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细胞生物学杂志。1997年1月13日；136(1): 215–227.
数字对象标识：10.1083/jcb.136.1.215
预防性维修识别码：PMC2132458型
PMID：9008715

抑制Ced-3/ICE相关蛋白酶不能防止癌基因、DNA损伤或Bcl-2同源蛋白Bak诱导的细胞死亡

尼古拉·麦卡锡,* 莫伊拉·K.B.怀特,*‡ 克里斯托弗·吉尔伯特,*和杰拉德·I·埃文*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

越来越多的证据表明，半胱氨酸蛋白酶的白细胞介素-1β-转化酶（ICE）家族在哺乳动物细胞凋亡中起着核心作用，半胱胱氨酸蛋白酶是线虫“死亡”基因产物的同源物，塞得-3。Ced-3被认为是线虫细胞程序性死亡的执行者而非调节者。然而，目前尚不清楚哺乳动物ICE相关蛋白酶（IRP）是否参与哺乳动物细胞凋亡的执行或调节。此外，哺乳动物细胞凋亡对一个或多个IRP的绝对要求尚未确定。我们使用了两种IRP的细胞渗透抑制剂，Z-Val-Ala-Asp.氟甲基酮（ZVAD.fmk）和吨-为了证明IRPs在几种不同机制（癌基因表达失调、Bcl-2相关Bak的异位表达和DNA损伤诱导的细胞死亡）诱导的哺乳动物细胞凋亡中的关键作用。在所有情况下，ZVAD.fmk和BD.fmk治疗均抑制与凋亡相关的特征性生化和形态学事件，包括核层粘连和聚（ADP-核糖）聚合酶的裂解、染色质凝聚和核小体阶梯，以及磷脂酰丝氨酸的外显。然而，ZVAD.fmk和BD.fmk都不能抑制细胞凋亡的发生，其特征是表面起泡；相反，一旦启动，两者都会延迟程序的完成。相反，IGF-I和Bcl-2延迟了细胞凋亡的发生，但一旦启动，对程序的动力学没有影响。我们的数据表明，IRP构成了由解除调控的致癌基因、DNA损伤或Bak诱导的哺乳动物细胞凋亡执行机制的一部分，但它们的作用是在细胞发生凋亡或可被生存因子挽救的时刻之后。此外，所有这些被阻断的细胞都失去了增殖潜能，最终都会因细胞质泡状变而死亡。

凋亡是一种先天性细胞自杀机制，在生理和病理的不同情况下被激活，以清除不需要的、受损的或潜在的肿瘤细胞。细胞凋亡的经典定义是：注定要死亡的细胞发生一系列特征性的形态学变化，包括膜泡、细胞收缩、染色质浓缩和DNA断裂，最终导致细胞分裂为膜结合的凋亡小体，其表面表现出强大的吞噬触发因子。细胞自杀程序似乎在后生动物进化的早期就出现了，其基本机制已经得到了很大程度的保护。线虫细胞程序性死亡的关键基因主角，秀丽隐杆线虫，是两个“杀手”基因，塞得-3和塞得-4执行死亡计划所需的ced公司-9，“保护者”基因，它可以减轻杀手基因的作用。塞得-9和塞得-3每个都有许多哺乳动物同源物：塞得-9在结构和功能上与癌基因所在的死亡调节基因家族相关bcl-2基因是原型(亨加特纳和霍维茨，1994年)和塞得-3该产品在结构和功能上与一类哺乳动物半胱氨酸蛋白酶同源，其原型是白细胞介素-1β-转化酶（ICE）1(袁等，1993). 迄今为止，没有与塞得-4已确定。

ICE最初被描述为天冬氨酸裂解前白细胞介素-1β所需的半胱氨酸蛋白酶116阿拉117产生活性细胞因子(Cerretti等人，1992年;Thornberry等人，1992年). ICE只是一个新兴的ICE相关蛋白酶家族之一，其已知成员包括Ich-1/Nedd-2(Kumar等人，1994年;Wang等人，1994年)，Ich-2/TX/ICE相对二(Faucheu等人，1995年;Kamens等人，1995年;Munday等人，1995年)，CPP32/Apopain/Yama(Fernandes-Alnemri等人，1994年;Nicholson等人，1995年;Tewari等人，1995年)，千立方厘米(Fernandes-Alnemri等人，1995年一 )，Mch3/ICE-LAP-3(Duan等人，1996年一 ; FernandesAlnemri等人，1995年b条)，ICE-LAP-6(Duan等人，1996年b条 )、ICE相对III/年(Faucheu等人，1995年;Munday等人，1995年)和FADD-like ICE/MORT1相关CEP-3同源物（FLICE/MACH）(Boldin等人，1996年;Muzio等人，1996年). 其中，ICE、CPP32β、Mch2和FLICE/MACH与细胞凋亡直接相关：(Boldin等人，1996年;Muzio等人，1996年)和ICE(Enari等人，1995年;Kuida等人，1995年)是通过TNF-R1和CD95/Fas信号通路诱导细胞凋亡所必需的。FLICE/MACH在配体与TNF-R1或CD95/Fas受体结合时直接激活(Boldin等人，1996年;Muzio等人，1996年)，并且需要ICE活动(Enari等人，1995年;Los等人，1995年)对发生凋亡所必需的CPP32β样蛋白酶的下游激活(Enari等人，1996年). CPP32β也被认为是凋亡程序的一般组成部分(Nicholson等人，1995年;Tewari等人，1995年)是prICE的成分，prICE是一种蛋白水解酶提取物，从凋亡的鸡细胞中提取，可诱导间期细胞核的凝聚和分裂(Lazebnik等人，1995年一 ). Mch2裂解核层粘连蛋白(Orth等人，1996年;Takahashi等人，1996年)，也是一项活动(Lazebnik等人，1995年b条 ).

ICE相关蛋白酶家族的所有成员都倾向于在P1处的天冬氨酸残基后对其底物进行裂解，之后通常在P1′处出现少量残基，所有这些都被合成为原酶，通过在关键天冬氨酸残基上的裂解激活，这些残基本身符合ICE家族蛋白酶的底物共识。因此，IRP被认为存在于自动和跨清除的层次结构中。例如，可以通过自动清除激活proICE(Thornberry等人，1992年)和proCPP32β可以被ICE激活(Tewari等人，1995年)以及通过细胞毒性T细胞颗粒丝氨酸蛋白酶颗粒酶B(Darmon等人，1995年). ICE相关蛋白酶处理释放NH2-不同IRP中不同长度的末端前体蛋白，将剩余的多肽裂解为两个亚单位（人类ICE的p20和p10），形成活性（p20:p10）2酶(Walker等人，1994年;Gu等人，1995年b条 ). 较大的亚单位包含催化半胱氨酸，但这两个亚单位都是酶活性所必需的。

关于激活的IRP如何触发凋亡的一些线索来自于潜在IRP靶点的识别。CPP32β裂解聚（ADP-核糖）聚合酶（PARP）(Lazebnik等人，1994年;Gu等人，1995年一 )和DNA-dependent protein kinase（Casciola Rosen等人，1995），两者都参与DNA损伤感知和修复，而Mch2裂解核层粘连蛋白(Orth等人，1996年;Takahashi等人，1996年). 各种IRP的其他靶标是固醇调节元件结合蛋白SREBP-1和SREBP-2(Wang等人，1995年)，U1-snRNP的70-kD蛋白（Casciola-Rosen等人，1994），PKCδ(Emoto等人，1995年)以及细胞骨架的各种成分，如肌动蛋白(Mashima等人，1995年)和Gas2，微丝系统的一个组件(Brancolini等人，1995年). 然而，目前尚不清楚这些靶点中哪一个（如果有的话）是导致细胞起泡、凝结和分裂的原因，而这些是细胞凋亡的特征。

在线虫中，遗传证据支持IRP Ced-3是线虫细胞死亡“执行机制”的一部分，因为第3部分-缺乏突变体，不会发生细胞死亡(埃利斯和霍维茨，1986年). 然而，哺乳动物IRP之间日益增加的复杂性和潜在的等级关系使得人们不清楚哪些蛋白酶可能作为凋亡执行者，哪些蛋白酶可能用于调节这些执行者。还不清楚某些哺乳动物的IRP是否包含由哺乳动物凋亡的所有触发因素激活的“最终和专属性共同通路”。

解决这些问题的一种方法是根据这些酶的首选肽底物特异性使用IRP抑制剂。在本文中，我们使用了两种广谱细胞通透性IRP抑制剂-苄氧羰基-ValAla-Asp(O（运行）-甲基）-氟甲基酮（ZVAD.fmk）和吨-丁氧羰基-Asp.氟甲基酮（BD.fmk）-证明IRP参与不同信号诱导的哺乳动物细胞凋亡。然而，最重要的是，我们发现抑制IRP只会阻止经典凋亡程序的一部分，生成在程序完成之前被阻止的注定细胞。

材料和方法

细胞培养和细胞系

如前所述，分离表达β-雌二醇和c-Myc依赖于4-羟基三苯氧胺（4-OHT）的条件等位基因（分别为Rat-1/c-MycER和Rat-1/c-MycER™）的Rat-1成纤维细胞(Littlewood等人，1995年). 在4-OHT可激活嵌合GalER-VP16转录因子的控制下，从Gal-4元件表达Bak的Rat-1成纤维细胞(Braselmann等人，1993年)也有描述（Rat-1/Bak细胞）(Chittenden等人，1995年)，Rat-1/c-MycER细胞组成性表达Bcl-2（Rat-1/c-MycER/Bcl-2）(Fanidi等人，1992年). 在病毒LTR的控制下，用含有12S E1A的整个开放阅读框的重组逆转录病毒pBabeNEO感染Rat-1细胞，分离出另一个组成性表达腺病毒E1A（12S）蛋白（Rat-1/E1A）的Rat-1细胞系，随后进行选择和克隆。免疫印迹法证实12S E1A的表达。表达E1A（12S）或空载体对照的Rat-1细胞在无血清培养基中洗涤两次，然后在无血清条件下培养。使用延时视频显微镜观察细胞48小时。与对照组相比，Rat-1/E1A细胞表现出明显的凋亡，表明E1A在无血清的情况下诱导凋亡的能力。Rat-1/cMycER™、Rat-1/c-MycER/Bcl-2和Rat-1/E1A细胞系维持在补充10%FCS和1 mg/ml庆大霉素的DME中。Rat-1/Bak细胞保存在无酚二甲醚中，补充10%木炭提取物剥离的FCS和1 mg/ml庆大霉素。对Rat-1/c-MycER™使用5μg/ml的嘌呤霉素，对Rat-1/E1A细胞使用1 mg/ml的新霉素，对Rat-1-Bak细胞使用5μ/ml的嘌霉素和1mg/ml的新霉素。细胞通过标准胰蛋白酶传代并直接接种到组织培养塑料上。通过在0.05%FCS中培养48小时来耗尽细胞的血清。通过向细胞培养物中添加4-OHT至100nM的最终浓度来诱导Myc和Bak的表达。

试剂和抗体

4-OHT来自SEMAT（英国圣奥尔本）。制备1 mM 100%乙醇储备溶液，储存在−20°C下，并根据需要在DME中稀释。ZVAD.fmk和BD.fmk来自酶系统产品（加利福尼亚州都柏林）。DMSO中的储备溶液在50 mM下制备，储存在−80°C下，并根据需要使用。足叶乙甙/VP16、鬼臼苷和3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴化铵（MTT）从西格玛（英国普尔）。FITC-标记的annexin V来自Bender&Co.GmbH（奥地利维也纳）。二级抗体和增强的化学发光来自阿默舍姆国际(阿默沙姆，英国）。

腺病毒E1A蛋白多克隆抗体是英国伦敦皇家癌症研究基金会（ICRF）的N.Jones博士捐赠的。PARP多克隆抗体（C-2-10）是W.Earnshaw博士（英国苏格兰爱丁堡大学）的礼物。抗层粘连蛋白A和C抗体（131C3）是Y.Raymond博士（加拿大蒙特利尔蒙特利尔癌症研究所）和对照抗体MOPC21C赠送的。肌动蛋白抗体是国际癌症研究基金会Fulvia Verde博士赠送的。

时间间隔视频显微镜

在配备外荧光的倒置相位对比显微镜（Diaphot；Nikon，Inc.，Mellville，NY）上采集时间间隔视频显微图像，并在外部动画控制器（EOS Electronics AV Ltd.，Barry，Wales，UK）的控制下在BetaCam或sVHS录像带上采集，如前所述(Evan等人，1992年). 凋亡细胞死亡在细胞完全分离和圆形时进行评分。具有“起泡”表型的细胞被认为是活的，而它们保持粘附和活跃的起泡，并且一旦完全脱落和变圆，也同样被认为是死的。

西方印迹法

通过SDS-PAGE分析聚（ADPribose）聚合酶、核层粘连蛋白A和C以及肌动蛋白的裂解，并随后转移到硝酸纤维素膜（Immobilion P，Amersham国际). 将膜在TNT缓冲液（1%TBS、0.5%吐温20和5%脱脂奶）中封闭30分钟，然后在PARP抗体中培养(Lamarre等人，1986年)肌动蛋白或层粘连蛋白A和C抗体在4°C的TNT缓冲液中放置12小时。膜在TNT中清洗两次，然后在室温（RT）下与抗小鼠或抗兔HRP结合二级抗体孵育1小时（视情况而定）。最后，在TNT缓冲液中清洗两次膜，在TBS和0.5%吐温20中清洗一次膜，并通过增强化学发光显示结合抗体。

电子显微镜和免疫细胞化学

使用标准电子显微镜技术如下。将细胞制成颗粒，在室温下在Sorensens缓冲液中的2.5%戊二醛中固定1h，在同一缓冲液中四氧化锇中后固定，并嵌入Araldite树脂中。切片在Reichert超切机上切割，用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色，并在电子显微镜上观察（EM 10 CR；Carl Zeiss，Inc.，Thornwood，NY）。如前所述，用免疫细胞化学方法测定PARP的表达和定位(Lamarre等人，1986年). 简单地说，细胞生长在8孔室载玻片上，并在−20°C下用100%甲醇固定10分钟。将固定细胞与一级抗体在PBS中RT培养60分钟，然后在含有0.1%吐温20的PBS缓冲液中进行五次洗涤。在适当的FITC标记的第二抗体中孵育后，使用共聚焦显微镜（型号MRC 1000；BioRad Labs，Hercules，CA）观察细胞。使用抗层粘连蛋白A+C抗体（1:100）进行免疫细胞化学鉴定，与先前固定的细胞一起培养，并在10%FCS和PBS中预先阻断。在PBS中清洗三次后，用上述二级抗体培养细胞。对于肌动蛋白染色，细胞在PBS中的4%多聚甲醛中固定10分钟，在RT时在PBS内洗涤，然后用0.2%Triton在PBS里渗透5分钟。然后在PBS中将细胞冲洗，并在RT时用PBS中0.1μg/ml FITC-鬼臼蛋白培养20分钟。最后，细胞在PBS中洗涤多次，安装，如上所示。

细胞活性测定

线粒体脱氢酶活性作为细胞存活的标志，通过细胞将可溶的MTT转化为不可溶的甲胎素反应产物的能力进行检测(莫斯芒特，1983年). 将10μl MTT溶液（PBS中为5 mg/ml）添加到含有3000个细胞的96 well平板的每个孔中，并将其置于100μl培养基中。通过去除上清液并添加200μl酸性丙醇，在37°C下2小时后停止反应。将平板在室温下黑暗放置15分钟，使用微孔板阅读器测量570–630 nm处的吸光度差，存活率计算为（实验-空白）/（对照-空白）×100%，其中空白为无细胞的中等+MTT，对照为细胞存活率最高的微孔的信号，即：。，含血清，无4-OHT。

细胞存活率也通过能够排除重要染料台盼蓝的细胞比例的直接显微镜评估来测定。Rat-1/cMycER™细胞在3 cm组织培养皿中生长，换成无血清培养基培养48 h，然后添加4-OHT±ZVAD.fmk/BD.fmk（时间0）。在指定的时间点，对细胞进行胰蛋白酶化并在DME中清洗，通过在血细胞仪上至少计数200个细胞来评估台盼蓝阳性细胞的数量。

细胞流式细胞术分析

贴壁细胞进行胰蛋白酶消化，在70%乙醇中固定，并用碘化丙啶染色。在Becton Dickinson（加州山景城）FACSstar plus上进行流式细胞术分析。

膜联蛋白V与外磷脂酰丝氨酸的结合

通过延时视频显微镜观察在有无ZVAD.fmk或BD.fmk的情况下发生凋亡的细胞。当相当大比例的细胞出现凋亡（无ZVAD.fmk/BD.fmk）或起泡（加上ZVAD.fmk/BD.fm）时，用FITC–annexin V充满培养物。然后用荧光显微镜和相位显微镜检查迄今为止观察到的相同显微视野，以检测结合的annexinV并检查细胞形态，分别是。

结果

ZVAD.fmk和BD.fmk，ICE相关蛋白酶抑制剂，延迟但不能防止多种信号诱导的细胞死亡

细胞凋亡可由多种影响因素触发，包括癌基因放松调控、DNA损伤和杀伤基因表达。为了确定IRP与凋亡的一般相关性，我们检测了细胞渗透性IRP抑制剂ZVAD.fmk和BD.fmk对多种药物诱导Rat-1成纤维细胞凋亡的影响。c-Myc一个失调的条件等位基因的激活可诱导细胞凋亡(Littlewood等人，1995年)腺病毒蛋白E1A的表达(Rao等人，1992年)，DNA损伤与使用拓扑异构酶II抑制剂足叶乙甙的c-Myc表达(Fanidi等人，1992年)或Bcl-2家族杀手Bak的表情(Chittenden等人，1995年). 两个E1A(Debbas和White，1993年)和依托泊苷(Lowe等人，1993年)通过p53依赖机制诱导细胞凋亡；c-Myc可能部分通过p53发挥作用（Littlewood等人，手稿正在准备中），Bak杀伤与p53无关（T.Chittenden，未发表数据）。

在存在或不存在ZVAD.fmk或BD.fmk的情况下，视情况诱导、激活Rat-1成纤维细胞系或用药物治疗。通过延时视频显微镜监测细胞，并在细胞从基质上分离时将其标记为死亡。无论触发因素如何，ZVAD.fmk和BD.fmk在所有情况下都能提供极好的细胞凋亡保护（ZVAD.fmk的数据如图所示。​图1）。1). 因此，所有这些凋亡触发因素都是通过ZVAD.fmk或BD.fmk敏感剂发挥作用的，可能是一种或多种IRP。

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ICE相关蛋白酶的细胞渗透性抑制剂ZVAD.fmk和BD.fmk抑制癌基因、DNA损伤和Bak诱导的凋亡。通过延时视频显微镜观察Rat-1细胞培养，并以12帧/小时的速度收集图像。在每个5小时周期结束时，对迄今为止的凋亡事件总数（由细胞分离确定）进行汇总并绘制时间曲线。在每种培养物中，细胞凋亡事件的发生率显示为是否存在ZVAD.fmk（100μM）。在时间0添加ZVAD.fmk和他莫昔芬（如适用）。(A类)在存在（▴）或不存在（•）ZVAD.fmk的情况下表达c-Myc-ER™的Rat-1细胞。c-Myc通过添加4-OHT（100 nM）被激活。(B类)在GalER-VP16启动子的控制下，在ZVAD.fmk存在（？）或不存在（•）的情况下表达Bak的Rat-1细胞。GalER-VP16嵌合转录因子通过添加4-OHT（到100 nM）被激活，从而诱导Bak的表达。(C类)在存在（▴）或不存在（•）ZVAD.fmk的情况下，Rat-1细胞组成性表达腺病毒E1A蛋白。(D类)表达c-MycER™的Rat-1细胞，在有（▴）或无（•）ZVAD.fmk的情况下用足叶乙甙/VP16（100 nM）处理。通过添加4-OHT（至100 nM）再次激活c-Myc。

如图所示。​图1，1，ZVAD.fmk或BD.fmk提供的保护程度很高。尽管如此，在c-Myc、E1A、Bak或持续DNA损伤的持续促凋亡影响下，最终观察到所有细胞都从基质上脱落，经历部分染色质凝集，并最终变得可渗透，即使在持续存在ZVAD.fmk或BD.fmk的情况下（见下文）。较高水平的ZVAD.fmk或BD.fmk，或定期24小时向培养基中读取ZVAD.fmk或BD.fmk，都无法延迟细胞的最终死亡（数据未显示），这表明ZVAD.fmk和BD.fm对细胞死亡的抑制最终被淹没或绕过。在所有测试的病例中，ZVAD.fmk和BD.fmk的效果是相同的。因此，下文显示了ZVAD.fmk的主要数据。

ZVAD.fmk不会延迟膜破裂的发生，但会阻止凋亡程序的完成

时间推移视频显微镜可以观察细胞培养中单个凋亡事件的发生和执行。细胞凋亡的特征是表面突然起泡，同时伴有细胞质破碎和脱落，这就是凋亡这个名字的由来。在成纤维细胞中，起泡开始后会迅速发生细胞核凝聚、塌陷和细胞整体碎裂，这一过程通常需要30-60分钟(Evan等人，1992年)（请参阅Web信息证明中添加的注释）。然而，虽然单个细胞的凋亡事件很快，但培养物中的单个细胞在低血清c-Myc活化诱导的凋亡过程中，在较长时间内表现出非同步启动凋亡。由于这种凋亡是独立于细胞周期的，因此这种不同步性的基础尚不清楚，尽管其发生率受c-Myc蛋白水平和培养基中生存因子的存在影响很大(Harrington等人，1994年).

使用延时视频显微镜观察在ZVAD.fmk或BD.fmk存在下c-Myc诱导的细胞凋亡，我们惊讶地发现，根据起泡的判断，这两种抑制剂似乎都没有延迟培养物中细胞凋亡的启动。事实上，在ZVAD.fmk处理的培养物中，凋亡事件发生的动力学与未处理的细胞培养物重叠（图。​（图22 A类). 然而，与未经处理的细胞不同，经ZVAD.fmk或BD.fmk处理的细胞并没有迅速浓缩和碎片化，而是长时间地持续气泡和沸腾（图。​（图22 B类). 在这种长时间的起泡过程中（通常持续数天），细胞保持粘附，排除台盼蓝，并表现出体力活动，所有这些都暗示着持续的新陈代谢（参见网络信息证明中添加的注释）。后一种观点得到了使用MTT法检测ZVAD.fmk处理细胞线粒体活性的支持，这表明这些细胞中线粒体脱氢酶活性持续存在（图。​（图3三 A类).

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ZVAD.fmk和BD.fmk不延迟细胞死亡的开始，但阻止细胞膜起泡后凋亡的完成(A类)ZVAD.fmk不会延迟细胞死亡的发生，但会扩展单个凋亡事件的动力学。在存在（▴）或不存在（•）ZVAD.fmk（至100μM）的情况下，通过4-OHT（100 nM）对Rat-1/c-MycER™细胞中诱导的凋亡起始时间进行视频显微镜定量。与之前一样进行时间推移视频显微镜检查，但对细胞膜起泡进行评分(B类)在没有血清的情况下，c-Myc诱导24小时后，ZVAD.fmk和BD.fmk均显示出严重的细胞质起泡。Rat-1/c-MycER™细胞在添加有或没有100μM ZVAD.fmk或5μM BD.fmk的4-OHT（100 nM）之前，血清饥饿48小时。24小时后，用霍夫曼光学显微镜检查细胞。两张照片都显示了用ZVAD.fmk或BD.fmk处理过的起泡细胞的典型区域。

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ZVAD.fmk可延迟细胞凋亡特征标志物的出现。(A类)ZVAD.fmk延缓线粒体完整性的破坏。Rat-1/c-MycER™细胞在含有10%FCS的DME中以约3000个细胞/孔的密度被镀入96个板中。培养48小时后，将培养基替换为无血清培养基，细胞再保留48小时。再次清洗细胞，用含有100 nM 4-OHT或4-OHT加ZVAD.fmk的生长培养基替换培养基，如图所示。然后用MTT光度法在不同时间测定线粒体完整性。条形代表四个重复培养孔±SDs的平均值。所示数据来自单个代表性实验。(B类)流式细胞术分析Rat-1/c-MycER™细胞在存在或不存在ZVAD.fmk的情况下接受c-Myc诱导的细胞凋亡。在时间0时，将4-OHT±ZVAD.fmk添加到缺血清细胞中。然后在指定的时间点通过胰酶消化法获取细胞。将细胞固定在乙醇中，用碘化丙啶染色，并通过流式细胞术进行检测。ZVAD.fmk处理的人群中没有凋亡细胞的亚G1峰特征。

因此，ZVAD.fmk处理的细胞似乎正常启动凋亡，但随后在凋亡程序中被阻止。当E1A、足叶乙甙或Bak表达诱导细胞凋亡时，获得了相同的结果（数据未显示）。

ZVAD.fmk阻断凋亡细胞的特性

为了进一步研究ZVAD.fmk介导的死亡程序阻断，我们检测了ZVAD.f mk处理的起泡细胞凋亡的一些生化和形态学参数。首先，我们通过结合Western blotting和共焦免疫荧光显微镜检查已知IRP底物的裂解，检查了ZVAD.fmk抑制细胞内IRP的功效。从ZVAD.fmk处理的培养物中采集细胞，其中50-60%的细胞表现出持续的气泡表型，这是通过延时视频显微镜（通常在诱导凋亡后24-36小时）判断的，细胞裂解物通过SDS-PAGE和电印迹分离。用肌动蛋白、层粘连蛋白A+C和PARP（所有已知的IRP底物）抗体检测印迹(Lazebnik等人，1994年, 1995b条;Gu等人，1995年一 ;Mashima等人，1995年;Oberhammer等人，1994年)，并与不含ZVAD.fmk的对照培养物的等效裂解物进行比较。ZVAD.fmk抑制所有蛋白质的裂解长达48小时（图。​（图44 A类). 我们还通过免疫荧光共聚焦显微镜检查了有和没有ZVAD.fmk处理的细胞中肌动蛋白、PARP和层粘连蛋白染色的免疫细胞化学分布（图。​（图44 B类). 通过用卵磷脂-FITC染色渗透细胞来检测ZVAD.fmk对细胞内肌动蛋白分布的影响。这表明ZVAD.fmk处理的细胞在形态学上与对数期活细胞或凋亡细胞不同，表现出非常明显的细胞质泡状（图。​（图44 B类). ZVAD.fmk治疗阻止了PARP和层粘连染色的扩散和减少，这在凋亡细胞中是常见的。因此，正如其他地方报道的那样(Fearnhead等人，1995年;Fletcher等人，1995年;Slee等人，1996年)，ZVAD.fmk有效抑制已知IRP底物的细胞内裂解。

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ZVAD.fmk抑制低血清中表达活化c-Myc的Rat-1/c-MycER™细胞中已知ICE相关蛋白酶底物的裂解。(A类)对Rat-1/c-MycER™细胞中三种已知IRP底物的裂解进行免疫印迹分析，其中c-Myc在低血清中在存在或不存在ZVAD.fmk的情况下被激活。(我)ZVAD.fmk抑制层粘连蛋白A和C的裂解。ZVAD.fmk治疗抑制细胞凋亡中特征性46-kD IRP裂解产物的出现(Oberhammer等人，1994年)24小时和48小时车道1，时间为0个单元格；车道224小时对照细胞；车道三，24小时ZVAD.fmk处理的细胞；车道448小时对照细胞；车道5，48小时ZVAD.fmk处理的细胞。(ii（ii）)ZVAD.fmk对PARP裂解的抑制作用。PARP的IRP裂解在凋亡细胞中产生特征性的85-kD片段(Lazebnik等人，1994年). 在非ZVAD.fmk处理的Rat-1/cMycER™细胞中，85-kD PARP片段在24小时后可见，在48小时后进一步增加1，时间0控制单元；车道2，时间为0的ZVAD.fmk处理细胞；车道三24小时对照细胞；车道424小时ZVAD.fmk处理细胞；车道548小时对照细胞；车道6，48小时ZVAD.fmk处理的细胞。(三)ZVAD.fmk抑制凋亡细胞中的肌动蛋白分裂，其特征是出现被所用抗体识别的15-kD片段。该片段的出现被ZVAD.fmk抑制。车道1，时间为0个细胞；车道248小时对照细胞；车道三48小时ZVAD.fmk处理细胞；车道496小时对照细胞；车道596-h ZVAD.fmk处理的细胞。(B类)已知IRP底物分布的共焦免疫荧光显微镜。(我)用抗层粘连蛋白A+c抗体染色的活性Rat-1/c-MycER™细胞在核外周表现出典型的层粘连染色。在凋亡细胞中，由于层粘连的降解和扩散，这种染色不存在。相反，与对照组相比，ZVAD.fmk处理的起泡细胞表现出接近正常的层粘连A+C染色。(ii（ii）)Rat-1/c-MycER™细胞用卵磷脂-FITC染色以检查肌动蛋白的分布。活细胞表现出正常的肌动蛋白纤维；凋亡细胞浓缩，未见肌动蛋白丝。在ZVAD.fmk处理的细胞中，肌动蛋白聚集在细胞表面的气泡中。请注意，与活细胞相比，泡状细胞的大小明显减小。(三)存活和起泡的Rat-1/c-MycER™细胞均呈现核PARP染色，这在凋亡细胞中不存在。棒材，10μm。

接下来，在存在或不存在ZVAD.fmk的情况下，对诱导发生凋亡的Rat-1/cMycER™细胞进行电子显微镜检查（图。​（图5）。5). 在低血清中c-Myc活化24小时后，非ZVAD.fmk处理人群中的许多细胞表现出典型的凋亡特征，即染色质凝聚、细胞收缩、细胞质起泡和细胞碎裂。相比之下，尽管来自ZVAD.fmk处理群体的细胞表现出粗大的细胞质泡状和一些内质网扩张，但它们的细胞器结构在其他方面保持良好。更值得注意的是，ZVAD.fm处理细胞的细胞核与非凋亡细胞的细胞核相似，网状染色质模式由完整的核膜和核膜包围。

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在存在和不存在ZVAD.fmk的情况下，对缺乏血清的Rat-1/c-MycER™细胞的凋亡进行电镜分析。在低血清中经历4-OHT诱导的细胞凋亡的单个Rat-1/c-MycER™细胞的电子显微镜分析。(A类)正常、存活的Rat-1/c-MycER™细胞。(B类)典型的凋亡细胞。(C类和D类)在形态学变化的早期和晚期，ZVAD.fmk的存在会诱导细胞凋亡，表现出明显的细胞质起泡，但没有染色质凝集。棒材，1μm。

接下来，我们检查了ZVAD.fmk处理的起泡细胞中DNA的完整性。流式细胞术分析表明，ZVAD.fmk抑制了具有凋亡细胞DNA特征的亚G1含量细胞的出现（图。​（图3三 B类). 与此一致，DNA不会降解为典型的寡核苷酸片段(威利，1980年)在c-Myc激活后48小时内，从ZVAD.fmk处理细胞提取的DNA中检测到（数据未显示）。

细胞凋亡通常与膜磷脂不对称性的丧失有关：关键“翻转酶”的失活导致细胞表面磷脂酰丝氨酸的表达，这是巨噬细胞识别和摄取凋亡细胞的信号(Fadok等人，1992年). 通过结合FITC-标记的膜联蛋白V评估表面磷脂酰丝氨酸的表达，并通过荧光显微镜观察(Koopman等人，1994年). 正常凋亡的Rat-1/c-MycER™细胞表现出annexin V结合，而在ZVAD.fmk或活细胞阻断的起泡细胞上未检测到结合（图。​（图6）。6). 因此，ZVAD.fmk在膜、线粒体破坏或磷脂酰丝氨酸不对称性丧失之前阻断细胞凋亡。

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细胞表面磷脂酰丝氨酸的表达。ZVAD.fmk延缓了膜联蛋白V结合的出现。在有或无ZVAD.fmk的情况下，通过相控显微镜检查c-Myc诱导凋亡的缺血清Rat-1/cMycER™细胞，以确定其形态(一和c（c）). 然后将FITC-标记的膜联蛋白V添加到培养皿中，使其最终浓度达到2.5μg/ml，并通过荧光显微镜检查相同的细胞(b条和天). 在缺乏ZVAD.fmk的情况下，凋亡细胞被膜联蛋白V染色(一和b条). 相反，ZVAD.fmk处理的起泡细胞不结合膜联蛋白V(c（c）和天).

如上所述，ZVAD.fmk处理的细胞诱导发生凋亡，并在数天内表现出起泡表型，但最终会分离，并对活性染料具有渗透性。对这些“晚期”ZVAD.fmk处理细胞的分析显示，表面膜粗糙，细胞质空泡化，染色质部分凝集（虽然少于“正常”凋亡细胞），以及最终的膜通透性（数据未显示）。我们得出的结论是，这些细胞似乎经历了部分凋亡细胞死亡，尽管这需要进一步的表征。

ZVAD.fmk抑制抗凋亡细胞因子IGF-1或凋亡抑制因子Bcl-2下游的凋亡

两种细胞因子(Harrington等人，1994年)和Bcl-2(Fanidi等人，1992年)能有效抑制成纤维细胞凋亡，最明显的是延迟凋亡的发生，延迟的程度取决于c-Myc的表达水平和IGF-1或Bcl-2的丰度(Evan等人，1992年;Fanidi等人，1992年;Harrington等人，1994年). 有趣的是，延时视频显微镜分析显示，虽然IGF-1和Bcl-2延迟了细胞凋亡的发生（根据膜泡开始判断），但一旦启动，它们不会抑制程序的完成。细胞在20–60分钟内从起泡到最终破碎，基本上与在没有IGF-1或过度表达bcl-2基因（图。​（图7，7,A类和B类). 这与Bcl-2、血清和生存因子如IGF-I信号作用的概念一致上游膜起泡的开始，有效地降低了凋亡程序在任何单个细胞中启动的概率。相反，ZVAD.fmk作用于膜泡的下游，但在细胞凋亡的后期之前。为了进一步研究血清生存因子与ZVAD.fmk抑制凋亡之间的时间关系，我们通过在无血清的情况下添加4-OHT来诱导ZVAD.fmk处理的Rat-1/c-MycER™细胞起泡，然后检查血清的重新加入是否可以逆转起泡表型并允许细胞恢复。通过延时视频显微镜观察培养物。在添加血清时，人群中的一些细胞刚刚开始起泡，而其他细胞已经起泡数小时。在检测到的500多个细胞中，没有一个细胞出现反泡现象，所有开始起泡的细胞最终都会死亡。图中描述了一个代表性人群的研究。​图8。8通过对延时视频数据的检查，ZVAD.fmk处理的起泡细胞也明显不增殖。在检测的大约1000个细胞中，没有观察到任何开始起泡的细胞分裂。然而，这不是由于ZVAD.fmk的细胞抑制作用就其本身而言因为ZVAD.fmg培养物中的非凋亡细胞以正常的速度分裂，这是由时间戳视频显微镜（参见网络信息证明中添加的注释）和DNA剖面（图。​（图3三 B类). 因此，我们得出结论，起泡的发生与克隆潜能的丧失是一致的。有趣的是，在取血清时尚未开始起泡的细胞仍然存活，从未起泡，并且在存在ZVAD.fmk的情况下，细胞增殖以最终重新填充培养物（未显示）。因此，在膜泡出现之前重新加入生存因子可以完全保护细胞的生存能力和增殖潜力。

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IGF-I和Bcl-2延迟凋亡程序的启动，但不延迟其执行。用100 nM 4-OHT处理缺乏血清的Rat-1/c-MycER™细胞，以激活c-Myc，然后进行延时视频显微镜检查。细胞凋亡的起始点在起泡开始时计分。细胞死亡的终点在细胞分离点计分，两者之间的时间用水平线的长度表示。(A类)IGF-1存在或不存在时的凋亡事件。IGF-1对Myc诱导凋亡动力学的影响。(B类)Bcl-2表达对Myc诱导凋亡动力学的影响。存在或不存在共表达Bcl-2的凋亡事件。

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一旦ZVAD.fmkblocked凋亡细胞开始起泡，血清生存因子并不能拯救它们。通过添加4-OHT，在缺乏血清的Rat-1/c-MycER™成纤维细胞中诱导凋亡，并通过时间推移视频显微镜观察细胞。在加入4-OHT 40小时后，将FCS添加回生长培养基中，达到10%的最终浓度。随后追踪引发膜泡的细胞，以确定其命运。图中显示了18个独立细胞命运的代表性研究。如前所述，测定膜起泡（•）和细胞死亡（|）的起始时间，两者之间的时间间隔由水平线给出。所有在血清恢复前开始膜泡的细胞最终死亡。相比之下，所有在取血清时尚未开始起泡的观察到的细胞存活并继续分裂（未显示）。

最后，我们询问是否可以通过从生长介质中去除4-OHT来拯救ZVAD.fmk阻断的起泡细胞，从而使c-Myc蛋白失活，而在Rat-1/c-MycER™细胞中，c-Myc蛋白质依赖于4-OHT的持续存在(Littlewood等人，1995年). 在检测的大约500个细胞中，我们观察到去除4-OHT后，任何经ZVAD.fmk处理的起泡细胞都没有恢复（数据未显示），这证实了这些细胞最终会死亡。

讨论

细胞自杀程序似乎在后生动物进化的早期就出现了，并得到了很大程度的保护。直接参与发育不变线虫个体发生细胞死亡控制和执行的三个主要基因中的两个秀丽线虫,ced公司-9和受试者-编码具有多种哺乳动物同源物的多肽：Bcl-2(亨加特纳和霍维茨，1994年)和ICE相关半胱氨酸蛋白酶(薛和霍维茨，1995)家庭。Bcl-2和IRP家族都与脊椎动物细胞自杀有关，这一过程的形态学表现为细胞凋亡。与…对比秀丽线虫然而，脊椎动物的细胞自杀受到许多不同因素的影响，包括细胞外信号、基因毒性和物理创伤、缺氧、癌基因表达和免疫杀伤。所有这些不同的药物如何影响潜在的细胞死亡机制尚不清楚。具体而言，目前尚不清楚哪些调节脊椎动物细胞死亡的因素是实际执行机制的一部分，即物理上拆除细胞的机制，哪些仅仅是控制执行过程参与的调节机制。

脊椎动物凋亡执行机制的最佳候选成分是Ced-3同源物，即ICE相关蛋白酶。与此相一致，许多不同的研究表明IRP与生长因子剥夺等侮辱诱导的细胞凋亡有关(Milligan等人，1995年;Nicholson等人，1995年)与细胞外基质失去接触(Boudreau等人，1995年)、Fas/TNF(Enari等人，1995年;Los等人，1995年;Duan等人，1996年一 ;Schlegel等人，1996年)和细胞毒性T细胞杀伤(Darmon等人，1995年). 因此，我们使用IRP抑制剂ZVAD.fmk和BD.fmk研究了哺乳动物细胞凋亡中IRP的需求。ZVAD.fmk和BD.fmk是研究完整细胞中IRP作用的特别有用的抑制剂，因为它们的内在疏水性允许它们进入细胞，因此胞内酯酶将天门冬氨酸甲酯转化为天冬氨酸，生成不可逆的IRP抑制剂。ZVAD.fmk和BD.fmk已被证明是完整细胞凋亡的有效抑制剂，在测试的ICE家族蛋白酶中具有广泛的反应性(Fearnhead等人，1995年;Slee等人，1996年). 在我们的研究中，我们观察到ZVAD.fmk和BD.fmk之间的效果没有差异。因此，我们显示的大多数数据仅限于使用其中一种抑制剂ZVAD.fmk的研究。

我们研究了ZVAD.fmk抑制由多种凋亡启动子触发的凋亡的能力：c-Myc和E1A癌基因表达，拓扑异构酶II抑制剂足叶乙甙诱导的DNA损伤，以及Bcl-2家族Bak杀伤成员的异位表达。在所有情况下，ZVAD.fmk都提供了防止凋亡的实质性保护，这与抑制已知IRP底物、肌动蛋白、层粘连蛋白和PARP的裂解有关。因此，癌基因、p53（DNA损伤后）和Bcl-2家族的促凋亡成员都通过ZVAD.fmk敏感性活动，最可能是一个或多个IRP诱导凋亡。这些发现扩展了IRP在哺乳动物细胞凋亡中的关键作用，包括对肿瘤发生和发展具有根本重要性的刺激。

然而，对受ZVAD.fmk保护的细胞进行详细的延时视频显微镜分析，发现了一种意想不到的新表型。大多数细胞凋亡的早期表现是剧烈的膜起泡。膜起泡是许多细胞类型凋亡的一个明确特征，在成纤维细胞的正常凋亡过程中，细胞迅速收缩（20–60分钟），随后出现染色质凝聚，核和细胞碎片。令人惊讶的是，在通过c-Myc、E1A、Bak或基因毒性药物足叶乙甙的作用诱导ZVAD.fmk处理细胞启动凋亡的培养物中，我们发现细胞膜起泡的发生并没有因培养基中存在ZVAD.fmk而延迟。然而，尽管未经处理的起泡凋亡细胞迅速进入染色质浓缩和细胞裂解的后期阶段，但ZVAD.fmk处理的细胞在很长一段时间内（通常是几天）继续剧烈起泡。这种起泡细胞几乎没有凋亡细胞的特征：细胞核保持完整，几乎没有染色质凝聚或核碎裂的迹象，质膜完整性和线粒体功能保持不变，细胞表面不表达磷脂酰丝氨酸。因此，尽管ZVAD.fmk能有效抑制典型的晚期凋亡事件，但它似乎并不抑制膜泡的发生。

此外，尽管ZVAD.fmk显著改善了Rat-1成纤维细胞中c-Myc、DNA损伤和Bak的促凋亡作用，但大多数细胞最终还是会从基质上脱落。这种细胞表现出一些染色质凝集（虽然远低于正常晚期凋亡细胞），但保留完整的核片；它们的细胞质也广泛碎片化和空泡化。然而，最终，晚期ZVAD.fmk处理的细胞会失去完整性，并吸收活性染料，这是它们最终死亡的无可争辩的证据。我们的结论是，晚期ZVAD.fmk处理的细胞经历了一个延迟的“部分”凋亡过程，尽管需要对这些晚期细胞进行更详细的描述才能确定其确切的表型。我们研究了ZVAD.fmk对细胞死亡的延迟是否可以通过向生长介质中添加更高初始浓度的ZVAD.fmk或通过重复读取来延长。然而，两者都不能改变Rat-1细胞培养中细胞死亡的动力学。由于在培养基中施用ZVAD.fmk的有效细胞内浓度或抑制剂在培养基或细胞内的半衰期不确定，因此很难评估该观察结果的重要性。尽管如此，持续的促凋亡刺激有可能最终覆盖ZVAD.fmk阻滞或绕过凋亡程序中的ZVAD.fmk敏感成分。

为什么凋亡细胞在使用ZVAD.fmk治疗时会出现长时间的气泡？一种可能性是，我们在ZVAD.fmk处理的细胞中观察到的气泡与伴随凋亡的正常气泡不同，与凋亡无关。有三个因素反对这一观点。通过延时视频显微镜、光学和电子显微镜，在ZVAD.fmk存在下观察到的起泡似乎与在经历正常凋亡的对照细胞中观察到的起泡相同。此外，ZVAD.fmk处理细胞群的起泡与对照细胞群相同；它只会持续更长的时间，因为它不会伴随着细胞和核分裂。最后，延时视频显微镜显示，起泡的ZVAD.fmk处理的细胞与真正的凋亡体以相同的方式粘附到活细胞上（Whyte，M.，N.McCarthy和G.I.Evan，未发表的数据）（参见Web信息证明中添加的注释），表明ZVAD.fmk阻断的细胞中，至少有一些在正常凋亡期间触发的前吞噬细胞过程（尽管不是磷脂酰丝氨酸的表面显示）也发生。第二种可能性是，ZVAD.fmk未能阻止膜泡，因为泡疹不是基本凋亡程序的一部分，而仅仅是通常伴随该过程的可有可无的副现象。然而，膜泡不属于细胞凋亡的概念很难与我们的延时视频显微镜数据相一致，这些数据表明，一旦起泡，抗凋亡细胞因子的作用或去除最初的促凋亡触发物都不会逆转膜泡。因此，气泡似乎是伴随着死亡而来的。我们也不喜欢这种解释，因为它试图通过重新定义凋亡来解释ZVAD.fmk表型，从而排除了这个过程的一个特征，这个特征是如此独特和普遍，以至于给这个现象起了名字。第三种可能性是膜起泡是善意的凋亡过程，但由不受ZVAD.fmk抑制的IRP触发。需要使用一系列具有不同特异性谱的IRP抑制剂来研究这种可能性。然而，目前仍有可能是膜泡由一种完全不同的机制触发的，这种机制可能根本不涉及IRP作用。

我们在ZVAD.fmk处理的凋亡细胞中观察到的持续膜泡的表型似乎与一些报告相矛盾，这些报告表明，化学和病毒IRP抑制剂可以提供长期的抗凋亡保护。例如，IRP的肽和病毒抑制剂保护运动神经元免受因子撤除后的凋亡(Gagliardini等人，1994年;Martinou等人，1995年;Tewari等人，1995年)保护细胞免受Fas和TN的杀伤(Beidler等人，1995年;Enari等人，1995年, 1996;Los等人，1995年)，并阻止发育性凋亡果蝇属(Hay等人，1995年)和秀丽线虫(薛和霍维茨，1995). 在其中一些情况下，受保护细胞可能启动了一个膜泡程序，使用静态成像技术很难识别。此外，泡状细胞有可能至少暂时维持体细胞内正常活细胞的某些功能。在其他情况下，细胞死亡可能由直接激活或招募IRP触发，在这种情况下，抑制IRP活性可能足以完全阻止所有凋亡表现。例如，DEVD特异性IRP CPP32β被细胞毒性T细胞颗粒丝氨酸酯酶Granzyme B直接裂解和激活，CD95和TNF-R1细胞毒性信号通路通过其“死亡域”直接招募（并可能激活）IRP FLICE/MACH(Boldin等人，1996年;Muzio等人，1996年). 通过推断果蝇属Reaper是另一种死亡域蛋白，在苍蝇发育凋亡期间，其作用类似于直接招募下游IRP。在癌基因放松调控、DNA损伤/p53和Bak的情况下，我们的数据表明，所有这些凋亡触发因素都作用于一些上游调控因子，这些上游调控因子可以独立激活IRP和膜泡。

通过时间推移视频显微镜分析，我们观察到IRP抑制剂ZVAD.fmk与特征鲜明的抗凋亡因子Bcl-2和IGF-I在抗凋亡作用方面存在明显差异。Bcl-2和IGF-I的作用是降低启动凋亡程序的概率，但一旦启动，对每个凋亡事件的动力学（定义为从起泡到细胞碎片的时间）都没有任何影响。与此完全相反，ZVAD.fmk并不抑制细胞凋亡程序的启动，正如通过膜起泡的开始来判断的那样，而是通过抑制通常迅速发生的细胞裂解来延长每个单独的细胞凋亡事件。重要的是，已经启动膜泡，但在ZVAD.fmk完成凋亡程序时被阻断的细胞不能通过抗凋亡生存因子的作用被挽救，因此似乎超出了死亡的承诺点。此外，ZVAD.fmk阻断的起泡细胞不分裂；它们没有克隆潜能，因此从其肿瘤潜能的角度来看，可能被视为“基因死亡”。这清楚地表明，与Bcl-2和生存因子等更上游的凋亡抑制剂不同，IRP抑制剂（无论是病毒性还是化学性）不会作为一般致癌物发挥作用，因为它们会抑制不可逆点下游的凋亡程序，在该点处，复制潜能会丧失。

总之，我们已经表明，癌基因调控解除、DNA损伤和Bcl-2家族成员Bak的表达都通过ZVAD.fmk抑制机制，可能是一种或多种IRP，诱导哺乳动物成纤维细胞凋亡。尽管如此，延时视频显微镜分析明确区分了Bcl-2或生存因子IGF-I的抗凋亡作用和IRP抑制作用。Bcl-2和IGF-I信号均抑制凋亡程序的启动，但对每个凋亡事件的动力学没有影响。相反，ZVAD.fmk对细胞凋亡的启动没有影响，这是由细胞膜起泡所决定的，但在完成之前阻止每个凋亡程序。这一观察结果提出了一个有趣的可能性，即膜泡是哺乳动物凋亡过程中运行的一个离散子程序，可通过IRP非依赖性机制导致细胞死亡。如果这是真的，这将限制IRP抑制剂的潜在治疗用途。然而，这种推测只能通过为每个IRP开发特定抑制剂以及对这些酶的细胞内靶点和动力学的更详细了解来验证。

致谢

我们感谢德里克·戴维斯（Derek Davies）的流式细胞仪分析，感谢安德鲁·爱德华兹（Andrew Edwards）博士和彼得·乔丹（Peter Jordan）对共焦显微镜的帮助，感谢纳赛尔·哈吉巴赫里（Nasser Hajibagheri）博士的电子显微照片，感谢我们在国际癌症研究基金会（ICRF）的同事们的建议、评论和支持。

本文中使用的缩写

4欧姆4-羟基他莫昔芬
巴西马克 t吨-丁氧羰基-甲磺酸氟甲酮
FLICE公司类似FADD的ICE
内燃机白细胞介素-1β转化酶
IGF公司胰岛素样生长因子
IRP公司ICE相关蛋白酶
机器MORT1相关CED-3同源物
MTT公司3-（4,5-二甲基噻唑-2-基）-2,5-二苯基四唑溴
PARP项目聚（ADP-核糖）聚合酶
无线电发射室温
ZVAD.fmk公司苄氧羰基-Val-Ala-Asp(O（运行）-甲基）-氟甲基酮

脚注

这项工作的一部分得到了G.I.Evan获得的MRC-DTI LINK奖以及G.I.Evan和N.J.McCarthy获得的协调行动拨款（编号BMH1-C794-1471）的支持。M.Whyte得到了Wellcome信托基金高级临床培训研究金（研究金编号：041759）的支持。我们还感谢主教斯托福德学校的学生们为纪念埃利奥特·史密斯、西蒙·雷尔顿、乔安娜·布里埃拉特而慷慨捐款，这项工作是献给他们的。

在证明中添加注释。可从以下网站获取快速电影，电影一显示无血清条件下c-Myc诱导的凋亡（电影一），电影二显示无血清和存在100μM zVAD.fmk的条件下c-Myc诱导的细胞凋亡（电影二）：http://www.icnet.uk/axp/bcn/

将所有信件发送给Gerard Evan，英国伦敦WC2A 3PX林肯酒店44号帝国癌症研究基金实验室细胞核实验室生物化学。电话：（44）171 269 3439。传真：（44）171 269 3230。电子邮件ku.tensi.frci@navE.G

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文章来自细胞生物学杂志由以下人员提供洛克菲勒大学出版社