高突变免疫球蛋白基因的A/T突变强烈依赖于PCNA^K164型修改

摘要

高亲和力抗体是由Ig重链和轻链基因可变区域内的体细胞超突变（SHM）产生的(1). SHM使生发中心的抗原特异性B细胞以10倍的速率突变其Ig基因⁻³与10个碱基对相比⁻⁹用于自发突变(2). 单个B细胞特异性DNA损伤诱导物激活诱导的胞苷脱氨酶（AID）以及参与DNA修复和DNA损伤耐受的蛋白质的顺序作用使局部突变率增加了6个数量级(三,4). AID通过胞嘧啶（C）脱氨基在免疫球蛋白基因的可变区生成尿嘧啶（U）来启动这一过程(5). 尿嘧啶清除尿嘧啶N个-糖基化酶2（UNG2）产生一个碱基位点。在超突变的B细胞中，尿嘧啶损伤部位的高保真复制有利于转换（C到T和G到A），而在碱性部位的低保真复制则有利于颠倒（C到G/A或G到C/T）。与这些预测一致，C/G对的突变在缺乏UNG2的小鼠中向过渡转移(6). 这些数据表明，像C到U转换和非破坏性碱基位点这样的损伤有利于G/C碱基对突变的产生（SHM的I期或UNG2依赖性途径）。或者，错配修复（MMR）复合物人类mutS同源物2（MSH2）–MSH6可以识别U/G错配(7). MSH2或MSH6缺乏导致模板a/T突变减少，通常占所有突变的50%，同时增加G/C突变(8–10). 在MSH2缺乏小鼠中观察到模板G/C处突变频率增加（G/C偏倚），这意味着MSH2–MSH6处理U/G错配可能触发替代性突变修复途径，该途径负责在模板A/T处建立大多数突变（SHM的II期或MMR依赖途径）。尽管SHM受到UNG2、MSH2或MSH6单一缺陷的干扰，但UNG2/MSH2或UNG2/MSH6联合缺陷会导致a/T对SHM的完全消融，但正如预期的那样，不会影响初始U/G错对的复制，从而实现G到a和C到T的转变(6,8–12). 因此，两种修复途径，碱基切除修复和MMR，通常在恢复U/G损伤方面有效，在产生体细胞突变方面提供了替代途径。是什么使碱基切除修复和MMR成为诱变性的，即是什么阻止了这些忠实修复路径的完成以实现程序化诱变？酵母中耐损伤、易出错的复制途径的鉴定和表征提供了一种可能的方案。对DNA损伤敏感突变体的广泛筛选导致识别出包含泛素结合/连接复合物Rad6–Rad18和Mms2–Ubc13–Rad5的Rad6上位性群，转基因DNA聚合酶聚合酶η（Polη；Rad30）、Rev1和Polζ（Rev3和Rev7的异二聚体）、高保真聚合酶Polδ、SRS2解旋酶和增殖细胞核抗原（PCNA）；参考文献13,14；图1).

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图1。

Rad6上位性群在DNA损伤旁路中的作用。环状PCNA同源三聚体包围着DNA，通过将DNA Polδ连接到模板上，它成为DNA复制的一个重要过程因子。在存在DNA损伤（星形）的情况下，PCNA通过泛素结合/连接复合物Rad6–Rad18在K164处变成单泛素化。PCNA-Ub可以直接激活TLS聚合酶（如Polη、Rev1和Polζ），从而绕过易出错的损伤。或者，通过Rad5–Mms2–Ubc13复合物对PCNA-Ub进行K63连接的多泛素化，实现模板切换，从而实现无误损伤旁路。除了泛素化外，PCNA还可以在K164处进行SUMO化。PCNA-SUMO招募抗重组Srs2解旋酶，该解旋酶阻止Rad51丝的形成，并被认为间接有利于损伤旁路。该图改编自Hoege等人（参考文献20). 红圈，泛素；黑色圆圈，SUMO。

虽然RAD6上位性群最初在芽殖酵母中被描述，酿酒酵母，已在高等真核生物中鉴定出功能性同源基因，这意味着该途径具有普遍重要性(15–18). Rad6上位性组提供了两种替代途径，允许停滞的DNA复制在受损模板上继续进行，例如非破坏性碱基位点(19). DNA模板中的损伤导致复制叉停止并触发Rad6–Rad18介导的PCNA在赖氨酸残基K164处的单泛素化（参考文献20; PCNA-Ub）。PCNA-Ub用作高保真、无错误的DNA Polδ和低保真、易出错的跨损伤DNA合成（TLS）聚合酶Polη、Rev1和Polζ的分子开关(21). TLS聚合酶如Polη和Rev1可以绕过DNA损伤，Polζ可以从非Watson-Crick碱基对扩展复制以挽救停滞的复制叉，尽管通常以牺牲准确性为代价(22). 跨病变甚至完整模板的TLS可能非常容易出错，因此需要严格控制。PCNA相互作用肽盒的存在(23)DNA聚合酶Y家族TLS聚合酶中的泛素结合域Ub结合基序和Ub结合锌指为TLS聚合体如何靶向停滞的复制叉以完成聚合酶转换和TLS激活提供了分子见解(24). PCNA相互作用肽可能提供PCNA特异性，Ub结合基序增加了这种结合的亲和力。事实上，一些TLS聚合酶在与PCNA-Ub结合时表现出更强的加工性(25–27).

替代损伤耐受途径需要Mms2–Ubc13–Rad5介导的、K63连锁的单泛素化PCNA的多泛素化^K164型.多泛素PCNA^K164型使模板切换到完整的姐妹染色单体，从而实现无误损伤旁路(19). 除了作为高保真和低保真聚合酶的加工因子外，PCNA三聚体还与多种损伤控制和修复因子相互作用，包括错配识别蛋白MSH6和MSH3(23).

鉴于Rad6–Rad18介导PCNA的单泛素化^K164型刺激TLS聚合酶的补充(28)Rad6上位性群的TLS聚合酶，Rev1(29–31)，极ζ(32,33)，和Polη(34,35)我们在这里定义了PCNA依赖性损伤耐受性在哺乳动物SHM中的作用。我们的数据强烈表明，损伤容限与MMR相交，以建立大多数A/T和其他突变。

结果

携带纯合PCNA小鼠的产生^K164R型突变

为了阻断PCNA依赖性损伤耐受性，PCNA（PCNA）164残基的赖氨酸（K）到精氨酸（R）突变^K164R型)通过靶向小鼠PCNA基因座第4外显子中的A到G转换引入。PCNA的产生^K164R型靶向构建、胚胎干细胞靶向以及同时鉴定同源和非同源重组体的高通量筛选系统的开发已在别处发表(36). PCNA的ES细胞杂合^K164R型通过突变获得嵌合体小鼠(37). 通过将雄性嵌合体与野生型小鼠杂交，测试靶向ES细胞将突变传递到小鼠生殖系的能力。考虑PCNA滑动钳的同源三聚体性质及其双等位基因表达(图2 A)，组成为3K和0K的单态PCNA三聚体将分别在野生型和纯合环境中组装。在杂合子环境中，野生型PCNA和突变型PCNA的两个池相等^K164R型共存(图2 B)，能够分别以1:3:3:1的相对频率形成0K、1K、2K和3K组成的三聚体。如果单个野生型PCNA足以介导损伤耐受性，八分之七的复制复合物（1K、2K和3K复合物）有望发挥作用，因此杂合型PCNA的表型^K164R型突变体应与野生型相似。如果需要3K成分，在八分之一的情况下，通过受损模板进行复制是有效的，杂合突变体应类似于纯合PCNA^K164R型突变体。有趣的是，嵌合体确实传递PCNA^K164R型突变，产生正常发育的杂合子后代。测试纯合子PCNA^K164R型突变与哺乳动物的后代是相容的(n个=397）从70只杂合小鼠之间的杂交中进行基因分型(图3 A). 令我们惊讶的是，纯合子突变体诞生了，尽管频率低于孟德尔(图3 B). 总的来说，只有5%的后代携带PCNA^K164R型两个等位基因的突变与预期的25%相比。解决PCNA是否^K164R型突变为纯合突变胚胎提供了选择性劣势，我们对71个胚胎日（E）14.5胚胎进行了基因分型，这些胚胎来自杂合携带者之间的杂交。胚胎发育第14.5天，4%纯合PCNA^K164R型发现了胚胎，这与观察到的存活后代的5%一致。显然，对纯合胚胎的选择发生在E14.5天之前。

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图2。

野生型和突变型PCNA的表达水平相同。（A） RT-MLPA（参考54)来自野生型、杂合型和纯合型PCNA脾脏的B细胞和T细胞的RNA^K164R型老鼠。显示了由MLPA测定的野生型和突变型PCNA mRNA的相对mRNA水平。杂合突变小鼠表达野生型和突变等位基因的水平相等。肌动蛋白β和热休克蛋白90（HSP90）作为对照。误差线表示六个独立实验的标准偏差。（B） PCNA突变株中PCNA三聚体的形成。然而，在野生型和纯合子小鼠中，仅分别形成了3K或3R组成的单态纯合子三聚体，而杂合子小鼠的PCNA分子混合池允许四种不同的组成：3K、2K1R、1K2R或3R，比例为1:3:1。

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图3。

纯合PCNA^K164R型小鼠出生频率低于孟德尔，并且不育。（A） 70个杂合PCNA杂交后代中的397个^K164R型对突变体进行基因分型。与25%的预期纯合子突变体相比，仅观察到5%。野生型和杂合型小鼠出生频率分别为34%和61%。（B） E14.5杂合PCNA间杂交的胚胎^K164R型显示了具有各自应用生物系统PCNA等位基因测序图谱的突变体。（C） 纯合PCNA中生殖细胞发育失败^K164R型老鼠。3月龄小鼠睾丸和卵巢的组织切片。棒材：（小）500μm；（大）200μm。（顶部四个面板）控制或PCNA^K164R型睾丸。对照睾丸显示所有阶段的正常精子发生，而PCNA^K164R型睾丸显示精子发生萎缩：仅发现支持细胞，未检测到精子。PCNA^K164R型睾丸间质细胞强烈增生。（底部四个面板）正常卵巢在发育的各个阶段都含有许多卵泡。PCNA^K164R型卵巢主要由间质细胞组成。

PCNA公司^K164R型禁止损伤诱导的泛素化

测试PCNA是否^K164R型突变实际上阻止了损伤诱导的PCNA泛素化，通过多重连接依赖性探针扩增（MLPA）衍生出原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）并进行基因分型，以确定突变和野生型等位基因（参考文献36；图4 A). 从未经处理和紫外线照射的原始野生型和纯合突变MEF中分离并分析染色质相关PCNA组分是否存在泛素结合PCNA(图4 B). 虽然在未经处理的野生型MEF中，PCNA-Ub的亚组分可以清楚地检测到，并且在紫外线照射下很容易增加，但纯合PCNA中缺乏PCNA的单泛素化^K164R型突变体，并且即使在长时间暴露于x射线胶片之后也不能被检测到。这些数据证实PCNA^K164R型突变抑制了损伤诱导的PCNA的单泛素化，并排除了小鼠PCNA中替代损伤诱导的泛素结合位点的存在。因为PCNA-Ub是Mms2–Ubc13–Rad5介导的K63连锁多泛素化、纯合PCNA的底物^K164R型预计突变体在PCNA依赖的损伤耐受性方面完全有缺陷。

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图4。

PCNA^K164R型突变阻止损伤诱导的泛素化。（A） 通过MLPA对主要MEF进行基因分型，以确定野生型（顶部）、杂合型（中部）和纯合型（底部）PCNA^K164R型突变细胞系。顶部毛细管电泳模式仅检测野生型PCNA。（中）除野生型外，毛细管电泳模式还以1:1的预期比率检测突变PCNA。底部毛细管电泳模式仅检测到突变PCNA。1、2和3是三个控制峰值。（B） 为了测试PCNA泛素化是否在纯合子突变细胞中被禁止，分析了野生型和纯合子突变体的初级MEF在没有或存在紫外线诱导损伤的情况下是否存在染色质相关的PCNA-Ub。然而，在野生型MEF中，PCNA-Ub在紫外线诱导的损伤后很容易增加，无论是未经处理的PCNA还是紫外线照射的PCNA染色质部分在纯合MEF中都没有泛素化。

LPS激活的B细胞母细胞的存活和增殖能力

增殖细胞核抗原的增殖能力和存活率^K164R型体外检测LPS激活的B细胞母细胞的突变细胞。从野生型、杂合子和纯合突变小鼠脾脏分离的B细胞在细胞内装载荧光细胞跟踪器CFSE，并用LPS多克隆刺激3 d。比较CFSE稀释曲线的重叠直方图，LPS激活后触发分裂的B细胞百分比（应答器频率）、至少分裂一次的细胞分裂平均值（爆发大小）以及具有n个发现分裂（增殖能力）(图5 A). 通过用荧光结合的AnniV（AnV）染色质膜外叶中的磷脂酰丝氨酸来测量LPS激活的B细胞母细胞的存活率，并使用荧光DNA结合分子碘丙啶（PI）的摄取来测量质膜对小分子的通透性。带电频率（AnV^负极，PI^负极)，凋亡（AnV⁺，PI^负极)和死亡（AnV⁺，PI⁺)在多克隆LPS激活后的特定时间点，细胞仍然无法区分(图5 B). 符合纯合PCNA的生长能力^K164R型这些数据表明，PCNA依赖性损伤耐受性在决定PCNA的增殖能力和存活率方面没有主要作用^K164R/K164R细胞存在自发损伤。

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图5。

体外LPS刺激B细胞的增殖和存活。（A） 通过CFSE稀释法测定LPS刺激3 d后所有基因型B细胞的增殖。未观察到实质性差异。（B） 通过AnV染色和PI摄取测定LPS刺激B细胞的三维存活率。活的分析（AnV^负极，PI^负极)，凋亡（AnV⁺，PI^负极)和死亡（AnV⁺，PI⁺)细胞显示LPS母细胞的存活能力没有差异。误差线表示三个独立实验的标准偏差。

PCNA修饰控制A/T突变

探讨PCNA-依赖性损伤耐受在程序性突变中的作用，即有意将AID损伤引入Ig可变区，并随后招募TLS聚合酶来支持突变子功能(4,38)、J_H（H）从野生型、杂合型和纯合型PCNA分离的记忆B细胞的4个内含子区域^K164R型对突变体进行扩增、测序和突变分析。有趣的是，J基因点突变的频率_H（H）这些小鼠记忆B细胞的4个内含子(n个=5/基因型）保持相当相似：1.06%（PCNA^+/+)1.10%（PCNA）^+/K164R型)和0.79%（PCNA^K164R/K164R). 突变频率的降低与每个序列的平均点突变数的减少有关，纯合子为4.5，杂合子为5.6，野生型B细胞为5.8。突变序列的频率n个突变如所示图6 A点突变沿J的分布_H（H）4个内含子对所有基因型都具有可比性(图6 B). 比较野生型、杂合型和纯合型PCNA的碱基交换模式时，观察到显著的变化^K164R型突变体。未能修改PCNA^K164型在纯合突变的B细胞中，模板a/T的转换和颠倒减少了10倍，通常占所有突变的50%。模板A/T突变的选择性失败被模板G/C突变的增加所补偿，但注意到C到G的颠倒除外(图6、C和D). 模板A/T突变的减少和模板G/C突变的同时增加进一步表明存在两种替代途径，一种主要的PCNA^K164型-依赖性A/T突变途径和主要PCNA^K164型-独立的G/C突变途径。有趣的是，在比较杂合PCNA时，在碱基交换模式中没有观察到显著差异^K164R型和野生型B细胞（p值见表S1，网址为http://www.jem.org/cgi/content/full/jem.20070902/DC1).

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图6。

SHM在没有PCNA的情况下发生改变^K164型修改。将从图例中所示的每种基因型的五只小鼠中分离出的记忆B细胞中发现的突变进行汇总。（A） 突变负荷作为携带突变序列的频率提供n个突变（x轴）。平均突变负荷（J′区点突变的数量_H（H）4内含子）在野生型、杂合型和纯合型PCNA中分别为5.8、5.6和4.5^K164R型突变体。（B） J区5′区突变的分布_H（H）4个内含子，从剪接供体开始。野生型、杂合型和纯合型PCNA之间的突变分布相似^K164R型老鼠。-，RGYW/WRCY突变热点位置；三联体，三个核苷酸。（C） 基本交换模式。野生型的点突变(n个=502），杂合(n个=255），纯合子(n个=503）PCNA^K164R型对小鼠进行分析。显示了定义的基本交换机的绝对数量（左）和相对数量（右）。野生型和杂合子PCNA之间没有观察到主要差异^K164R型老鼠。在纯合小鼠中，A/T突变几乎是缺失的。模板A/T产生突变的减少与G/C突变的相对和绝对增加有关，但注意到的C到G颠倒除外。纯合突变体中PCNA泛素化的禁止导致G到a和C到T的转换增加了两倍。（D） 为了简化突变谱的比较，将碱基交换模式归一化为野生型。将野生型中每个碱基交换的百分比设置为1，并显示突变体与野生型的相对比率。除C-G颠倒外，纯合子突变B细胞中发现的所有其他交换都与χ²试验（P<0.05）。在杂合小鼠中未观察到明显变化。表S1中提供了各个p值（可在http://www.jem.org/cgi/content/full/jem.20070902/DC1).

讨论

这里我们报告PCNA的生成^K614R公司突变小鼠。这种突变阻止PCNA的位点特异性修饰^K164型PCNA依赖性DNA损伤耐受所需(20). 令人惊讶的是，纯合子PCNA^K164R型老鼠出生的频率虽然低于孟德尔。杂合父母的后代中只有5%是PCNA纯合子^K164R型等位基因，提示在胚胎发育过程中纯合子突变体的逆向选择。计数器选择发生在E14.5之前，因为在鼠标开发的这个阶段发现相同的频率。尽管有最初的反选择，但我们的数据表明，哺乳动物可以在缺乏PCNA依赖的DNA损伤耐受性的情况下发育。我们目前正在研究代偿性DNA修复或损伤耐受途径的可能激活，以使一些纯合子突变体在自发DNA损伤的情况下存活。除生殖细胞外，存活的纯合子小鼠的体细胞发育正常。由生殖细胞缺乏引起的不孕表明存在PCNA^K164型对生殖细胞特定过程至关重要的修饰，可能与减数分裂有关。除了泛素化外，小泛素样修饰物（SUMO）与PCNA的选择性结合^K164型必须被视为生殖细胞的基本PCNA修饰。

PCNA的单泛素化^K164型已提议对TLS聚合酶的招募和活性进行调节，从而能够在受损和未受损的模板之间进行直接复制(39–41). 由于TLS聚合酶被发现在SHM中发挥作用(29–35)并且一些TLS聚合酶被PCNA-Ub激活(25–27)，我们确定了建立体细胞突变时对PCNA-Ub的需求。由于记忆B细胞的突变负荷最高，我们选择分析小的、类别转换的CD19中的SHM⁺，免疫球蛋白M^负极和Igκ^高的脾脏的B细胞。由于这些B细胞是从未免疫的小鼠中分离出来的，它们不太可能最近被激活，因此被称为记忆B细胞。纯合子突变体中这些记忆B细胞的正常频率（未发表的数据）已经表明，PCNA突变不会影响B细胞转换其Ig同型的能力。体外观察进一步支持了这一点，表明PCNA^K164R型突变B细胞在LPS、LPS/IL-4和LPS/IFN-γ刺激下正常转换。确定PCNA的影响^K164R型SHM突变，J′区的非选择性突变_H（H）分析了4个内含子。PCNA公司^K164R型B细胞能够突变其Ig基因，但突变频率降低了0.79%，而野生型和杂合型突变体的突变频率分别为1.06%和1.10%。这一发现与PCNA中观察到的表型形成对比^K164R型鸡DT40克隆(31). 虽然DT40克隆的总突变频率降低了7倍，为野生型水平的15%，但纯合PCNA^K164R型突变B细胞的突变频率保持在75%。

纯合子而非杂合子PCNA的碱基交换模式发生了显著变化^K164R型B细胞。我们观察到模板a/T的突变减少了90%，这是一种缺乏PCNA基因转化缺陷鸡DT40细胞系的表型^K164R型变更(31). 鸡DT40细胞系中缺乏A/T突变子活性，这与其他观察结果一致，表明这种活性在高突变细胞系中较低(42–45). 我们的体内系统清楚地揭示了PCNA依赖的主要a/T突变途径的存在。

因为大多数A/T突变（通常占所有突变的一半）缺乏纯合的PCNA^K164R型B细胞的突变频率预计会降低50%。发现总突变频率仅降低了25%，这表明G/C突变子活性对其进行了部分补偿，但C到G的颠倒除外。如前所述，脱氧胞苷转移酶Rev1参与突变Ig基因中C-G和G-C颠倒的产生(29,30). 值得注意的是，TLS聚合酶Polη和Rev1均依赖于与PCNA-Ub的结合，以实现有效的损伤旁路(26,46). 因此，在PCNA突变B细胞中观察到的C到G颠换的相对减少可以用Rev1活性受损来解释。引人注目的观察结果是，在没有PCNA的情况下，G/C突变不会受损^K164型修饰强烈暗示存在一条替代途径，允许其他TLS聚合酶（主要是G/C突变子）被激活。事实上，异三聚体Rad9–Rad1–Hus1复合物（也称为9–1–1复合物）在结构上与PCNA相似(47)，在酵母中显示与TLS聚合酶相互作用(48,49)从而可以为PCNA-independent TLS提供平台。

考虑到PCNA滑动钳的三体性，有趣的是杂合PCNA的突变频率、突变负荷和碱基交换模式^K614R公司小鼠与野生型没有太大区别。这些观察结果对于Polη活性对PCNA三聚体泛素化状态的依赖性具有重要意义。杂合子B细胞和T细胞母细胞的PCNA信使RNA（mRNA）分析表明，这两个PCNA等位基因转录水平相同。因此，在这种情况下，八分之一的PCNA三聚体具有3K组成，并在所有三个K164残基处泛素化。虽然PCNA三聚体中的所有单体通常都会泛素化(28,39)杂合PCNA中A/T突变的未受损代^K164R型B细胞支持这样的观点，即PCNA三聚体中的单个PCNA-Ub足以激活Polη。

我们的数据清楚地表明，模板A/T的突变（与哺乳动物超突变Ig基因中50%的突变相似）强烈依赖于PCNA^K164型修改。有趣的是，在Polη的B细胞中观察到非常相似的表型^−/−和MMR-缺乏MSH2^−/−或MSH6^−/−老鼠(8–10,34,35). 通过对MSH2-、MSH6-和Polη-缺陷小鼠的已发表数据进行标准化，我们比较了PCNA突变、Polη-缺陷和MMR-缺陷小鼠的超突变表型，以了解A/T突变频率和碱基交换模式的实质性差异。除了Polη缺陷小鼠（其a/T突变的剩余频率稍高）外，上述参数在不同突变体之间保持非常相似。这表明错配识别、PCNA-Ub和Polη协同作用，在哺乳动物B细胞SHM期间建立A/T突变。Polη缺陷的B细胞中A/T突变的频率较高，可能归因于A到C和T到G的颠倒。这表明存在一种TLS聚合酶而非Polη聚合酶，该聚合酶依赖MMR和PCNA泛素化来产生这些颠倒。

PCNA在S期高表达，并在DNA损伤时泛素化，以允许DNA损伤间的复制(20,50). 这些观察结果表明，模板A/T的突变发生在复制过程中，这与依赖Rad6的损伤容限与复制有关的概念一致(51). 观察到不仅仅在纯合PCNA中G到A和C到T跃迁增加，进一步支持了这一假设^K164R型突变的B细胞以及Polη-和MMR缺陷的B细胞(8,34,35). 未能修改PCNA^K164型禁止Polη和Rev1激活，因此有利于通过高保真Polδ对尿嘧啶进行复制旁路。虽然Polδ可以很容易地解释G到A和C到T跃迁频率的增加，但G和C处的颠换可能与UNG2依赖的G/C突变子活性有关。我们推测在纯合PCNA中观察到的突变频率减少了25%^K164R型因此，小鼠可能归因于AID诱导损伤的差异处理，即与UNG2依赖的短斑片再合成或UNG2诱导的复制旁路中的G/C突变相比，在长斑片MMR依赖的再合成过程中引入相对较多的A/T突变(52).

总之，为了探索PCNA单泛素化在SHM中的作用，我们产生了PCNA^K164R型突变小鼠。纯合小鼠在模板a/T处的突变显著减少，而在模板G/C处的突变呈代偿性增加。杂合小鼠的正常碱基交换模式表明，单个PCNA-Ub足以激活a/T突变子Polη。从Polη导出的基础交换模式的变化具有惊人的相似性^−/−，MSH2^−/−，MSH6^−/−和PCNA^K164R型小鼠强烈表明，错配识别、PCNA-Ub和Polη在复制过程中合作，在哺乳动物Ig基因的模板A/T处建立突变。这有利于建立第二阶段突变模型，其中MMR途径与PCNA-依赖性损伤耐受性相交，使特定PCNA-Ub依赖性TLS聚合酶（优先为Polη）的招募和激活能够在复制过程中产生体细胞突变。

材料和方法

补充材料

致谢

注意事项

缩写词：AID，活化诱导胞苷脱氨酶；AnV、Annexin V；ES，胚胎干；K、 赖氨酸；MEF，小鼠胚胎成纤维细胞；多重连接依赖性探针扩增；MMR，失配修复；mRNA、信使RNA；MSH，mutS同源；增殖细胞核抗原；PI，碘化丙啶；Polη，聚合酶η；R、 精氨酸；SHM，体细胞超突变；SUMO，小泛素样修饰物；TLS，跨损伤DNA合成；UNG2，尿嘧啶N个-糖苷酶2。

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