-激酶活性（图。​（图3三 A类). 在基础状态下，磷酸酪氨酸免疫沉淀PI 3-激酶活性主要位于胞浆中。作为对胰岛素的反应，在HSP中检测到PI 3-激酶活性的最大增加（与基础组相比，增加了9-11倍，n个=3），该组分包含细胞总PI3-激酶活性的最大比例（53%；图。​图3三 C类). 胰岛素还导致CYT、HDM和PM组分中的PI 3-激酶活性轻微但显著增加。对于PDGF的反应，PI 3-激酶的分布与胰岛素的分布显著不同。在PM中发现PDGF刺激的PI 3-激酶活性占主导地位（与基础的、，n个=3）该组分还含有PDGF反应中检测到的细胞总PI3-激酶活性的大多数（56%）。PDGF也诱导HDM显著增加，但对胞浆或HSP中的PI3-激酶活性没有显著影响。总的来说，这些变化与抗磷酸酪氨酸免疫沉淀p85的分布平行（图。​（图3三 B类).

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图3

胰岛素和PDGF对PI3-激酶活性亚细胞分布的影响。将脂肪细胞置于基础状态并与胰岛素孵育(我)或PDGF(P（P）)或不添加(C类). 然后将细胞均质并进行差速离心，以获得富含质膜的组分(颗粒物)内质网和内质体标记物(高密度密度聚乙烯)，胞浆(中青旅)和高速颗粒分数(热休克蛋白). 每个分数的等分(颗粒物25微克；热休克蛋白100微克；HDM公司75微克；细胞色素氧化酶200μg）分别代表整个细胞中这些组分的平均3/5、2/5、3/5和1/20，使用抗磷酸酪氨酸抗体进行免疫沉淀(抗pY). 然后使用免疫沉淀物测量(A类)PI 3-激酶活性，或(B类)使用多克隆抗p85的免疫反应性p85^聚丙烯腈抗体。PI3-激酶活性在亚细胞组分中分布的定量如所示(C类). 胰岛素各部分中的总PI 3-激酶活性(▪), 与PDGF（□）相比，计算处理细胞，并在减去基础值后表示为总细胞的百分比。显示了三个独立实验的平均值（±SEM）。项目实施计划，磷脂酰肌醇3′-磷酸。

鉴于上述测量是在抗pY免疫沉淀物上进行的，我们无法确定这些测量是否真正反映了PI 3-激酶在脂肪细胞中的分布。为了解决这个问题，用抗p85（抗p85）抗体的免疫印迹法分析了PI 3-激酶p85亚单位的分布^聚丙烯腈). 脂肪细胞中持续标记此抗体的优势带在SDS-PAGE中的平均迁移率为85 kD（图。​（图44 A类). 然而，常规观察到与～100、45和55 kD相对应的其他平均迁移率带。后两条带可能与之前报道的该酶的亚型或剪接变异体相对应，该酶已被证明与这些研究中使用的p85抗体发生交叉反应(Inukai等人，1997年). 在缺乏激素的情况下，大多数免疫反应性p85存在于胞浆和HSP中。胰岛素使热休克蛋白组分中的免疫反应性p85增加了两到三倍，与细胞溶质减少和颗粒物变化相对较小相当。PDGF使颗粒物中的免疫活性p85增加五倍，热休克蛋白或细胞溶质均无变化。免疫反应性p85在胰岛素和PDGF处理的不同细胞组分中的差异分布与在抗pY免疫复合物中观察到的相似（图。​（图3三 B类). 我们没有观察到p45或p55免疫反应性物种的分布有任何显著变化，这表明这些蛋白质对这些生长因子没有反应。p55带在PM中富集，而p45在胞浆中富集（图。​（图44 A类).

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图4

胰岛素与PDGF对3T3-L1脂肪细胞中PI3-激酶和酪氨酸磷酸化蛋白亚细胞分布的影响。脂肪细胞被带到基底部并与胰岛素孵育(我)，或PDGF(P（P）)，或不添加(C类). 将细胞清洗、均质并制备亚细胞组分。用SDS-PAGE分析每一组分（25μg蛋白质）的等分样品，并用特异性抗体进行免疫印迹(A类)PI 3-激酶的p85亚单位(抗p85^聚丙烯腈)或(B类)磷酸酪氨酸(抗pY). 使用胰岛素或PDGF的HDM中p85的分布没有显著变化（未显示）。使用此程序（未显示）无法在胞浆中检测到酪氨酸磷酸化。结果代表了两个实验。

在胰岛素反应中观察到的酪氨酸磷酸化蛋白的分布和亚细胞分布与在PDGF反应中观察的明显不同（图。​（图44 B类). 与先前的研究一致，酪氨酸磷酸化IRS-1（180 kD）在HSP中富集(凯利和鲁德曼，1993年;Heller-Harrison等人，1995年). HSP中还检测到分子质量范围为50–150 kD的其他几种胰岛素调节酪氨酸磷酸蛋白。95-kD物种可能对应于IRβ亚基。与之前的研究一致，这种蛋白质在PM中高度富集(Kublaoui等人，1995年). HSP中其他胰岛素调节的磷酸酪氨酸蛋白的身份尚不清楚。胰岛素还刺激PM中分子量为60和53kD的蛋白质的酪氨酸磷酸化，这可能与p60（IRS-3；Lavan等人，1997年)以及最近发现的另一种胰岛素受体酪氨酸激酶底物p53/p58(Yeh等人，1996年)分别是。在PDGF处理的细胞中没有观察到这些胰岛素刺激的磷酸酪氨酸蛋白（图。​（图44 B类). PDGF处理细胞中观察到的主要磷酸酪氨酸蛋白（195 kD）在PM和HDM中富集，并且与免疫反应性小鼠PDGF受体具有相同的电泳迁移率（数据未显示）。

IRS-1、Grb2、mSos和Shc的亚细胞分布

如上所述，PI3-激酶和酪氨酸磷酸化的IRS-1在从脂肪细胞分离的HSP部分中富集，这与先前的研究一致(凯利和鲁德曼，1993年;Heller-Harrison等人，1995年;Kublaoui等人，1995年). 如图所示。​图5，5，免疫反应性IRS-1也在该组分中富集。值得注意的是，IRS-1抗体标记了平均迁移率为165和120 kD的热休克蛋白中的两种蛋白质。这两条带中的上部具有对应于IRS-1的相对分子质量，并且响应于胰岛素而经历分子质量从165 kD到180kD的明显转变。以前有文献证明IRS-1在磷酸化后发生凝胶移位(Sun等人，1992年). 较低的条带可能代表与抗体交叉反应的无关蛋白质，而不是IRS-1降解，因为我们没有观察到凝胶这一区域蛋白质的酪氨酸磷酸化的任何证据（图。​（图44 B类). 在一些实验中，胰岛素导致IRS-1从HSP部分重新分布到胞浆，这与以前的研究一致(Heller-Harrison等人，1995年). 推测，胰岛素诱导的IRS-1向胞浆的再分配解释了胰岛素处理细胞胞浆部分中检测到的磷酸酪氨酸免疫沉淀PI 3-激酶活性，如上图所示（图。​（图3，三,A类和C类). 我们没有观察到PDGF治疗后IRS-1的亚细胞分布有任何显著变化（数据未显示）。

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图5

基础和胰岛素处理条件下脂肪细胞中IRS-1、Grb2、mSos和Shc亚型的亚细胞分布。将脂肪细胞置于基础状态，并在37°C下，在缺少（−）或存在（+）胰岛素（1μM）的情况下培养15分钟。对细胞进行洗涤、匀浆并制备亚细胞级分。每部分（25μg蛋白质）的等分样品，质膜(颗粒物)，胞浆(中青旅)，高速颗粒(热休克蛋白)和高密度微粒体(HDM公司)通过SDS-PAGE分析组分，并分别用IRS-1、Grb2、mSos或Shc特异性抗体进行免疫印迹。所示结果代表了两个独立的实验。

众所周知，胰岛素可以激活脂肪细胞中的许多信号分子。其中包括Grb2，另一种含有SH2结构域的蛋白质，据报道与IRS-1结合以响应胰岛素(Sun等人，1993年) ; mSOS，一种Grb2结合蛋白(Baltensperger等人，1993年)作为p21 Ras的GTP交换因子；和Shc，另一种胰岛素调节对接蛋白(Skolnik等人，1993年). 接下来，我们检查了这些蛋白质在脂肪细胞中的分布，以确定IRS-1和PI 3-激酶对HSP部分的定位是特异性的还是反映了信号蛋白的一般仓库（图。​（图5）。5). 为了支持前者，除了一种Shc亚型外，这些蛋白质中没有一种在HSP组分中富集。Grb2存在于3T3-L1脂肪细胞的所有亚细胞组分中，但在PM中特别富集。作为对胰岛素的响应，PM和HSP组分中Grb2的水平显著增加，可能是因为它与酪氨酸磷酸化p60（IRS-3）和IRS-1相互作用，而这些组分在每个组分中都富集，分别（图。​（图44 B类). mSOS在胞浆中高度富集，在胰岛素刺激下亚细胞分布没有发生变化。因此，除非在分离这些组分的过程中mSos与Grb2分离，否则Grb2似乎必须与脂肪细胞中除mSos以外的其他蛋白质结合，从而可能将独特的信号蛋白招募到PM或HSP组分。

Shc的亚细胞分布特别有趣，因为该分子编码与IRS-1相似的功能，充当下游信号蛋白的对接蛋白(Skolnik等人，1993年). 此外，已经报道了三种不同的Shc亚型，其各自的功能仍有待阐明(Pelicci等人，1992年). 三种亚型均在3T3-L1脂肪细胞中检测到（图。​（图5）5)有趣的是，每一种的亚细胞分布完全不同。66-kD亚型在HDM中富集，PM中的含量也较低。46-kD异构体在PM中高度富集（图。​（图5）5)和M/N（数据未显示），而52-kD亚型分布更广，大多数位于细胞质和热休克蛋白中。胰岛素对任何Shc亚型的亚细胞分布没有显著影响。这些数据清楚地表明，信号蛋白在脂肪细胞中具有广泛不同的亚细胞分布，这可能对其生物作用的特异性具有重要意义。此外，Grb2、mSos和Shc的分布与IRS-1的分布不平行。这意味着IRS-1必须通过与另一种蛋白质或膜的特定结合维持在这个位置。

洗涤剂和高离子强度对IRS-1和PI3-激酶溶解性的影响

为了进一步确定IRS-1和PI3-激酶与HSP相互作用的性质，我们检测了高离子强度和不同洗涤剂对这些蛋白质溶解度的影响（图。​（图6）。6). 免疫反应性IRS-1、酪氨酸磷酸化IRS-1和PI 3-激酶在两种非离子洗涤剂T的存在下基本上不溶_x个-100和β-辛基葡萄糖苷（β-OG）。在完全相同的条件下，多面体膜蛋白GLUT4完全溶解。相反，变性洗涤剂（如SDS）可完全溶解IRS-1和PI 3-激酶（数据未显示）。有人认为，特殊的小泡隔室，包括涂有甲氰菊酯的小泡和小泡，在某些洗涤剂中仍然不溶(皮尔斯，1982年;Kurchalia等人，1992年). 在这方面，有趣的是，氯氰菊酯包衣囊泡的γ-适应素亚基在很大程度上也不溶于T_x个-100和β-OG（图。​（图6）。6). 然而，如图。​图7，7，该组分中的大部分γ-adaptin与膜无关，因此这可能代表可以沉淀的预组装适配器复合体。含有IRS-1和PI 3-激酶的洗涤剂不溶性部分不太可能代表小窝，因为这些细胞器通常在非离子洗涤剂β-OG中很容易溶解(Brown and Rose，1992年). 此外，我们已经证明，小窝蛋白是小窝的主要成分，在我们的热休克蛋白组分中并不富集，但仍然附着在质膜上。此外，HSP中发现的少量小窝蛋白被1%T大量溶解_x个-100（Hill，M.，S.Clark，D.James，提交出版的手稿）。在高离子强度的情况下，IRS-1和PI 3-激酶都被完全溶解，这表明这些蛋白质通过离子相互作用保留在HSP组分中（图。​（图6）。6).

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图6

非离子洗涤剂和高离子强度对脂肪细胞高速颗粒（HSP）组分的影响。将脂肪细胞置于基础状态，在没有或存在胰岛素（1μM）的情况下培养，然后进行差速离心以产生HSP部分。HSP在缓冲液（Hepes，pH 7.4，1 mM EDTA，250 mM蔗糖）或含有1%Triton X-100的相同缓冲液中培养(T型_x个-100)，60 mMβ-辛基葡萄糖苷(β-OG)，1.0 M NaCl或0.5 M NaCl.，在4°C下放置1 h，然后在175000下进行离心g。用SDS-PAGE分析所得微丸，并用IRS-1、磷酸酪氨酸特异性抗体进行免疫印迹(抗pY)，PI 3-激酶(抗p85^聚丙烯腈)GLUT4和γ-adaptin。结果代表了三个独立的实验。

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图7

脂肪细胞制备的高速颗粒（HSP）组分的浮选分析。未经处理的HSP亚细胞部分（A）)或胰岛素治疗(B类和C类)制备脂肪细胞并将其重新悬浮在最终体积为1 ml的含60%蔗糖的缓冲液（Hepes，pH 7.4，1 mM EDTA）中。该部分依次覆盖有含50%、30%和10%蔗糖的缓冲溶液（1 ml）和含5%蔗糖的400μl缓冲液。然后在90000下离心蔗糖梯度克持续18小时。从底部收集馏分（400μl）(1–11)重力梯度和颗粒(P（P）)在400μl缓冲液中溶解。每一组分的等分样品用于测量总蛋白含量或用IRS-1、磷酸酪氨酸特异性抗体进行免疫印迹(抗pY)PI 3-激酶(抗p85^聚丙烯腈)或GLUT4。(C类)用抗磷酸酪氨酸抗体免疫沉淀每个组分（100μl）的等分样品，并检测PI 3-激酶活性。每个免疫沉淀物中存在的放射性标记产物PIP通过TLC进行解析(插入)通过闪烁计数进行量化。显示的结果描述了从颗粒免疫沉淀的PI3-激酶活性的百分比(P（P）)和分数(1–7)相对于整个梯度中的总活性。组分8–11的免疫沉淀物在整个梯度中的PI 3-激酶总活性小于1%，未显示。结果代表了两个独立的实验。

PI 3-激酶-IRS-1复合物与脂肪细胞HSP内的膜无关

基于其对各种非离子洗涤剂溶解的耐受性，已经描述了专门的脂质微域(Simons和Ikonen，1997年). 这些结构域可富集在某些膜脂中，例如赋予洗涤剂不溶性的糖脂。除了洗涤剂不溶性外，定义这些结构类型的特征之一是它们在高渗蔗糖中的浮力，这是由于脂质的存在(Brown and Rose，1992年). 相反，蛋白质复合物和细胞骨架元素不具有这种特性(Fra等人，1994年). 为了确定IRS-1和PI 3-激酶是否定位于特定的脂质微结构域，将HSP部分加载在不连续蔗糖梯度的底部，并离心18 h（图。​（图7）。7). 利用这种方法将热休克蛋白分解为两个单独的蛋白质峰。含约65%HSP蛋白的主峰（峰1）仍位于60%蔗糖组分梯度的底部。第二个峰（峰2）含有～33%的HSP蛋白，位于对应于30/50%蔗糖界面的梯度中间。当从基础细胞和胰岛素处理的细胞中收获HSP组分时，峰1和2中蛋白质的分布和回收没有显著差异（图。​（图7，7,A类和B类). IRS-1和PI 3激酶仅在基底细胞和胰岛素处理细胞的峰1中发现。值得注意的是，在这些研究中，我们观察到HSP部分IRS-1的胰岛素依赖性丢失，这可能是由于该蛋白重新分布到胞浆所致（图。​（图55和​和6）。6). 与上述研究一致（图。​（图4），4)胰岛素的IRS-1酪氨酸磷酸化显著增加，与HSP相关的PI3-激酶增加。然而，胰岛素的这些作用仅在峰1处观察到，这表明IRS-1和PI3-激酶均与脂质结构域无关。作为浮选分析的对照，我们还用GLUT4特异性抗体免疫印迹每个组分。正如预期的那样，含GLUT4的膜定量地漂浮到梯度中的一个位置，对应于峰值2，与这些膜的浮力密度成比例。此外，值得注意的是，胰岛素处理细胞在峰2中恢复的GLUT4数量显著低于基底细胞，这与它从热休克蛋白向质膜的移动一致（见图。​图1）。1). 这表明峰2含有胰岛素调节的GLUT4储存囊泡。用γ-适应素特异性抗体对部分组分进行免疫印迹。虽然该蛋白的大部分仍位于峰1中，可能代表预先形成的适配器复合物，但在峰2中也发现了大量。因此，这表明热休克蛋白含有被包裹的囊泡，这些囊泡在分馏过程中保持完整。M的酪氨酸磷酸化蛋白_第页从胰岛素处理细胞分离的峰2中也检测到95 kD，可能与IR的β亚单位相对应（图。​（图77 B类).

这些研究表明，我们已经能够将热休克蛋白分离为对应于峰1和峰2的两个不同部分。峰1包含大多数蛋白质以及IRS-1和PI3-激酶，而峰2包含膜和小泡，这是通过GLUT4、IR和γ-适应蛋白的存在来确定的。为了排除免疫印迹检测不到的少量IRS-1或PI 3-激酶可能仍与峰2中的膜相关的可能性，我们还从浮选梯度测量了每个组分的磷酸酪氨酸免疫沉淀物中的PI 3-激酶活性。这种检测比印迹法灵敏得多，应该可以提供这种蛋白质分布的更定量测量。与免疫反应性p85的分布一致（图。​（图77 B类)胰岛素刺激的PI 3-激酶活性的大部分（95%）在峰1中恢复，峰2中的活性与背景没有显著差异（图。​（图77 C类). 因此，这些数据表明PI 3-激酶与HSP内的膜无关。

一种可能性是，IRS-1和PI 3-激酶复合物可能在浮选分析过程中从膜上分离，因此作为游离蛋白留在梯度的底部。如果是这样的话，预计这些蛋白质现在将表现为胞质蛋白质，而不是在最初用于产生该部分的条件下沉淀。为了解决这一可能性，用缓冲液稀释组成浮选梯度峰1的60%蔗糖组分（F1和F2），以达到等渗蔗糖浓度并重新沉淀。如图所示。​图8，8，从这两个组分的颗粒（P1和P2）中回收了大量IRS-1和PI 3-激酶。因此，这些数据表明IRS-1和PI 3-激酶与热休克蛋白组分中的膜无关，并且它们在该组分中存在一定程度上反映了与其他蛋白质的相互作用，从而使它们不溶于洗涤剂。

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图8

蔗糖梯度离心后IRS-1和PI 3-激酶的再沉积。如图所示，对来自胰岛素处理细胞的HSP部分进行浮选分析。​图7。7分数1(一层楼)和2(地上二层)用缓冲液（20mM Hepes，pH 7.4，1mM EDTA）等渗，并在175000下离心克1小时15分钟。相应的颗粒(第1页和第2页)以及等量的起始分数(一层楼和地上二层)，进行SDS-PAGE并用IRS-1和PI 3-激酶的特异性抗体进行免疫印迹(抗p85^聚丙烯腈). 使用从基底细胞分离的热休克蛋白也获得了相同的结果，但未显示。

热休克蛋白的速度沉积分析

为了进一步表征脂肪细胞中IRS-1–PI 3-激酶复合物的性质，我们接下来对HSP进行速度沉降分析。该程序根据尺寸而非密度分离颗粒。在这些条件下，热休克蛋白中的大多数蛋白质（68%）保持在梯度的顶部（分数8–10），与浮选分析一致，该峰包含大多数IRS-1、酪氨酸磷酸化IRS-1和PI 3-激酶（图。​（图9，9,A类和B类). 胰岛素刺激并没有显著改变总蛋白和IRS-1的速度沉积曲线（图。​（图99 B类). 然而，我们再次观察到HSP中IRS-1的胰岛素依赖性丢失，这可能是由于该蛋白重新分布到胞浆所致（图。​（图7，7,A类和B类). HSP中PI3-激酶的胰岛素刺激增加与酪氨酸磷酸化IRS-1池共同作用。HSP中的大多数（>80%）免疫反应性GLUT4沉淀在梯度的区域（第2-7部分），这些区域不含IRS-1和PI 3-激酶。GLUT4峰和IRS-1–PI 3-激酶峰之间有轻微重叠。然而，鉴于上述浮选研究，这几乎肯定与该技术的有限分辨率相对应，并不反映这些蛋白质的共定位。因此，使用该技术，保留在速度梯度上部的IRS-1和PI3-激酶似乎与沉积到梯度更深的膜无关。

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图9

3T3-L1脂肪细胞热休克蛋白沉积速度分析。从基底细胞获得的热休克蛋白分数(A类)，或胰岛素处理的脂肪细胞(B类)将其重新悬浮在含有5%蔗糖的缓冲液（20 mM Hepes，pH 7.4，1 mM EDTA，200μl）中，并覆盖到5–30%的连续蔗糖梯度上。梯度在90000下离心克90分钟，从底部收集馏分（400μl）(1–11)重力作用下的每个梯度。对每个组分的等分样品进行蛋白质含量分析，或通过SDS-PAGE（30μl）进行解析，并使用IRS-1、磷酸酪氨酸特异性抗体进行免疫印迹(抗pY)，PI 3-激酶(抗p85^聚丙烯腈)，和GLUT4。结果代表了两个独立的实验。

IRS-1和PI 3-激酶在其他细胞类型中具有类似的特性

IRS-1在胰岛素敏感性细胞类型中高水平表达，包括脂肪细胞和心肌细胞(怀特，1994年). 为了确定IRS-1和PI 3-激酶与不溶性蛋白颗粒的结合是否只是这些细胞类型的一个特征，我们在CHO细胞中进行了与上述类似的实验。CHO细胞通常不表达显著水平的IR或IRS-1，这在一定程度上解释了其缺乏胰岛素敏感性。因此，我们使用稳定转染IR和IRS-1 cDNA的CHO细胞(Sun等人，1992年). 与以往研究一致(Heller-Harrison等人，1995年)，我们观察到这些细胞中IRS-1和PI 3-激酶的显著部分在HSP部分中发现（见图。​图11）。11). 接下来对CHO/IR/IRS-1细胞HSP进行速度梯度分析，并如上所述对部分进行免疫印迹（图。​（图10，10,A类和B类). IRS-1、酪氨酸磷酸化IRS-1和p85在CHO细胞中的分布与在脂肪细胞中观察到的几乎相同（图。​（图9）。9). 此外，胰岛素诱导CHO/IR/IRS-1细胞中IRS-1酪氨酸磷酸化和PI 3-激酶募集显著增加，这与脂肪细胞中观察到的情况相当（图。​（图10，10,B类). 因此，这些数据表明，IRS-1和PI 3-激酶的非膜相关不溶性可能是由这些蛋白与大蛋白复合物结合而产生的，是许多细胞的特征，可以使用在通常表达低水平该蛋白的细胞类型中表达的重组IRS-1进行重述。

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图11

IRS-1和PI 3-激酶在渗透性CHO细胞中的保留。将过度表达IR和IRS-1的CHO细胞置于基础状态，然后在没有（−）或存在（+）链球菌溶血素的情况下培养-O（运行）(SLO公司)使细胞穿孔。将细胞清洗、均质并进行差速离心以获得高速颗粒(热休克蛋白)和胞质(中青旅)分数。对每一组分的等分样品（15μg蛋白质）进行SDS-PAGE，并用IRS-1和PI 3-激酶特异性抗体进行免疫印迹(抗p85^聚丙烯腈).

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图10

CHO/IR/IRS–1细胞HSP沉积速度分析。从基础细胞中获得的HSP组分(A类)或胰岛素治疗(B类)将过度表达胰岛素受体（IR）和IRS-1的CHO细胞重新悬浮在含有5%蔗糖的缓冲液（20 mM Hepes，pH 7.4，1 mM EDTA，200μl）中，并覆盖在5–30%的连续蔗糖梯度上。梯度在90000下离心克90分钟，从底部收集馏分（400μl）(1–11)重力作用下的每个梯度。对每个组分的等分样品进行蛋白质含量分析，或通过SDS-PAGE（30μl）进行解析，并使用IRS-1、磷酸酪氨酸特异性抗体进行免疫印迹(抗pY)和PI 3-激酶(抗p85^聚丙烯腈).

渗透细胞中IRS-1–PI 3-激酶复合物的维持

CHO/IR/IRS-1细胞中IRS-1和PI 3-激酶的细胞溶质或不可沉淀池明显大于脂肪细胞中观察到的，并且可以通过免疫印迹法轻易检测到。因此，这提供了一个有用的系统，用以实验确定完整细胞中IRS-1和PI 3-激酶的两个池（细胞溶质池和不溶性池）的存在。如果IRS-1和PI 3-激酶的不溶性沉淀池代表细胞内的一个大的预先形成的蛋白质复合体，则应在渗透后保留。然而，如果孔隙足够大，这些蛋白质的细胞溶质成分应该在相同的实验条件下从细胞中释放出来。细菌内毒素（SLO）为实现这一目的提供了一种有用的试剂，因为它在质膜上引入了大孔，使细胞的其余部分保持完整。如图所示。​图11，11细胞溶质部分中发现的大多数IRS-1和免疫反应性p85在SLO渗透后从细胞中释放出来。相反，与HSP组分相关的免疫反应性p85和IRS-1的相当大比例保留在透化细胞中。我们还表明，在SLO渗透的3T3-L1脂肪细胞中保留了大量IRS-1和PI 3-激酶（数据未显示）。然而，由于我们没有在这些细胞的胞浆中观察到大量IRS-1，因此我们无法检查渗透后该池的释放，如CHO/IR/IRS-1细胞的情况所示，这提供了非常有用的控制。尽管如此，这些研究总体上表明，我们在这些研究中通过生化方法分离的IRS-1和PI 3-激酶的不溶部分也可以在实验上定义为保留在细胞中的大型复合物，即使在这些相同蛋白质的胞质成分可自由渗透的条件下。

我们感谢Teresa Boncker在组织培养方面提供的卓越技术援助。感谢Shane Rea在这项工作中的支持。我们感谢Gus Lienhard博士、Brian Druker博士、Mike Waters博士（澳大利亚布里斯班昆士兰大学）、David Bowtel博士和Margaret Robinson博士慷慨捐赠抗体，并感谢Morris White博士赠送CHO/IR/IRS-1细胞。

这项工作得到了澳大利亚国家卫生和医学研究委员会的支持。分子和细胞生物学中心是澳大利亚研究委员会的一个特别研究中心。D.E.James是Wellcome Trust的教授研究研究员。