《实验医学杂志》。2007年8月6日；204(8): 1863–1873.
第条
A CD8+旧大陆灵长类动物EB病毒及其近亲特异性T细胞免疫逃避蛋白
,1 ,2 ,2 ,1 ,2 ,2 ,1 ,三 ,1和2
安德鲁·希斯洛普
1英国伯明翰大学癌症研究所和MRC免疫调节中心，伯明翰Edgbaston，B15 2TT，英国
Maaike E.Ressing公司
2荷兰莱顿RC 2300莱顿大学医学中心医学微生物学系
达芙妮·范·吕文
2荷兰莱顿RC 2300莱顿大学医学中心医学微生物学系
维多利亚·A·普德尼
1英国伯明翰大学癌症研究所和MRC免疫调节中心，伯明翰Edgbaston，B15 2TT，英国
丹尼尔·霍斯特
2荷兰莱顿RC 2300莱顿大学医学中心医学微生物学系
Danijela Koppers-Lalic公司
2荷兰莱顿RC 2300莱顿大学医学中心医学微生物学系
内森·P·克罗夫特
1英国伯明翰大学癌症研究所和MRC免疫调节中心，伯明翰Edgbaston，B15 2TT，英国
雅克·奈夫杰斯
三荷兰癌症研究所肿瘤生物学部，荷兰阿姆斯特丹1066 CX
艾伦·B·里金森
1英国癌症研究所和英国伯明翰大学MRC免疫调节中心，英国伯明翰Edgbaston，B15 2TT
艾曼纽尔·威尔茨（Emmanuel J.H.J.Wiertz）
2荷兰莱顿RC 2300莱顿大学医学中心医学微生物学系
1英国伯明翰大学癌症研究所和MRC免疫调节中心，伯明翰Edgbaston，B15 2TT，英国
2荷兰莱顿RC 2300莱顿大学医学中心医学微生物学系
三荷兰癌症研究所肿瘤生物学部，荷兰阿姆斯特丹1066 CX
- 补充资料
【补充材料索引】
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摘要
γ1-疱疹病毒如EB病毒（EBV）具有独特的能力，可以通过潜在的生长转化感染在体内扩增病毒载量。它们是否像α-和β-疱疹病毒一样，主动逃避复制性（溶血性）感染的免疫检测仍是一个未知数。最近的工作促使我们重新考虑这个问题（Pudney，V.A.，A.M.Leese，A.B.Rickinson和A.D.Hislop，2005）。实验医学学报201:349–360; Ressing、M.E.、S.E.Keating、D.van Leeuwen、D.Koppers-Lalic、I.Y.Pappworth、E.J.H.J.Wiertz和M.Rowe。2005免疫学杂志。174:6829–6838）显示，当EBV感染的细胞在裂解周期中移动时，它们对EBV特异性CD8的易感性+T细胞识别率急剧下降，伴随着与抗原处理（TAP）功能和表面人类组织相容性白细胞抗原（HLA）I类表达相关的转运体减少。对EBV特有基因和旧大陆灵长类密切相关的γ1-疱疹病毒进行筛选，确定了一个早期EBV裂解周期基因BNLF2a，该基因可有效阻断抗原特异性CD8+当在体外靶细胞中表达时，通过HLA-A-、HLA-B-和HLA-C-限制等位基因识别T细胞。小（60氨基酸）BNLF2a蛋白通过与TAP复合物相互作用并抑制其肽和ATP结合功能来调节其作用。此外，主要组织相容性复合体I类通路的这种靶向性似乎在旧大陆灵长类γ1-疱疹病毒的BNLF2a同源物中是保守的。因此，即使获得具有独特生长转化能力的潜在周期基因，也不能使这些因子从逃避CD8的进化压力中解脱出来+T细胞对病毒复制灶的控制。
疱疹病毒是一个古老的病毒家族，其成员与宿主物种有着悠久的共同进化历史(1). 疱疹病毒生物学的一个特征是，通过允许细胞的生产性（溶解性）感染，通常在病毒传播的粘膜部位，将一个幼稚宿主定殖，然后在该宿主内作为另一种特殊细胞类型的非生产性（潜伏性）感染持续存在。通过下调潜伏感染细胞中所有病毒抗原的表达，实现了在现有免疫宿主中的持久性。随后，潜伏期的偶尔重新激活可以帮助在粘膜部位重新建立病毒复制的焦点，为传播给其他个体提供感染性病毒的来源。
在研究得最好的系统中，HSV是在神经元中建立潜伏期的α疱疹病毒亚家族的一员，如果病毒最初建立了高潜伏期的病毒基因组负荷，成功重新激活的可能性就会增加(2,三); 这反过来又取决于初始宿主初次感染期间最初实现的病毒复制水平(三,4). 因为主机CD8+T细胞反应是控制这种初始复制的主要手段，任何限制这种控制效率的因素都会对病毒有利。事实上，HSV是第一种携带CD8的疱疹病毒+T细胞逃避机制已被识别。这涉及HSV裂解周期的即时早期蛋白ICP47，它通过充当防止肽结合和转运的假底物来抑制与抗原处理（TAP）相关的肽转运蛋白。因此，TAP不能将细胞质中蛋白酶体消化的潜在抗原肽泵入内质网，以装载到MHC I类分子上(5,6). 其他严重依赖病毒复制来建立潜伏病毒载量的疱疹病毒，如人类和小鼠巨细胞病毒β亚家族，也被发现具有几个CD8+针对TAP或MHC I类组件的T细胞回避机制(7,8).
淋巴隐病毒（LCV）是最近进化出的（γ1）疱疹病毒属，其成员仅在旧大陆和一些新大陆灵长类物种中发现，其原型是人类EBV，情况尚不明朗。这些病毒经口传播，在口咽上皮部位复制，并在B淋巴细胞中建立潜伏期（综述见参考文献9). 当LCV首次定植B细胞系统时，LCV利用其独特的生长转化能力直接驱动潜在感染的B细胞的扩张，只有在随后下调潜在抗原的表达，才能建立记忆B细胞池的免疫沉默感染(10). 这种独立于溶血病毒复制而扩大潜伏感染细胞库的能力引发了关于LCV是否可以在较低的免疫压力下逃避T细胞对溶血周期的控制的争论(11).
EBV系统的两个最新发现促使我们回到这个问题上来，这两个发现都暗示了在裂解周期中存在积极的免疫逃避策略。首先，体外高效感染EBV的细胞显示HLA I类下调和TAP功能降低(12). 第二，使用CD8对溶血感染的靶细胞进行体外检测+对早期、早期或晚期表达的EBV抗原具有特异性的T细胞克隆表明，随着裂解周期的进展，其表现较差(13). 在本文中，我们表明EBV和其他旧世界LCV确实获得了一种专门针对肽转运蛋白TAP的回避策略，从而限制了MHC I类分子的抗原片段供应，并最终限制了其向CD8的呈现+T细胞。
结果
抑制CD8的γ1-疱疹病毒特异性裂解周期基因的筛选+T细胞识别
我们推断，任何与EBV复制相关的特定免疫逃避功能都很可能映射到限制于γ1-疱疹病毒（LCV）属的裂解周期基因。HSV、CMV和卡波西肉瘤相关疱疹病毒、原型α、β和γ2人类疱疹病毒的基因组序列与两种旧世界γ1病毒（EBV和恒河猴LCV）的基因组序列以及最近发现的新世界猴γ1病毒进行了比对。这确定了旧世界病毒中存在的11个LCV特异基因，其中一些也在新世界病毒中发现。这11个基因中有4个位于EBV基因组的中心位置；其中2个BLLF1和BZLF2编码已知参与B细胞进入的病毒发育糖蛋白，而另2个BLLF2和BHLF1特别令人感兴趣，因为它们的功能未知。其他七个LCV特异性基因均位于EBV基因组右端的35-kb区域内，并在如所示的基因组图中被确定为开放区其中两个基因BARF1和BALF1分别与细胞CSF-1受体和bcl2基因具有同源性，这意味着除了拦截抗原处理途径之外还有其他功能，而第三个基因LF3在B95.8病毒株中被删除，该病毒株在裂解周期中显示HLA I类下调。该区域剩余的独特基因BNLF2a、BNLF2b、BILF1和BILF2与BLLF2和BHLF1一起被选作进一步研究。
已测序的γ1-疱疹病毒右端的图解对齐。EBV、恒河猴LCV和绒猴LCV的ORF显示为方框；封闭符号表示在其他疱疹病毒中具有同源物的ORF；开放符号表示仅在γ1-疱疹病毒中发现的基因；阴影符号代表潜在基因。
所有六个基因分别克隆到重组痘苗病毒载体中，HSV的免疫逃避基因ICP47作为阳性对照。然后测试这些重组体抑制CD8的能力+当将T细胞与编码指示靶抗原的第二种痘苗载体一起引入靶细胞时，T细胞被杀死。这些实验是在EBV在体内自然感染的两种细胞类型即上皮细胞和B淋巴细胞中进行的。（上图）展示了使用EBV核抗原（EBNA）3A作为靶抗原和CD8在HLA-B*0801阳性上皮细胞系SVK中进行的代表性检测的结果+HLA-B*0801限制性EBNA3A表位特异性T细胞克隆作为效应器。上述六种EBV基因之一BNLF2a的表达降低了CD8的水平+T细胞杀伤几乎达到背景水平，阳性对照ICP47也是如此。其他测试的EBV基因（包括BILF2、BLLF2和BHLF1；未描述）均未产生这种效果。（底部）显示了在EBV转化的B淋巴母细胞系（LCL）中进行的基本相似的分析的数据。在这种情况下，细胞被一种痘苗病毒感染，该病毒编码EBNA3C蛋白的一种不变链标记形式，作为指示抗原，由HLA I类和II类通路处理，从而使CD8+和CD4+在同一靶细胞上同时检测T细胞识别。如所示（中间），BNLF2a（和ICP47）的表达减少了HLA-B*2705限制性EBNA3C特异性CD8对靶细胞的杀伤+T细胞克隆至未经处理的LCL靶点的背景水平。该背景水平代表了对来自EB病毒常驻基因组表达的EBNA3C的先前存在表位的识别。相比之下，牛痘BNLF2a或任何其他被测蛋白均未对DQ5限制性EBNA3C特异性CD4的不变链标记EBNA3Cs的表达产生任何影响+T细胞克隆(，底部）。
代表性细胞毒性试验测试对EBV独特基因和靶蛋白共存的靶细胞的识别。（A） 在与HLA-B*0801限制性CD8孵育之前，用表达EBNA3A（vAntigen）的痘苗病毒和表达EBV特有基因的指示病毒的组合或缺乏插入基因的对照痘苗病毒（vTk−）感染上皮细胞（top）+EBNA3A特异性T细胞克隆。EBV转化的B细胞（中间和底部）与表达不变链靶向EBNA3C（vAntigen）的改良安卡拉痘苗病毒和痘苗病毒的指示组合共同感染。在平行分析中，感染的B细胞与HLA-B*2705限制性CD8孵育+EBNA3C（中间）或CD4特异性T细胞克隆+EBNA3C特异性HLA DQ5限制的T细胞克隆（底部）。（B） EBV转化的B细胞被表达BNLF2a的痘苗病毒感染，不同的EBV抗原通过一系列HLA类型显示编码表位（vAntigen）。感染的细胞与同源CD8一起孵育+对BMLF1编码的HLA-A*0201表位、BMRF1编码的HLA-A*2402表位、EBNA2编码的HLB-B*38表位、EBNA3B编码的HLA-B*2705表位、BZLF1编码HLA-B*0801表位或BGLF4编码的HLC-C*0101表位具有特异性的T细胞。误差条表示平均值±SD。
显示了使用具有不同HLA等位基因的EBV转化B细胞系进行的后续实验的结果，以评估BNLF2a对CD8的任何等位基因特异性影响+T细胞识别。这些分析使用了几种不同的EBV潜伏（EBNA2和EBNA3B）和裂解（BMLF1、BMRF1、BZLF1和BGLF4）靶抗原，这些靶抗原编码在HLA-A（A*0201和A*2402）、HLA-B（B*0801、B*2705和B*3801）和HLA-C（C*0101）分子的上下文中识别的表位。在整个实验过程中，我们观察到BNLF2a显著抑制靶细胞杀伤().
EBV BNLF2a引起细胞表面HLA I类下调
确定BNLF2a介导的CD8抑制的机制+通过逆转录病毒转导，在黑色素瘤细胞系MelJuSo（MJS）中表达含有血凝素（HA）表位标签（BNLF2aHA）的T细胞识别BNLF2a。最初，我们对转导的细胞进行细胞毒性试验，以确认逆转录病毒介导的MJS细胞中BNLF2aHA的表达再现了前一节所述的BNLF2a诱导的表型。显示了以表达BNLF2aHA或GFP的HLA-B*0801阳性MJS细胞为靶点的细胞毒性试验结果。表达EBV BZLF1抗原的重组痘苗病毒感染MJS细胞导致BZLF1-特异性CD8识别+T细胞(，顶部），但在BNLF2aHA-表达MJS细胞中已废除(，底部）。然而，当目标细胞被来自BZLF1的相关合成表位肽（RAKFKQLL）敏化时，无论是否存在BNLF2a，细胞都被同样好地溶解(). 这些数据表明，BNLF2a阻断了抗原的呈递，这些抗原在呈递给HLA I类限制性T细胞之前需要内源性处理。
BNLF2a的表达阻止CD8+通过破坏抗原呈递来识别T细胞。（A） MJS细胞逆转录表达BNLF2aHA（底部）或对照GFP（顶部）。这些细胞要么被表达BZLF1或对照TK−病毒的痘苗病毒感染，要么在与CD8孵育之前用RAKFKQLL肽或DMSO作为对照进行敏化+在5小时细胞毒性试验中，对BZLF1编码的RAKFKQLL表位具有特异性的T细胞。误差条代表平均值±SD。（B）相同细胞系的流式细胞术直方图显示HLA I类（B9.12.1）和HLA II类（L243）的表面染色，或用同型对照进行染色。（C） 用SDS-PAGE分离两个细胞系的裂解产物，并用HA标签（12CA5）、TAP1（148.3）、TAP2（435.4）、tapasin（7F6）、HLAⅠ类重链（HC10）和HLAⅡ类DRα链（DA6-147）特异性抗体进行免疫印迹分析。
因为在生产性EBV感染期间发现HLA I类水平显著降低(12)，我们接下来检查BNLF2a的表达是否影响HLA分子的显示(). 在转导的MJS细胞表面，与对照细胞相比，BNLF2aHA-表达细胞的HLA I类水平显著降低。这是一种特殊的效果，因为HLAⅡ类的表达()转铁蛋白受体（未描述）未受影响。
表面HLA I类分子的下调可能是由于病毒在I类抗原提呈途径的特定阶段的干扰所致，可能涉及HLA I级分子和HLA I型肽负载复合物的其他成分的降解(7,8). 为了研究BNLF2a是否影响HLAⅠ类肽装载复合物成分的水平，对BNLF2aHA或对照转导的MJS细胞的裂解物进行TAP1、TAP2、tapasin和HLAⅠ级蛋白的Western blot分析，在这些蛋白的稳态水平上未观察到显著差异(). 因此，尽管表面HLA I类水平降低，但表达BNLF2aHA的细胞含有相似水平的HLA I级肽负载复合物的主要成分。
EBV BNLF2a通过TAP阻断肽转运
表面HLAⅠ类下调也可能是由于内质网中新生HLAⅠ级分子的肽供应减少所致。这又取决于蛋白酶体和其他肽酶有效生成肽，以及TAP复合物将这些肽运输到内质网。在已进入病毒裂解周期的EBV感染的B细胞中，表面HLA I类下调与TAP减少肽转运相一致(12). 为了评估BNLF2a对HLA I类表达的抑制是否涉及对TAP功能的干扰，我们使用体外肽移位试验来检测BNLF2aHA-表达和对照MJS细胞中的TAP活性。在对照细胞中，荧光模型肽以ATP依赖的方式有效地转运通过内质网膜。相比之下，BNLF2aHA-表达细胞中的肽移位受到严重损害().
EBV BNLF2a通过TAP阻断肽转运。（A） 通过用链球菌溶血素O使细胞渗透，并在有或无ATP的情况下用荧光肽培养细胞，评估BNLF2aHA-表达和对照MJS细胞中TAP依赖性肽的转运。通过对伴刀豆球蛋白A-sepharose珠的吸附，回收内质网中已糖基化的转运肽。洗脱后，用荧光法以任意单位对回收的肽进行定量。误差条表示在代表性实验中三等分的SEM。（B） 用TAP1（148.3）、TAP2（435.4）、tapasin（R.gp46C）、HLA I类重链（HC10）和HLA II类DRα链（DA6-147）特异性抗体对表达BNLF2aHA和对照MJS-GFP细胞的降钙素裂解物进行免疫沉淀（IP）。用SDS-PAGE分离细胞裂解物和免疫复合物，然后用Western blot分析和抗HA抗体（12CA5）染色检测HA标记的BNLF2a。
接下来，我们通过共免疫沉淀实验研究BNLF2a是否与肽负载复合物相关。使用温和的去污剂洋地黄素对BNLF2aHA表达细胞或对照细胞进行裂解，以保持蛋白质-蛋白质的相互作用。从裂解物中免疫沉淀TAP1、TAP2、tapasin和HLA I类分子，并用HA特异性单克隆抗体探测所有沉淀以检测BNLF2aHA。显示BNLF2a与TAP1、TAP2、tapasin和HLA I类分子共沉淀，但不与HLA II类和转铁蛋白受体共沉淀（用作对照；未描述TfR数据）。
EBV BNLF2a通过阻止肽和ATP的结合来阻断TAP功能
TAP介导的肽向内质网的移位是由肽与TAP胞浆肽结合域的相互作用启动的，随后是ATP的结合和水解，这有助于跨膜孔的开放和肽移位(14,15). 因此，我们评估了BNLF2aHA对这些肽转移步骤的影响。通过将含有光活化交联剂的放射性标记肽与来自BNLF2aHA-表达或控制MJS细胞的微粒体孵育，检测肽在BNLF2a存在下与TAP结合的能力。多肽通过紫外线辐射与其结合伙伴共价连接，然后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。在对照MJS细胞中，观察到与TAP共价连接的放射性标记肽(; 在所描述的定量中表示为100%)而这些肽未能结合BNLF2aHA-表达细胞微粒体中的TAP(). 作为特异性对照，微粒体与放射标记的报告肽和来源于HSV-1 ICP47蛋白的未标记肽共同孵育，已知该蛋白可阻止肽与TAP结合(16,17). 在存在ICP47肽的情况下，未观察到放射性标记肽与TAP的结合().
EBV BNLF2a抑制肽和ATP与TAP的结合。（A） 由BNLF2aHA-表达和对照MJS细胞制备的微粒体与放射性标记的模型肽孵育；如有指示，此培养中包含过量的ICP47竞争性肽。在UV交联后，微粒体被裂解，蛋白质被SDS-PAGE分离，并暴露在磷化成像屏上。箭头显示了平行免疫沉淀实验中TAP1迁移的位置。星号表示非特定背景带。（B） 代表TAP结合肽的三条重复带的定量。结果显示为对照MJS细胞中肽结合相对于肽结合的百分比（设置为100%）。误差条代表平均值±SD。（C）用ATP-琼脂糖珠培养MJS-BNLF2aHA和对照MJS-GFP细胞的数字素和NP-40裂解物。用SDS-PAGE和免疫印迹法分离ATP-琼脂糖结合（颗粒）和未结合（上清液）蛋白质组分。用TAP1（148.3）、TAP2（435.4）、tapasin（7F6）、HLAⅠ类重链（HC10）和HA标签（12CA5）的特异性抗体检测细胞膜。
接下来我们询问BNLF2a是否也可能影响ATP与TAP的结合。BNLF2aHA转导或对照细胞的裂解液使用去污剂洋地黄素（保留肽负载复合物内的蛋白质相互作用）或1%NP-40（从TAP中释放HLA I类、tapasin和BNLF2a）制备（见本节下文）。通过与ATP-琼脂糖珠培养和造粒，从裂解液中纯化出能够结合ATP的蛋白质；对这些组分以及非结合上清液（游离）组分进行Western blot分析，以确定是否存在TAP1、TAP2、tapasin、HLA I类或BNLF2aHA。在对照细胞中，ATP与溶解在洋地黄素或NP-40中的TAP亚单位结合(而tapasin和HLA I类分子仅与从洋地黄裂解物中回收的ATP-结合的TAP共分离(，将车道1与车道3进行比较）。相反，来自表达BNLF2aHA的细胞的洋地黄苷裂解物的ATP结合部分几乎不包含肽负载复合物的四种成分(，泳道2），表明EBV蛋白抑制ATP与TAP蛋白的相互作用。因此，在ATP-琼脂糖颗粒部分（通道2）中未检测到BNLF2aHA，但在BNLF2a转导的MJS细胞的上清液部分（通道6）中存在。有趣的是，在NP-40裂解液中从TAP中释放出BNLF2a，这恢复了TAP亚单位的ATP结合能力，这意味着BNLF2a与TAP的低亲和力相互作用阻止了与ATP-琼脂糖珠的结合（通道4）。
BNLF2a同源物由其他旧世界γ1灵长类疱疹病毒和下调HLA I类表达编码
由于早期的基因组比对表明，恒河猴LCV基因组中存在BNLF2a同源基因，我们继续对狒狒（丘脑疱疹病毒）、黑猩猩（泛疱疹病毒），猩猩（猩猩疱疹病毒）和大猩猩（大猩猩疱疹病毒。每个病毒基因组都包含一个等效的BNLF2a开放阅读框（ORF）。显示了这些同源蛋白以及EBV和恒河猴LCV的预测氨基酸序列。这些蛋白质显示出53%到63%的整体一致性，并具有相似的特征；它们是59–60个氨基酸的小蛋白质，每个蛋白质都有一个疏水性C末端和序列保守的非疏水性区域中的几个位点。使用基本局部比对搜索工具等程序进行的同源性或比对搜索显示，与数据库中的任何其他蛋白质（未发布的数据）都没有明显的匹配。
旧大陆灵长类γ1-疱疹病毒BNLF2a序列和功能。（A） 对所示疱疹病毒的BNLF2区域进行了测序，并显示了BNLF2a基因的预测氨基酸序列。黑色区域代表不同BNLF2a物种之间的同源区域，而灰色区域代表保守的氨基酸变化。（B） 将BNLF2a基因亚克隆到共表达GFP的质粒表达载体中，并将其瞬时转染到MJS细胞中。48小时后，通过相关抗体染色和流式细胞仪分析细胞，评估GFP阳性细胞的HLA I类和II类表面水平。黑色直方图表示转染相关BNLF2a的细胞的表面标记强度，而开放直方图则表示转染空载体质粒的细胞的强度。
为了检测非人类LCV中的BNLF2a同源物是否保留了BNLF2a-like功能，在CMV即刻早期启动子的控制下将相关编码序列导入质粒表达载体，并瞬时转染到人类MJS细胞系。质粒构建物被设计成使用内部核糖体进入位点（IRES）元件共表达GFP，以鉴定转染细胞。显示了转染来自EBV、恒河猴LCV、泛疱疹病毒（注意，泛和猩猩BNLF2a基因具有相同序列）或大猩猩疱疹病毒的BNLF2a基因的MJS细胞的流式细胞计量分析。作为对照，对细胞进行表面HLAⅠ类或表面HLAⅡ类染色。在每种情况下，来自不同病毒的BNLF2a的表达可重复地导致表面HLAⅠ类的下调，下调程度取决于基因来源的物种，而HLAⅡ类水平则不受影响。
随后，我们用不同的BNLF2a基因转染其他可用的旧大陆灵长类细胞系，并像以前一样测量转染细胞的表面MHC I类水平，从而扩展了这些研究。图S1（可从以下网址获得http://www.jem.org/cgi/content/full/jem.20070256/DC1)显示了转染LLC-MK2细胞（恒河猴）、用内源性猩猩疱疹病毒（猩猩LCL）转化的猩猩B细胞和Cos细胞（非洲绿猴）的MHC I类染色直方图。所有BNLF2a表达构建物在LLC-MK2细胞和Cos细胞中均显示表面MHC I类下调，在转化的猩猩LCL中观察到更细微的下调。因此，各种LCV BNLF2a蛋白的抑制作用似乎在旧大陆灵长类动物起源的各种细胞中得以保存和发挥作用。
讨论
这项研究是由最近的工作推动的(13)CD8对靶细胞识别的研究+特异于EB病毒裂解周期抗原的T细胞克隆。这表明，使用克隆对直接早期抗原的识别效率最高，对早期抗原的克隆识别效率较低，对晚期抗原特异性效应器的识别效率更低，尽管后者在表位肽滴定分析中具有最高的亲和力(13). 因此，随着细胞在溶解周期中的移动，抗原处理功能似乎逐渐受损。两个观察结果反驳了这是与病毒复制相关的一般细胞病理学的次要影响。因此，在体外B淋巴细胞中，有一小部分细胞进入裂解周期，处于病毒复制后期的细胞似乎可以存活数天。更重要的是，在包括HLA II类在内的其他表面蛋白受到影响之前，溶血感染细胞的表面HLA I类水平在周期的早期阶段开始下降(12). 这意味着EBV正在积极阻止CD8的裂解周期抗原提呈+T细胞。
注意到疱疹病毒家族中的免疫逃避策略往往是病毒亚科或属特异性的，我们重点研究了γ1属特有的六个裂解周期基因，这些基因的功能未知。这确定了一个这样的基因，BNLF2a，编码CD8免疫逃避蛋白。当在靶细胞中从痘苗载体表达时，BNLF2a蛋白可重复地抑制CD8对各种指示抗原（EBV潜伏和裂解周期蛋白）的识别+T细胞克隆受几个HLA-A、-B和-C等位基因限制。相反，BNLF2a表达细胞中的II类抗原呈现保持完整，只有HLA I类通路的呈现受到阻碍。发现BNLF2a蛋白通过阻断肽和ATP与TAP复合物的结合而发挥作用，从而损害HLA I类分子的肽负载及其在细胞表面的表达。
值得注意的是，BNLF2a转录物最初出现在裂解周期的早期，在B细胞系裂解周期诱导后8-12小时达到峰值(18). 大多数EBV裂解周期转录物在BNLF2a表达后的晚期表达，此时蛋白的作用可能已经得到很好的证实。这可以解释为什么晚期蛋白处理得不好，并被溶血感染的细胞呈现。相反，在BNLF2a之前的第一波病毒基因表达中表达的两种即时早期蛋白BZLF1和BRLF1被其同源T细胞有效识别(13). 在我们之前的研究中，四种早期抗原的呈现效率较低(13)很可能反映了这样一个事实，即它们在BNLF2a的抑制作用达到最佳之前表达。已知这些抗原是由BZLF1/BRLF1诱导的，因此，在立即的早期到早期转变后很快就会出现，可能就在BNLF2a表达之前(19–23).
值得注意的是，BNLF2a的作用如何解释裂解抗原诱导的CD8的高度偏斜组成+T细胞对EBV感染的反应，其中在裂解周期中，在裂解周期之前或最晚表达的抗原与BNLF2a一致，构成了迄今为止最主要的靶点。因此，当我们推导CD8时+扩增CD8的T细胞克隆+在IM患者群体中，我们经常以一种无偏见的方式鉴定出两种即时早期蛋白和一小部分早期蛋白的强CD8反应性，但很少鉴定出其他早期蛋白或任何分析过的晚期蛋白(11,13). 类似地，当从类风湿关节炎患者的关节中克隆T细胞并对EBV-cDNA表达库进行测试时，只检测到对即刻早期或少量早期蛋白特异的T细胞(24,25). 因此，很少有人描述过对晚期蛋白质的反应，当它们发生时，这些反应是微弱的(26). 然而，原则上，在启动CD8期间，所有裂解循环蛋白都应作为外源性抗原，供树突状细胞交叉呈现+T细胞反应。我们推断，启动后，立即早期和早期抗原特异性反应的次顺序数量优势反映了启动的CD8之间直接接触的重要性+T细胞和溶血感染的靶细胞选择性地扩增对这些靶细胞上呈现的表位的反应。
BNLF2a是一组基因中的一个，包括另外两个具有免疫调节功能的基因，BCRF1（病毒IL-10同源物）和BARF（病毒GCSF-受体），这两个基因是由旧大陆灵长类γ1病毒获得的，但目前为止分析的新大陆γ1病毒中没有这些基因(27,28). 这意味着在过去5000万年左右的时间里，在旧世界/新世界灵长类进化的分岔之后，灵长类动物获得了进化。在同一时期，旧大陆灵长类病毒也获得了一组更复杂的潜在生长转化基因。因此，与新世界病毒相比，旧世界病毒在宿主人群中的流行率明显更高，这可能是由于这些更复杂的免疫渗透和生长转化策略的结合所致(29).
BNLF2a是在γ1-疱疹病毒中发现的第一个TAP特异性抑制剂，与迄今为止发现的其他三个疱疹病毒TAP抑制剂一样，BNLF2a有其独特的结构和作用机制。α亚家族成员的单纯病毒和水痘病毒使用不同的策略灭活TAP。单纯疱疹病毒HSV1和2编码一种小的胞浆蛋白ICP47，它是肽与TAP结合的高亲和力竞争对手，但不影响ATP与转运蛋白复合物的结合(5,6,17,30,31). 相比之下，水痘病毒牛疱疹病毒1及其几个近亲编码UL49.5基因产物，这使得TAP易位不合格，而不影响其结合肽或ATP的能力(32,33). 最终，牛疱疹病毒1型UL49.5通过蛋白酶体降解TAP1和TAP2(32,33). 就β-疱疹病毒而言，该亚家族的原型病毒人类CMV通过跨膜蛋白US6的内质网腔域抑制TAP功能。该蛋白减少ATP与TAP1的结合并促进与TAP2的结合，但不干扰肽结合，也不影响转运蛋白复合物的稳定性(34–38). 对于γ2疱疹病毒，小鼠γ−疱疹病毒68，TAP被病毒编码的泛素连接酶mK3次级靶向缓慢降解，其主要功能是快速靶向MHCⅠ类重链以进行蛋白酶体降解(39–46).
与其他疱疹病毒中所述的TAP抑制剂不同，BNLF2a通过阻断肽与肽结合位点的结合以及ATP与转运体核苷酸结合域的相互作用来禁用TAP功能。这种由42个残基的亲水性N末端结构域和18个残基的疏水性结构域组成的60个氨基酸的小蛋白是如何实现这两种功能的，目前尚不清楚。尽管没有明显的N端信号序列，但初步数据表明BNLF2a是膜相关的（未发表的数据）。这可能是与TAP结合的结果，也可能是翻译后疏水性C末端插入内质网膜的结果，其他蛋白质也有报道(47). BNLF2a的小尺寸以及TAP的肽和ATP结合位点之间的相对距离可能会阻止BNLF2a直接作用于这两个位点。然而，细胞溶质中BNLF2a的N末端的预期暴露表明，该部分与TAP复合物的细胞溶质域相互作用。然后，BNLF2a可直接干扰肽或ATP结合，同时通过间接机制（例如，通过抑制TAP复合物正常功能所需的构象转换）干扰易位循环的后续步骤。
感染细胞逃避CD8的能力+当抗原处理途径的多个点被病毒免疫逃避蛋白靶向时，T细胞识别可能是最有效的。在HSV2感染细胞的情况下，两种病毒蛋白，即TAP抑制剂ICP47和UL-41编码的宿主关闭蛋白，已被证明协同作用以防止CD8+T细胞裂解(48). 在这种感染模型中，长期存活的TAP复合体在短期内不太可能受到病毒宿主关闭功能的影响。因此，感染了缺乏这两个基因中任何一个的变异HSV病毒的细胞显示出对CD8的部分抑制+T细胞功能，而感染了表达这两种基因的病毒的细胞被CD8裂解的能力显著降低+T细胞。在这方面有趣的是，最近发现了EBV编码的基因BGLF5，该基因至少是一个负责宿主蛋白质合成关闭的基因(49). BGLF5的表达足以抑制宿主蛋白的合成，包括HLA I类分子，导致表面I类水平的降低。EBV共表达BNLF2a和BGLF5可能是抑制HLA I类抗原处理途径的有效策略(12).
总之，原型γ1疱疹病毒EBV避开CD8+通过一种在分子细节上独特的策略检测溶血周期中的T细胞，该策略同时针对抗原提呈，即TAP介导的肽转运，这是其他几种疱疹病毒的目标。事实上，由不同疱疹病毒属编码的TAP抑制剂没有明显的同源性，这是一个收敛进化的显著例子。它们的存在证明了CD8对许多疱疹病毒施加进化压力的强度+T细胞对病毒复制感染的反应。目前的研究表明，尽管EBV和旧世界γ1疱疹病毒的亲属能够通过非复制性潜伏感染在体内扩增病毒载量，但他们确实受到了相同的免疫压力。
材料和方法
CD8（CD8）+T细胞克隆、痘苗病毒和细胞毒性试验。
EBV特异性CD8+如前所述，通过限制稀释克隆从传染性单核细胞增多症患者的PBMC中生成T细胞克隆(11). CD8（CD8）+本研究中使用的T细胞克隆对来自相应EBV基因产物的以下表位具有特异性：来自BZLF1的RAKFKQLL和来自EBNA3A的QAKWRLQTL（均由HLA-B*0801提出[50,51])，来自BMLF1的GLCTLVAML（由HLA-A*0201提出[11])，来自BMRF1的CYDHAQTHL（由HLA A*2402提交[13])，来自EBNA2的YHLIVDTDSL（由HLA-B*38呈现[52])，来自EBNA3B的HRCQAIRKK（由HLA-B*2705提交[53])，和来源于BGLF4的未定义表位（由HLA-C*0101呈递[13]). CD4细胞+如前所述，通过刺激来自健康供体的PBMC及其自身EBV转化的B细胞系，并限制稀释克隆这些细胞，产生EBNA 3C HLA DQ5抗原表位SDDELPYIDPNMEP的特异性T细胞克隆(54). 所有实验均由南伯明翰卫生局地方研究伦理委员会批准。如前所述，重组痘苗病毒用于表达单个EBV B95.8株基因，而缺乏插入物的痘苗病毒（vTk−）用于控制感染(13,54). 细胞毒性试验中感染痘苗病毒的靶细胞是SV40转化的角质形成细胞、HLA匹配的EBV转化的B LCL或黑色素瘤细胞系MJS（HLA-A*01、-B*08和-Cw*07）(55). 目标细胞以10倍的感染率感染痘苗病毒，孵育16小时，并在标准的5小时铬释放试验中用作靶细胞。如图所示，在用于细胞毒性分析之前，用5μM浓度的合成CTL表位肽（Alta Biosciences）对靶细胞进行90分钟的敏化。
抗体。
本研究中使用的抗体已在其他地方进行了描述(32,55). 用于检测人类细胞蛋白的小鼠单克隆抗体如下：W6/32或B9.12.1，可识别β2-微球蛋白相关HLA I类复合物（免疫技术）；HC10（由马萨诸塞州剑桥市怀特海生物医学研究所H.Ploegh提供），针对HLA I类重链；抗HLA-DR单克隆抗体L243（美国型培养物集）；DA6-147，针对HLA-DRα链（由P.Cresswell、霍华德·休斯医学院、耶鲁大学医学院、康涅狄格州纽黑文提供）；分别由R.Tampe、Johann Wolfgang Goethe-University（德国法兰克福）和P.van Endert（法国巴黎Hopital Necker）提供。使用的抗tapasin抗体是针对C末端区域的兔血清R.gp46C（由P.Cresswell提供）和鼠单克隆抗体7F6（由R.Tampe提供）。为了检测HA标记的BNLF2a，使用流感特异性单克隆抗体12CA5（Roche Diagnostics）。
细胞系的逆转录病毒转导。
将BNLF2a基因克隆到pLZRS逆转录病毒载体中，构建逆转录病毒构建物。紧邻该基因下游的是IRES，它允许共同表达标记基因，即截断的神经生长因子。在C末端修改BNLF2a序列，编码四种蛋氨酸和流感HA表位，以便检测（表示为BNLF2aHA）。如前所述，使用Phoenix包装细胞系生产病毒并用于转导MJS细胞(55). 作为对照，用表达IRES-GFP的逆转录病毒转导MJS细胞。
表面HLAⅠ类和Ⅱ类的流式细胞术分析。
用抗体W6/32或B9.12.1（I类分子）或L243（II类分子）染色后，通过流式细胞仪分析测定HLA I类和II类分子的表面水平。在所有病例中，用适当的同型对照物对等分细胞进行染色，并用山羊抗小鼠藻红蛋白抗体检测结合抗体。染色细胞在流式细胞仪（Epics；Beckman Coulter）上进行分析，并使用Win MDI软件（斯克里普斯研究所）处理数据。
肽转运分析。
TAP介导的肽转运试验通过3×10的等分样品渗透进行6含有2.5 IU/ml链球菌溶血素O（Murex Diagnostics）的MJS细胞，并将这些细胞与200 nmol荧光肽CVNKTERAY（由荷兰莱顿莱顿大学医学中心W.Benckhuijsen和J.W.Drijfhout提供）在37°C有或无10 mM ATP的条件下培养10分钟。用冰冷裂解缓冲液（1%Triton X-100，500 mM NaCl，2 mM MgCl）裂解细胞终止转运2，50 mM Tris HCl，pH 8），通过离心法去除细胞核。通过与伴刀豆球蛋白A–sepharose珠培养，从裂解物中分离出内质网中已糖基化的肽（GE Healthcare）。用500 mM甘露吡喃苷、10 mM EDTA、50 mM Tris HCl、pH 8从珠中洗脱这些肽，并使用荧光板阅读器（细胞荧光；PerSeptive Biosystems）检测荧光。
蛋白质印迹分析和免疫沉淀。
如前所述，进行SDS-PAGE和免疫印迹(32,56). 用1%NP-40或1%洋地黄素在50 mm Tris HCl、pH 7.5、5 mm MgCl中制备，对转染表达BNLF2aHA或GFP的逆转录病毒的MJS细胞进行裂解2、150 mM NaCl、1 mM亮氨酸肽和1 mM 4-（2-氨基乙基）苯磺酰基氟化物。溶解蛋白质的裂解物，相当于2×105细胞通过SDS-PAGE分离并转移到聚偏二氟乙烯膜（GE Healthcare）。通过将膜与特定抗体孵育，然后再与辣根过氧化物酶（HRP）结合次级抗物种抗体孵育来检测感兴趣的蛋白质（Jackson ImmunoResearch Laboratories）。使用ECL Plus（GE Healthcare）观察结合HRP标记的抗体。
对于免疫沉淀实验，用1%洋地黄素溶液制备的细胞裂解物与不同的特异性抗体在4°C下孵育至少2 h。使用蛋白G–sepharose珠（GE Healthcare）分离免疫复合物，用0.1%洋地黄素洗涤免疫复合物并进行Western blot分析。根据制造商的说明，使用ExactaCruz（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）检测结合印迹蛋白的抗体。
肽结合测定。
从用BNLF2aHA或GFP转导的MJS细胞制备含有TAP的微粒体膜，方法是用细胞裂解器（EMBL）对细胞进行均质化，并通过离心去除细胞核。肽与微粒体中TAP复合物结合的能力通过与125I标记肽5PS2（ERYDKSE-[BPA]-L[57])在不存在或存在2.5μM未标记HSV-1 ICP47竞争肽的情况下，含有光活化交联剂(16). 在冰上孵育15分钟后，用PBS清洗微粒体，并使用带汞灯（第38段；西尔瓦尼亚）的紫外线灯（B-100A；Blak-Ray）在距离2厘米的冰上紫外线照射10分钟，以共价连接肽-蛋白质相互作用。样品通过SDS-PAGE分析，结合肽通过磷酸成像定量。肽结合TAP1的迁移被免疫沉淀证实。
ATP-琼脂糖结合试验。
如Western blot分析和免疫沉淀所述，用1%洋地黄素或1%NP-40裂解用BNLF2aHA或GFP转导的MJS细胞。去除细胞核，并将裂解物与水合C-8 ATP-琼脂糖珠（13-μM；最终浓度；Sigma-Aldrich）在4°C下孵育2 h。离心珠以提供上清液部分和颗粒部分。用500 mM EDTA洗脱与ATP-琼脂糖颗粒部分结合的蛋白质，并用Western blot分析这些蛋白质以及上清液部分。
致谢
我们感谢Paul Lehner提供的有用建议和试剂。
这项工作得到了英国医学研究委员会（Medical Research Council UK）的项目拨款、荷兰癌症协会（Dutch Cancer Society）的UL 2005-3259拨款（给D.Horst）、皇家艺术与科学学院（Royal Academy of Arts and Sciences）的M.W.Beijerinck病毒学基金（M.E.Ressing）、荷兰科学研究组织（Netherlands Organisation for Scientific Research）的Vidi 917.76.330，荷兰糖尿病研究基金会（D.Koppers-Lalic）和美国国立卫生研究院AI26296拨款。
作者没有相互冲突的经济利益。
笔记
使用的缩写：EBNA，EBV核抗原；HA、血凝素；IRES，内部核糖体进入位点；淋巴母细胞系；LCV，淋巴隐病毒；MJS、MelJuSo；ORF，开放式阅读框；TAP，与抗原处理相关的转运体。
A.D.Hislop和M.E.Ressing对这项工作做出了同样的贡献。
参考文献
1McGeoch，D.J.、F.J.Rixon和A.J.Davison。2006年，疱疹病毒基因组学与进化专题。病毒研究。
117:90–104.[公共医学][谷歌学者] 2Sawtell，N.M.1998年。随着神经节内潜伏感染神经元的数量增加，单纯疱疹病毒1型在体内重新激活的可能性增加。J.维罗尔。
72:6888–6892.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 三。新墨西哥州索特尔、R.L.汤普森、L.R.斯坦伯里和D.I.伯恩斯坦。2001.在原发性单纯疱疹病毒感染期间，早期进行大剂量阿昔洛韦治疗可减少潜伏期和随后体内神经系统的再激活。J.感染。数字化信息系统。
184:964–971.[公共医学][谷歌学者] 4Sawtell，N.1997年。单细胞水平单纯疱疹病毒潜伏期的综合量化。J.维罗尔。
71:5423–5431.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5Hill，A.、P.Jugovic、I.York、G.Russ、J.Bennink、J.Yewdell、H.Ploegh和D.Johnson。1995年单纯疱疹病毒关闭TAP以逃避宿主免疫。自然。
375:411–415.[公共医学][谷歌学者] 6Fruh，K.、K.Ahn、H.Djaballah、P.Sempe、P.M.van Endert、R.Tampe、P.A.Peterson和Y.Yang。1995年。抗原提呈肽转运蛋白的病毒抑制剂。自然。
375:415–418.[公共医学][谷歌学者] 7沃森（M.T.Vossen）、E.M.韦斯特霍特（E.M.Westerhout）、C.索德伯格-努克莱尔（C.Soderberg-Naucler）和E.J.威茨（E.J.Wiertz）。2002.病毒免疫逃避：进化的杰作。免疫遗传学。
54:527–542.[公共医学][谷歌学者] 8Lilley，B.N.和H.L.Ploegh。2005.抗原呈递的病毒调节：内质网内外细胞靶点的操纵。免疫学。版次。
207:126–144.[公共医学][谷歌学者] 9A.B.Rickinson和E.Kieff。2006年，爱泼斯坦-巴尔病毒。在菲尔德病毒学。第五版。D.M.Knipe、P.M.Howley、D.E.Griffin、R.A.Lamb、M.A.Martin、B.Roizman和S.E.Strauss，编辑。Lippincott Williams&Wilkins，费城。2655–2700之间。
10库珀斯，R.2003。受影响的B细胞：通过EB病毒转化B细胞。《自然免疫学评论》。
三:801–812.[公共医学][谷歌学者] 11Steven，N.M.、N.Annels、A.Kumar、A.Leese、M.G.Kurilla和A.B.Rickinson。立即早期和早期溶解循环蛋白是EB病毒诱导的细胞毒性T细胞反应的常见靶点。实验医学学报
185:1605–1617.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 12Ressing、M.E.、S.E.Keating、D.van Leeuwen、D.Koppers-Lalic、I.Y.Pappworth、E.J.H.J.Wiertz和M.Rowe。生产性EBV感染期间与抗原处理依赖性肽转运相关的转运体受损。免疫学杂志。
174:6829–6838.[公共医学][谷歌学者] 13Pudney，V.A.、A.M.Leese、A.B.Rickinson和A.D.Hislop。2005年CD8+EB病毒裂解周期抗原之间的免疫优势直接反映了抗原在裂解感染细胞中呈现的效率。实验医学学报
201:349–360.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 14Reits，E.A.、A.C.Griekspoor和J.Neefjes。2000.TAP如何泵肽？DNA修复和交通ATP酶的见解。免疫学。今天。
21:598–600.[公共医学][谷歌学者] 15van Endert，P.M.、L.Saveanu、E.W.Hewitt和P.J.Lehner。2002.为肽泵提供动力：TAP与高能核苷酸的串扰。生物化学趋势。科学。
27:454–461.[公共医学][谷歌学者] 16Galocha，B.、A.Hill、B.C.Barnett、A.Dolan、A.Raimondi、R.F.Cook、J.Brunner、D.J.McGeoch和H.L.Ploegh。1997年，ICP47（一种单纯疱疹病毒编码的主要组织相容性复合体（MHC）抑制剂编码的与抗原处理（TAP）相关的肽转运蛋白）的活性位点映射到NH2-端子35残留物。实验医学学报
185:1565–1572.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17Neumann，L.、W.Kras、S.Uebel、G.Jung和R.Tampe。单纯疱疹病毒蛋白ICP47的活性域：一种与抗原处理（TAP）相关的转运体的有效抑制剂。分子生物学杂志。
272:484–492.[公共医学][谷歌学者] 18Yuan，J.、E.Cahir-McFarland、B.Zhao和E.Kieff。2006.爱泼斯坦-巴尔病毒复制期间表达的病毒和细胞RNA。J.维罗尔。
80：2548–2565。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 19鲁尼、C.M.、D.T.罗、T.拉格特和P.J.法雷尔。Epstein-Barr病毒（EBV）的剪接BZLF1基因激活早期EBV启动子并诱导病毒产生周期。J.维罗尔。
63:3109–3116.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20Kenney，S.、E.Holley-Guthrie、E.C.Mar和M.Smith。1989年。EB病毒BMLF1启动子包含一个对BZLF1和BRLF1反式激活子有反应的增强子元件。J.维罗尔。
63：3878–3883。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 21E.A.霍利·古思里、E.B.昆利文、E.-C.马尔和S.肯尼。EB病毒（EBV）BMRF1早期抗原（EA-D）启动子由EBV反式激活子BRLF1和BZLF1以细胞特异性方式调节。J.维罗尔。
64:3753–3759.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22Ragoczy，T.和G.Miller。EB病毒Rta蛋白在不同类别病毒裂解周期基因激活中的作用。J.维罗尔。
73:9858–9866.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23Liu，C.、N.Sista和J.Pagano。BRLF1早期蛋白激活EB病毒DNA聚合酶启动子是通过USF和E2F介导的。J.维罗尔。
70:2545–2555.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Scotet，E.、J.David-Ameline、M.-A.Peyrat、A.Moreau-Aubry、D.Pinczon、A.Lim、J.Even、G.Semana、J.M.Berthelot、R.Breathnach等人，1996年。慢性类风湿关节炎患者T细胞对EB病毒反式激活物的反应。实验医学学报
184:1791–1800.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25Scotet，E.、M.A.Peyrat、X.Saulquin、C.Retiere、C.Couedel、F.Davodeau、N.Dulphy、A.Toubert、J.D.Bignon、A.Lim等人，1999年。慢性炎症病变中CD8 T细胞对常见疱疹病毒反应的频繁富集：重新评估自身免疫炎症过程中发现的T细胞克隆性扩增的生理病理学意义。欧洲免疫学杂志。
29:973–985.[公共医学][谷歌学者] 26巴拉德瓦吉、M.、S.R.伯罗斯、J.M.伯罗斯，D.J.莫斯、M.卡特琳娜和R.卡纳。原发性EB病毒感染后抗原特异性CD8+细胞毒性T淋巴细胞的纵向动力学。鲜血。
98:2588–2589.[公共医学][谷歌学者] 27Cho，Y.、J.Ramer、P.Rivaller、C.Quink、R.L.Garber、D.Beier和F.Wang。2001.一种来自绒猴淋巴瘤的Epstein-Barr相关疱疹病毒。程序。国家。阿卡德。科学。美国。
98:1224–1229.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 28Rivaller，P.、Y.-G.Cho和F.Wang。自然感染新世界灵长类动物的爱泼斯坦-巴尔病毒相关疱疹病毒的完整基因组序列：致癌淋巴隐病毒进化的一个决定性点。J.维罗尔。
76:12055–12068.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 29M.H.福克、A.Carville、J.Cameron、C.Quink和F.Wang。新大陆灵长类动物血清中EB病毒相关淋巴隐病毒感染的发病率降低。J.维罗尔。
79:10069–10072.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 30Ahn，K.，T.H.Meyer，S.Uebel，P.Sempe，H.Djaballah，Y.Yang，P.A.Peterson，K.Fruh和R.Tampe。1996年。单纯疱疹病毒ICP47抑制TAP的分子机制和物种特异性。EMBO J。
15:3247–3255.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 31Tomazin，R.、A.B.Hill、P.Jugovic、I.York、P.van Endert、H.L.Ploegh、D.W.Andrews和D.C.Johnson。1996年。单纯疱疹病毒ICP47蛋白与TAP肽结合位点的稳定结合。EMBO J。
15：3256–3266。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 32Koppers Lalic，D.、E.A.J.Reits、M.E.Ressing、A.D.Lipinska、R.Abele、J.Koch、M.M.Rezende、P.Admiraal、D.van Leeuwen、K.Bienkowska Szewczyk等人，2005年。水痘病毒通过UL49.5介导与抗原处理相关的转运体失活来避免T细胞识别。程序。国家。阿卡德。科学。美国。
102:5144–5149.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 33A.D.利宾斯卡、D.Koppers-Lalic、M.Ryclowski、P.Admiraal、F.A.M.Rijsewijk、K.Bienkowska-Szewczyk和E.J.H.J.Wiertz。牛疱疹病毒1型UL49.5蛋白抑制与抗原处理相关的转运体，尽管与糖蛋白M形成复合物。J.维罗尔。
80:5822–5832.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 34Ahn，K.、A.Gruhler、B.Galocha、T.R.Jones、E.J.H.J.Wiertz、H.L.Ploegh、P.A.Peterson、Y.Yang和K.Fruh。1997年HCMV糖蛋白US6的ER蛋白域通过TAP抑制肽移位。免疫。
6:613–621.[公共医学][谷歌学者] 35Hengel，H.、J.-O.Koopmann、T.Flohr、W.Muranyi、E.Goulmy、G.J.Hammerling、U.H.Koszinowski和F.Momburg，1997年。病毒ER受体糖蛋白使MHC编码的肽转运蛋白失活。免疫。
6:623–632.[公共医学][谷歌学者] 36Lehner，P.J.、J.T.Karttunen、G.W.G.Wilkinson和P.Cresswell。人巨细胞病毒US6糖蛋白抑制与抗原处理依赖性肽易位相关的转运体。程序。国家。阿卡德。科学。美国。
94:6904–6909.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 37Kyritsis，C.、S.Gorbulev、S.Hutschenreiter、K.Pawlitschko、R.Abele和R.Tampe。2001.与巨细胞病毒蛋白US6抑制抗原处理相关的转运体的分子机制和结构方面。生物学杂志。化学。
276:48031–48039.[公共医学][谷歌学者] 38休伊特、E.W.、S.S.古普塔和P.J.莱纳。2001.人巨细胞病毒基因产物US6通过TAP抑制ATP结合。EMBO J。
20:387–396.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 39Boname、J.M.、J.S.May和P.G.Stevenson。2005年。小鼠γ-疱疹病毒-68 MK3蛋白导致TAP降解，与MHC I类重链降解无关。欧洲免疫学杂志。
35:171–179.[公共医学][谷歌学者] 40Boname、J.M.和P.G.Stevenson。2001.病毒PHD/LAP指蛋白导致MHC I类泛素化。免疫。
15:627–636.[公共医学][谷歌学者] 41Boname，J.M.、B.D.de Lima、P.J.Lehner和P.G.Stevenson。2004年。MHC I类肽负载复合物的病毒降解。免疫。
20:305–317.[公共医学][谷歌学者] 42Lybarger，L.、X.Wang、M.R.Harris、I.Virgin、W.Herbert和T.H.Hansen。2003.病毒对MHC I类肽负载复合物的破坏。免疫。
18:121–130.[公共医学][谷歌学者] 43Wang，X.、L.Lybarger、R.Connors、M.R.Harris和T.H.Hansen。2004年。γ-疱疹病毒68环-CH指蛋白mK3与主要组织相容性复合体I类和肽装载复合体相互作用的模型。J.维罗尔。
78:8673–8686.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 44Yu、Y.Y.L.、M.R.Harris、L.Lybarger、L.A.Kimpler、N.B.Myers、H.W.Virgin IV和T.H.Hansen。2002。γ-2疱疹病毒68的K3蛋白与主要组织相容性复合体I类分子的物理关联，该复合体具有受损的肽和β（2）-微球蛋白组装。J.维罗尔。
76:2796–2803.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 45Wang，X.、Y.Ye、W.Lencer和T.H.Hansen。2006.病毒E3泛素连接酶mK3使用Derlin/p97内质网相关降解途径调节主要组织相容性复合体I类蛋白的下调。生物学杂志。化学。
281:8636–8644.[公共医学][谷歌学者] 46Wang，X.、R.Connors、M.R.Harris、T.H.Hansen和L.Lybarger。2005.病毒免疫逃逸分子mK3选择性降解内质网主要组织相容性复合体I类蛋白的要求。J.维罗尔。
79:4099–4108.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 47Borgese，N.、S.Brambillasca、P.Soffientini、M.Yabal和M.Makarow。2003.尾锚定蛋白的生物发生。生物化学。社会事务处理。
31:1238–1242.[公共医学][谷歌学者] 48Tigges，M.A.，S.Leng，D.C.Johnson和R.L.Burke，1996年。人类单纯疱疹病毒（HSV）特异性CD8+CTL克隆在IFN-γ治疗后或病毒宿主关闭功能被禁用时识别HSV-2感染的成纤维细胞。免疫学杂志。
156:3901–3910.[公共医学][谷歌学者] 49Rowe，M.、B.Glaunsinger、D.van Leeuwen、J.Zuo、D.Sweetman、D.Ganem、J.Middeldorp、E.J.Wiertz和M.E.Ressing。2007年。Epstein-Barr病毒感染期间的宿主关闭由BGLF5介导，可能有助于免疫逃避。程序。国家。阿卡德。科学。美国。
104:3366–3371.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 50Bogedain，C.、H.Wolf、S.Modrow、G.Stuber和W.Jilg。1995年。特异性细胞毒性T淋巴细胞识别Epstein-Barr病毒的即时早期反式激活因子ZTA。J.维罗尔。
69:4872–4879.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 51Burrows，S.R.、J.Gardner、R.Khanna、T.Steward、D.J.Moss、S.Rodda和A.Suhrbier。Epstein-Barr病毒核抗原3中发现五个新的细胞毒性T细胞表位。《病毒遗传学杂志》。
75:2489–2493.[公共医学][谷歌学者] 52查普曼，A.法律公告，A.B.里金森，W.A.托马斯，R.F.贾勒特，J.克罗克和S.P.李。霍奇金病患者血液和肿瘤部位的EB病毒特异性细胞毒性T淋巴细胞反应：T细胞治疗的意义。癌症研究。
61:6219–6226.[公共医学][谷歌学者] 53A.B.Rickinson和D.J.Moss。人类细胞毒性T淋巴细胞对EB病毒感染的反应。每年。免疫学评论。
15：405–431。[公共医学][谷歌学者] 54Taylor、G.S.、H.M.Long、T.A.Haigh、M.Larsen、J.Brooks和A.B.Rickinson。2006.细胞间抗原转移在EBV核抗原特异性CD4+T细胞识别EBV转化的B细胞系中的作用。免疫学杂志。
177:3746–3756.[公共医学][谷歌学者] 55Ressing，M.E.，D.van Leeuwen，F.A.W.Verreck，R.Gomez，B.Heemskerk，M.Toebes，M.M.Mullen，T.S.Jardetzky，R.Longnecker，M.W.Schilham等人，2003年。Epstein-Barr病毒gp42对T细胞受体-HLA-DR相互作用的干扰导致辅助T细胞识别降低。程序。国家。阿卡德。科学。美国。
100:11583–11588.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 56Ressing，M.E.、D.van Leeuwen、F.A.W.Verreck、S.Keating、R.Gomez、K.L.M.C.Franken、T.H.M.Ottenhoff、M.Spriggs、T.N.Schumacher、L.M.Hutt Fletcher等人，2005年。Epstein-Barr病毒gp42经过翻译后修饰，产生介导HLA II类免疫逃避的可溶性gp42。J.维罗尔。
79:841–852.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 57Spee，P.、J.Subjeck和J.Neefjes。1999.内质网中新肽结合蛋白的鉴定：ERp72、calnexin和grp170。生物化学。
38:10559–10566.[公共医学][谷歌学者] 
