《实验医学杂志》。2007年8月6日；204(8): 1837–1847.
第条
IL-25通过增强TSLP-DC激活的Th2记忆细胞的扩张和功能增强2型免疫应答
,1 ,1,5,7 ,1 ,1 ,1 ,1 ,6 ,2 ,1 ,6 ,三 ,2 ,4和1,7
王玉喜
1德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心免疫学系和癌症免疫研究中心，德克萨斯州休斯顿，邮编77030
Pornpimon Angkasekwinai公司
1德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心免疫学系和癌症免疫研究中心，德克萨斯州休斯顿，邮编77030
5泰国巴吞他尼12121 Rangsit校区Thammasat大学联合健康科学学院
7德克萨斯州休斯顿德克萨斯大学生物医学研究生院，德克萨斯州休斯敦77225
宁路
1德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心免疫学系和癌症免疫研究中心，德克萨斯州休斯顿，邮编77030
奎新沃
1德克萨斯大学安德森癌症中心免疫学系和癌症免疫学研究中心，德克萨斯州休斯顿77030
Kazuhiko Arima公司
1德克萨斯大学安德森癌症中心免疫学系和癌症免疫学研究中心，德克萨斯州休斯顿77030
Shino Hanabuchi先生
1德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心免疫学系和癌症免疫研究中心，德克萨斯州休斯顿，邮编77030
安德烈亚斯·希佩
6德国杜塞尔多夫40225号海因里希-海因大学皮肤科
克里斯·科里根
2英国伦敦国王学院MRC-Asthma哮喘研究中心哮喘、过敏和肺生物学分部，英国伦敦SE1 9RT
陈东
1德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心免疫学系和癌症免疫研究中心，德克萨斯州休斯顿，邮编77030
伯恩哈德·霍米
6德国杜塞尔多夫40225号海因里希-海因大学皮肤科
姚正斌
三Tanox公司，德克萨斯州休斯顿，邮编77025
孙莹
2英国伦敦国王学院MRC-Asthma哮喘研究中心哮喘、过敏和肺生物学分部，英国伦敦SE1 9RT
大卫·P·休斯顿
4德克萨斯州休斯顿贝勒医学院炎症生物学中心医学系和免疫学系77030
刘永军
1德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心免疫学系和癌症免疫研究中心，德克萨斯州休斯顿，邮编77030
7德克萨斯州休斯顿德克萨斯大学生物医学研究生院，德克萨斯州休斯敦77225
1德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心免疫学系和癌症免疫研究中心，德克萨斯州休斯顿，邮编77030
2英国伦敦国王学院MRC-Asthma哮喘研究中心哮喘、过敏和肺生物学分部，英国伦敦SE1 9RT
三Tanox公司，德克萨斯州休斯顿，邮编77025
4德克萨斯州休斯顿贝勒医学院炎症生物学中心医学系和免疫学系，邮编77030
5泰国巴吞他尼12121 Rangsit校区Thammasat大学联合健康科学学院
6德国杜塞尔多夫40225号海因里希-海因大学皮肤科
7德克萨斯州休斯顿德克萨斯大学生物医学研究生院，德克萨斯州休斯敦77225
收到日期：2007年2月26日；2007年6月28日接受。
摘要
白细胞介素（IL）25（IL-17E）是IL-17细胞因子家族的独特成员，在引发以嗜酸性粒细胞和Th2记忆细胞浸润为特征的辅助性T细胞2型（Th2）细胞介导的炎症反应中发挥重要作用。然而，人类的细胞来源、靶细胞和潜在机制仍不清楚。我们证明，人类Th2记忆细胞表达不同水平的IL-25受体（R）是一种反应细胞类型。当胸腺基质淋巴生成素（TSLP）激活的树突状细胞（DC）、稳态细胞因子或用于抗原触发的T细胞受体刺激Th2中央记忆细胞时，IL-25促进细胞扩张和Th2细胞因子的产生。IL-25诱导的Th2记忆细胞功能增强与GATA-3、c-MAF和JunB以IL-4非依赖性方式持续表达相关。虽然角质形成细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞表达IL-25转录物，但发现来自正常和特应性受试者的活化嗜酸性和嗜碱性细胞分泌生物活性IL-25蛋白，从而增强Th2记忆细胞的功能。在哮喘肺组织和特应性皮炎皮损中观察到IL-25和IL-25R转录物的高表达，将其可能与加重的过敏性疾病联系起来。我们的结果提供了一个似是而非的解释，即先天效应嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞产生的IL-25可能通过增强适应性Th2记忆细胞的维持和功能而加剧过敏性炎症。
过敏性疾病，如哮喘和过敏症，其特征是在炎症部位积聚记忆样Th2 T细胞和嗜酸性粒细胞(1,2). 在慢性哮喘期间，嗜酸性粒细胞的聚集和功能通常与局部Th2 T细胞的活化有关，Th2 T淋巴细胞通过产生IL-5和GM-CSF，延长嗜酸性粒胞的生存能力并增强其效应器反应(三,4). 相反，嗜酸粒细胞通过嗜酸性粒细胞趋化因子和白细胞介素-5向气道募集可促进Th2细胞介导的过敏特征，表明募集的嗜酸粒胞在调节局部Th2细胞功能方面具有积极作用。虽然有大量证据表明T细胞和DC在Th2细胞型炎症中调节嗜酸性粒细胞的募集和激活，但关于嗜酸性粒分子在调节Th2细胞功能中的作用的证据相对较少，这种协同作用的分子机制尚不清楚。
与其他IL-17细胞因子家族成员不同，在动物研究中，IL-25（IL-17E）已被证明能引起Th2细胞介导的炎症反应(5–10). 在小鼠中，IL-25最初被描述为Th2细胞衍生的细胞因子(9)也被发现由肥大细胞表达(11). 然而，对IL-25作出反应的细胞类型以及IL-25增强过敏性免疫反应的机制仍不清楚。此外，与人类过敏性炎症有关的IL-25的来源和表达IL-25R（或IL-17BR）的细胞类型尚未确定。
皮肤或支气管上皮强烈表达胸腺基质淋巴生成素（TSLP），一种IL-7样细胞因子，可以激活DC表达Th2细胞极化信号、OX40配体，并在缺乏IL-12的情况下创造Th2细胞允许的微环境(12,13)，这可能导致人类过敏性皮炎或过敏性哮喘以及小鼠的平行变化(14–18). TSLP激活的DC（TSLP-DCs）可诱导炎症Th2细胞分化(19)在Th2记忆细胞的维持和调节中发挥重要作用(20). 有趣的是，TSLP-DCs通过上调致敏基因，特别是细胞因子IL-25的受体IL-17RB的表达，进一步增强了Th2记忆细胞的过敏诱导特性，这表明IL-25可能在Th2记忆细胞的调节中发挥作用(20). 本文报道了人IL-25及其同源受体在造血细胞系中的独特表达模式。我们发现嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞是IL-25的主要来源之一，而TSLP-DC激活的Th2记忆细胞是人类的主要应答者。IL-25增强TSLP-DCs或稳态细胞因子诱导的Th2记忆细胞的扩张，并进一步增加其Th2细胞因子的产生。我们的研究结果表明，嗜酸性粒细胞通过产生IL-25，可能在过敏性炎症期间促进过敏原特异性Th2记忆细胞的功能能力方面发挥关键作用。
结果
TSLP-DCs诱导Th2记忆细胞强烈表达IL-25R
为了详细描述人IL-25R的表达模式，我们使用实时PCR分析检测了所有人类免疫细胞类型的cDNA档案。在所有测试的免疫细胞中，只有体内衍生的休眠Th2记忆细胞，而其他T细胞亚群或体外衍生的Th1或Th2细胞表达大量IL-25R转录物。虽然休息和激活的Th2记忆细胞都表达IL-25R基因全长和剪接亚型，其转录本约为1.5kb或0.8kb()CD3/CD28、稳态细胞因子IL-7/IL-15或特别是TSLP-DC强烈上调IL-25R转录物的表达，激活Th2记忆细胞()对应于Western blot分析显示的56-kD蛋白(). 有趣的是，通过免疫荧光分析，只有活化的Th2记忆细胞表达可检测的表面IL-25R(). 这些复合分子分析揭示了IL-25R在造血免疫细胞内的独特表达谱，并表明活化的Th2记忆细胞可能是人类对细胞因子IL-25作出反应的主要细胞。
人Th2记忆细胞IL-25R的特异性表达。（a） 如材料和方法中所述，通过定量PCR在由各种细胞类型制成的人类cDNA模板面板上测量IL-25R的表达。如前所述分离不同的T细胞亚群（参考文献20). （b） 如材料和方法中所述，使用引物通过RT-PCR证明活化的Th2记忆细胞表达IL-25R亚型。分离分类的静止T细胞亚群或由自体TSLP-DC刺激的活化Th2记忆细胞、稳态细胞因子IL-7/15和抗CD3/CD28 7 d，用于细胞裂解物制备（c）或流式细胞术分析（d）。使用生物素化山羊抗人IL-17RB多克隆抗体（c）对定量细胞裂解物进行Western blot分析。如材料和方法（d）所述，使用流式细胞术检测活化Th2记忆细胞或静止T细胞亚群的IL-25R表面表达。阴影直方图表示IL-25 R染色；开放直方图表示同型控制。图a中所列样本之间IL-25R基因表达的相对倍数差异显示在x轴上。数据来自三个独立实验之一。
IL-25促进Th2中央记忆细胞的扩张和进一步极化
为了测试IL-25对Th2记忆细胞维持的影响，将分选好的Th2记忆电池与IL-15加IL-7、抗CD3/CD28或自体CD11c在IL-25存在或不存在的情况下共培养7天+培养基中的DC（med-DC），或由TSLP或聚（I:C）激活24小时。与之前的研究一致(20)TSLP-DCs诱导了Th2记忆细胞最强劲的扩增，与IL-15加IL-7增加6倍或抗CD3/CD28增加4.5倍相比，总T细胞数增加了10倍，而多聚（I:C）-DCs或med-DCs没有促进实质性增殖(). 有趣的是，IL-25进一步增强了TSLP-DC、IL-15加IL-7或抗CD3/CD28诱导的Th2记忆细胞的增殖，导致T细胞总数分别增加了15、9或7.5倍(). 虽然可溶性IL-25R（IL-17RB-Fc）可以有效消除TSLP-DCs或抗CD3/CD28对IL-25诱导的Th2记忆细胞扩增的增强作用，但IL-25对IL-15和IL-7诱导的细胞扩增的加性作用可以部分中和(). 为了确定IL-25是否在扩增过程中调节Th2中枢记忆细胞的分化，我们检测了在存在或不存在IL-25的情况下，用TSLP DC、IL-15加IL-7、或抗CD3/CD28或仅培养基培养7天后扩增细胞产生的Th2细胞因子。我们发现，在PMA和离子霉素刺激后，通过使用细胞内细胞因子分析激活的Th2记忆细胞，IL-25诱导IL-4、IL-5和IL-13的产生大约增加了两倍，而不是TNF-α或IFN-γ()或CD3/CD28再刺激后的ELISA分析(). 此外，IL-25通过下调CC趋化因子受体（CCR）7和CD27的表达，同时维持CRTh2和CD62L，或上调CCR4、IL-4Rα和IL-7Rα的表面表达，诱导TSLP-DC驱动的扩展Th2中央记忆细胞获得效应记忆表型(; 且未描述）。然而，IL-25单独使用在培养基中或与med-DCs或poly（I:C）-DCs培养7d后，既不能诱导Th2极化，也不能诱导Th2-记忆细胞表型的改变(; 这表明只有激活的Th2记忆细胞才能对IL-25产生反应。总之，这些结果表明，IL-25可能共同刺激TSLP-DC或其他刺激物诱导的Th2记忆细胞的增殖和进一步极化，导致其获得性效应记忆表型和增强的Th2细胞功能属性。
IL-25增强了受刺激的Th2记忆细胞的增殖和Th2极化。分选的Th2记忆性T细胞仅与细胞因子IL-7、IL-15加IL-7，抗CD3/CD28或自体CD11c一起培养+在存在或不存在IL-25的情况下，DC/T细胞比率为1:2的各种刺激（x轴）激活DC 7天。在培养中使用中和重组蛋白IL-17RB-Fc。对它们的增殖反应进行了比较，图形条通过将最终细胞数除以六个单独实验中的初始T细胞数来表示扩张时间（a）。为了表征IL-25对Th2记忆细胞的影响，分选的细胞仅在培养基中培养，或在有或无IL-25的情况下用IL-15加IL-7、抗CD3/CD28或TSLP-DC扩增7天。收集增殖细胞并用PMA和离子霉素重新刺激，以分析细胞内细胞因子的产生（b），收集TSLP-DCs在IL-25存在或不存在的情况下扩增7 d的Th2记忆细胞，并用抗CD3/CD28重新刺激24 h，然后用ELISA（c）测量培养上清液中的细胞因子。为了进行表型分析，使用流式细胞术（d）检测单独在IL-25中培养的分选Th2记忆细胞，或用TSLP-DCs或TSLP-DC加IL-25扩增的分选Th1记忆细胞。阴影直方图表示Th2记忆性T细胞的染色，标记如下直方图所示；开放直方图表示同型控制。象限内的数字表示每个细胞因子染色阳性的扩张细胞的百分比。面板a、b、c和d中的结果用于单独的实验。数据表示五个实验的平均值±SD。
IL-25增强TSLP-DC激活的Th2记忆细胞产生Th2细胞因子
因为TSLP-DCs在激活的Th2记忆细胞上诱导强烈的表面IL-25R表达()，我们测试了IL-25是否可以通过TSLP-DC激活的Th2记忆细胞直接增强Th2细胞因子的产生。清洗新鲜分离的或TSLP-DC激活的Th2记忆细胞，在有或无IL-25刺激的情况下培养24小时，收集培养上清液并通过ELISA分析检测细胞因子的产生。虽然激活的Th2记忆细胞能够在培养基中自主产生适量的IL-5和IL-13，但IL-25刺激导致Th2细胞因子的产生增加了两倍以上，尤其是在没有TCR触发的情况下，IL-5和IL-13的增加更为明显，而IFN-γ或TNF-α的增加则不明显(). 相反，IL-25对静止的Th2记忆细胞没有影响()这可以解释为休眠Th2记忆细胞表面IL-25R表达水平很低(). 可溶性IL-25R可中和IL-25的刺激作用，但抗IL-4单克隆抗体不能中和IL-25-的刺激作用。这表明IL-25诱导Th2细胞因子生成增加与IL-4无关(). 这些结果表明，除了促进Th2记忆细胞的扩增和进一步的Th2极化外，IL-25还可能直接增强激活的Th2记忆电池分泌细胞因子。
IL-25通过TSLP-DC激活的Th2记忆细胞诱导细胞因子生成增加。收集、清洗并直接用IL-25刺激刚分离的静止或活化的TSLP-DC扩增7 d的Th2记忆细胞，或仅在有或无中和可溶性受体IL-17RB-FC或抗IL-4单克隆抗体的培养基中培养24 h。收集培养上清进行ELISA分析。数据表示五个实验的平均值±SD。
IL-25通过激活的Th2记忆细胞诱导GATA-3、c-maf和JunB的持续表达
为了探讨IL-25增强Th2记忆细胞Th2特性的分子机制，我们测试了IL-25在TSLP-DC或IL-15加IL-7驱动的Th2极化过程中是否调节参与Th2极化的基因的表达。定量PCR分析表明，IL-25上调了IL-4和IL-5的表达GATA3协议和c-Maf公司Th2细胞分化的主要调节因子，但不是NFATc1型或T型赌注TSLP-DCs或IL-15加IL-7驱动的Th2记忆细胞增殖中的转录物(). 为了研究IL-25为什么能直接刺激活化的Th2记忆细胞产生增强的Th2细胞因子，检测了IL-25对GATA3、c-MAF和JunB表达的影响。在用抗CD3单克隆抗体重新刺激之前，用TSLP-DCs培养7天的Th2记忆细胞被发现表达大量的GATA3、c-MAF和JunB(). 然而，通过延长TCR触发时间重新刺激TSLP-DC激活的Th2记忆细胞导致这些转录因子在12小时后逐渐丢失(). 在培养的TCR触发12 h后，IL-25的加入维持了GATA3的表达，并进一步促进了c-MAF和JunB的表达，但不促进c-Jun的表达(). 虽然已知IL-4可诱导GATA3表达，但抗IL-4单克隆抗体不能消除IL-25诱导的Th2转录因子在抗CD3单克隆抗体培养18 h期间的持续表达(). 这些结果表明，IL-25可能通过以IL-4非依赖性的方式维持Th2转录因子的表达来增强Th2记忆细胞的极化和细胞因子的产生。
IL-25上调GATA3、c-MAF和JunB的表达。分类的Th2记忆T细胞与细胞因子IL-15加IL-7或TSLP-DCs在有或无IL-25的情况下培养7天。如材料和方法中所述，通过实时PCR测量参与Th2细胞分化的指示基因的表达水平。（a） 样本之间每个基因表达变化的折叠差异标记在y轴上。收集经TSLP-DCs扩增7 d的Th2记忆细胞（0 h；b），并在收集前用抗CD3单克隆抗体在有或无IL-25（b和c）或抗IL-4单克隆抗体（c）的情况下重新刺激不同时间（b）或18 h（c），然后进行Western blot分析。数据来自三个独立实验中的一个。
嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞激活后分泌IL-25
为了在人类中寻找IL-25产生细胞，检测了造血细胞系中IL-25转录物的表达。我们发现，通过定量实时PCR和RT-PCR分析，来自正常或过敏受试者的静息和激活的外周血嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞表达了大量IL-25转录物(). 尽管体外衍生肥大细胞(11)经PMA和离子霉素激活后，IL-25转录物表达水平较低，其他细胞系，包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞、浆细胞样DC和髓样DC均未表达可检测的IL-25 mRNA水平(). 此外，仅用培养基或过敏原豚草提取物培养的角质形成细胞也被发现表达IL-25转录物(). 这些分子分析表明，嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞可能具有分泌IL-25蛋白的潜力。为了在蛋白质水平上证实这些观察结果，并进一步研究嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞产生IL-25的调节，只在培养基中培养分离的嗜酸性粒细胞核或嗜碱性粒细胞核，或在已知的激活嗜酸性粒核细胞或嗜碱性细胞的条件下培养3d，并收集培养上清液进行ELISA分析。我们发现，IL-5单独诱导嗜酸性粒细胞产生IL-25，IL-5与GM-CSF或GM-CSF+IL-3的组合，而不是FMLP或趋化因子eotaxin-2，可以进一步上调IL-25的产生(). 此外，从正常或过敏受试者分离的嗜酸性粒细胞在这些培养条件下产生类似水平的IL-25(). 虽然单独在IL-3中培养的嗜碱性粒细胞不产生IL-25，但IgE交联可触发嗜碱性粒菌产生强烈的IL-25(). 有趣的是，在IgE交联后，过敏受试者的活化嗜碱细胞产生的IL-25似乎是非过敏受试物嗜碱细胞的两倍(). 此外，我们无法通过培养的角质形成细胞检测到分泌的IL-25蛋白（未公开数据）。这些结果表明，激活的先天效应器、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞可能是人类产生IL-25的主要细胞类型。
活化的嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞是IL-25的产生者。如材料和方法中所述，通过定量PCR在由不同细胞类型（a）制成的人类cDNA文库面板上测量IL-25转录物的表达，或通过RT-PCR分析（b）进行检测。在RNA分离用于基因表达分析（a）或收集上清液用于使用ELISA分析测量IL-25（b）之前，将从正常或特应性受试者获得的纯化的嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞与指示的细胞因子或刺激物一起培养3天。图a中所列样本之间IL-25基因表达的相对倍数差异显示在x轴上。面板a中的数据来自三个独立实验之一。面板c中的数据分别来自五名正常人或四名特应性受试者，代表测试样本（c）的平均值±SD。白线表示中间车道已拼接。
嗜酸性粒细胞衍生IL-25诱导IL-5生成增加
嗜酸性粒细胞和Th2记忆细胞对IL-25及其同源受体的相互表达，促使我们研究嗜酸粒细胞是否可以通过产生IL-25来调节Th2记忆电池的功能。收集静止的Th2记忆细胞或TSLP-DCs刺激的Th2存储细胞7天，并在单独培养基中培养，或在有或无IL-17RB-FC或抗IL-4单克隆抗体的情况下与新鲜分离的嗜酸性粒细胞一起培养。共培养3d后，收集上清液，用ELISA分析培养的Th2记忆细胞产生的细胞因子。虽然嗜酸性粒细胞并没有调节静止Th2记忆细胞的细胞因子生成，但嗜酸性粒分子强烈促进TSLP-DC激活的Th2记忆电池的IL-5生成(). 嗜酸性粒细胞衍生的IL-25诱导活化的Th2记忆细胞产生IL-13和IL-4，但不产生IFN-γ(; 且未描述）。嗜酸性粒细胞增强TSLP-DC激活的Th2记忆细胞产生IL-5的能力在很大程度上被可溶性IL-25R而非抗IL-4单克隆抗体所抵消(). 同样，过敏受试者的嗜酸性粒细胞通过自身TSLP-DC激活的Th2记忆细胞而不是静止的Th2储存细胞产生IL-25，从而增强IL-5的生成(). 因为嗜酸性粒细胞已被证明表达Th2细胞因子转录物(21)，我们研究了共同培养的嗜酸性粒细胞本身是否有助于提高IL-5的产生。尽管TSLP-DC激活了CD4+仅在培养基中培养的Th2记忆细胞在PMA和离子霉素刺激后能够产生IL-5，共同培养的嗜酸性粒细胞诱导CD4产生IL-5的大量增加+-活化的Th2记忆细胞()相反，我们未能通过CD4检测到明显的IL-5生成−共培养嗜酸性粒细胞的细胞内细胞因子分析(). 为了测试嗜酸性粒细胞是否对IL-25产生反应，将IL-5、GM-CSF和IL-3激活的嗜酸性粒淋巴细胞洗涤并在有或无IL-25处理的培养基中培养3 d。我们发现，激活的嗜酸粒细胞并没有产生可检测的IL-4或IL-5水平，但产生低水平的IL-13，ELISA分析显示，IL-25治疗并没有增加其Th2细胞因子的产生（未公布的数据）。这些结果表明，激活而非静止的Th2记忆细胞可以持续产生低水平的IL-5，从而促进共同培养的嗜酸性粒细胞的寿命和活化。反过来，激活的嗜酸性粒细胞产生IL-25，并通过TSLP-DC激活的Th2记忆细胞（而非共同培养的嗜酸性细胞本身）诱导增加的Th2细胞因子产生，尤其是IL-5。
嗜酸性粒细胞分泌的IL-25促进TSLP-DC激活的Th2记忆细胞产生细胞因子。在存在或不存在抗IL-4 Abs或IL-17RB-Fc重组蛋白（a）的情况下，仅在培养基中培养正常（a和b）或特应性受试者（a）纯化的静止或TSLP-DC激活的Th2记忆细胞，或与自体嗜酸性粒细胞共培养3 d。收集共培养上清液，使用ELISA分析（a）测量Th2细胞因子的产生。收集在单独培养基或与嗜酸性粒细胞共培养3天的活化Th2记忆细胞，并在用CD4和所指示的细胞内细胞因子染色之前用PMA加离子霉素再刺激。象限内的数字表示每个细胞因子染色阳性的细胞百分比。数据来自五名正常或四名特应性受试者，代表测试样本的平均值±SD。
IL-25/IL-25R转录物的表达与慢性过敏性疾病有关
为了寻找IL-25和IL-25R表达在人类过敏性疾病中的相关性，我们进行了广泛的定量实时PCR分析，以检测慢性哮喘和正常肺组织以及各种Th1细胞和Th2细胞介导的皮肤病皮损中IL-25与IL25R转录物的表达。如所示IL-25和IL25R转录物的表达在慢性哮喘肺部以及特应性皮炎皮损中显著升高，但在Th1细胞介导的皮肤病患者中没有显著升高，这意味着它们在过敏性炎症中的潜在作用。
哮喘和特应性哮喘患者IL-25和IL-25R转录物的表达。通过定量PCR在哮喘或正常受试者支气管活检和皮肤活检（包括寻常型银屑病、皮肤红斑狼疮、结节性痒疹、特应性皮炎和正常受试人）的cDNA模板上测定IL-25和IL-25R转录物的表达。样本之间基因表达的相对折叠差异显示在x轴上。
讨论
与其他IL-17细胞因子家族成员不同，IL-25（IL-17E）在动物研究中被证明能够放大Th2细胞介导的炎症反应(5–10). IL-25蛋白的全身给药(8,9)或IL-25过度表达(5,7)诱导Th2细胞因子和嗜酸性粒细胞趋化因子的产生增加，导致嗜酸性细胞增多、血清IgE升高和许多组织的病理改变。虽然动物模型研究表明IL-25可能在过敏性疾病中发挥作用，但IL-25参与过敏性免疫反应的机制以及对该细胞因子作出反应的细胞类型仍不清楚。外源性IL-25蛋白在诱导急性肺部炎症中的作用显示依赖于CD4+T细胞(22)或由不明IL-5产生细胞介导(8). 最近的其他动物研究表明，IL-25在诱导保护性2型免疫鼠鞭毛虫感染是淋巴细胞依赖性的(6)，而非–B或–T c-kit+细胞负责快速清除巴西尼波氏线虫感染(10). 这些使用不同动物模型的发现困惑了我们对IL-25调节2型免疫的细胞和分子机制的理解。
循环CD4的鉴定+将前列腺素D2受体（CRTH2）表达为人类Th2中枢记忆T细胞的T细胞亚群，并将TSLP-DCs在Th2记忆细胞维持和承诺方面的功能联系起来，使我们揭示了自然发生的Th2记忆电池的许多独特特征。Th2记忆细胞的一个显著特征是其选择性IL-25R表达(20). 尽管小鼠IL-25的对应物-无应答B或T c-kit+我们在这项研究中证明，除了肺成纤维细胞外，人类的细胞仍然难以捉摸(23)，人CD4+CRTH2公司+表达高水平功能性IL-25R的Th2记忆性T细胞可能是过敏性炎症期间对IL-25作出反应的主要细胞类型之一。IL-25R在Th2记忆细胞上的选择性表达可分为两个阶段。在静息期，循环Th2中央记忆细胞IL-25R转录物的表达是原始或其他T细胞亚群的1000倍(20). 然而，循环Th2记忆性T细胞表达低水平的表面IL-25R，对激活的嗜酸性粒细胞分泌的重组IL-25或IL-25均无反应。在TSLP-DCs刺激后，激活的Th2记忆细胞进一步上调IL-25R转录物和表面蛋白的表达，并对IL-25刺激产生反应。IL-25通过上调转录因子的基因表达，共同刺激Th2记忆细胞的增殖，增强其Th2极化和细胞因子的产生GATA-3协议,c-MAF公司，以及6月B日在TSLP DC推动的扩张期间。此外，IL-25可以上调Th2中央记忆细胞表面CCR4、IL-4Rα和IL-7Rα的表达，同时维持CRTH2和CD62L，但下调CCR7和CD27的表达。这些结果表明，IL-25和TSLP-DC可以诱导局部炎症部位浸润的Th2中央记忆细胞进一步分化和扩张，从而增强Th2功能和获得效应记忆表型。此外，IL-25可以通过以不依赖于IL-4的方式维持转录因子GATA-3、c-MAF和junB的表达，直接刺激活化的Th2记忆细胞产生升高的IL-5和IL-13。总之，这些结果表明，IL-25可能在两个阶段调节Th2记忆细胞：（a）增强扩张和Th2极化；（b）维持其Th2细胞激活状态，从而导致Th2免疫反应增强。
IL-25最初被描述为Th2细胞衍生的细胞因子(9)也被发现由肥大细胞表达(11)在小鼠研究中。然而，尚不清楚这些细胞是否能分泌具有生物活性的IL-25蛋白；此外，人类IL-25的细胞来源从未被提及。在本文中，我们表明人类嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞、肥大细胞和角质形成细胞，而不是其他免疫细胞类型，具有表达IL-25转录物的能力。更重要的是，我们证明了人类嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞在激活后分泌生物活性IL-25蛋白。共培养嗜酸性粒细胞可通过自身TSLP-DC激活的Th2记忆细胞以IL-25（而非IL-4）依赖的方式诱导IL-5和GM-CSF的生成增强。传统上，嗜酸性粒细胞被认为是过敏和抗寄生虫反应的终端效应器，主要通过释放促炎介质发挥作用(三). 最近，越来越多的证据表明嗜酸性粒细胞可能能够调节CD4的功能+Th2细胞(24,25). 过敏个体中的组织浸润而非循环嗜酸性粒细胞表达HLA-DR(24)这表明招募的嗜酸性粒细胞在调节局部Th2记忆细胞中具有功能性作用。我们发现，除HLA-DR外，嗜酸性粒细胞还可以通过产生IL-25来调节激活的Th2记忆细胞的功能。相反，Th2记忆细胞产生的细胞因子增加促进了局部嗜酸性粒细胞的存活时间延长和活化。与慢性过敏性疾病组织相关的IL-25/IL-25R转录物高表达的发现进一步表明，IL25/IL-25R可能是维持人类过敏性炎症的关键分子对，因此可能是开发人类过敏性疾病新疗法的潜在靶点。我们的发现证实了一个新概念：即嗜酸性粒细胞/嗜碱性粒细胞和Th2记忆细胞之间可能发生IL-25介导的协同作用，从而在先天效应器和适应性免疫之间传播正反馈回路，导致过敏性炎症的放大。这些效应器之间的相互作用可能代表了过敏性炎症的一个关键调节机制，进一步了解这一过程可能会为治疗提供新方法。
材料和方法
髓系DC、Th2记忆细胞、嗜酸性粒细胞和其他细胞系的纯化。
这项研究得到了德克萨斯大学医学博士安德森癌症中心或贝勒医学院人类研究机构审查委员会的批准。CD11c公司+血统−如前所述，使用FACSAria（BD Biosciences）从健康捐献者（在墨西哥湾沿岸地区血液中心）或过敏受试者（在贝勒医学院）的血液中分离DC(15). 分类CD11c+纯度>99%的DC在含有2%人AB血清（Gemini Bio-Products）的Yssel培养基中培养，或用15 ng/ml TSLP、10μg/ml poly（I:C）刺激24小时+根据制造商的说明，使用CD4 T细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec）富集T细胞。浓缩CD4+T细胞染色并分类为CD4+CD45RO+CRTH2公司+如前所述，纯度>99%的Th2记忆细胞(20). 为了分离嗜酸性粒细胞，外周血样本在Ficoll-Paque Plus梯度上离心，以分离粒细胞和单核细胞。去除白细胞层后，通过在无菌冷水中孵育30秒来溶解红细胞。根据制造商的说明，使用嗜酸性粒细胞分离试剂盒（Miltenyi Biotec）从剩余的白细胞中进一步纯化嗜酸性粒细胞核。分离的嗜酸性粒细胞被胞浆固定，并用Giemsa染色以检查纯度（>95%）。嗜碱性粒细胞根据CRTH2的表达进行分类你好CD4细胞−血统−纯度>99%。如前所述分离NKT细胞、B细胞、单核细胞和浆细胞样DC(20,26–28). 如前所述，人类原始肥大细胞是在体外生成的(29). 原代人类表皮角质形成细胞（Cambrex/Bio Whitakker）保存在角质形成上皮细胞生长培养基（Cambrex/Bio Whitaker）中，或在RNA分离前用10 ng/ml豚草提取物刺激过夜。
DC–T细胞和嗜酸性粒细胞–Th2记忆细胞共培养。
培养24小时后，刺激CD11c+收集DC，清洗，并与2×10共同培养4自体CD4+CRTH2公司+Th2记忆细胞一式三份，DC/T细胞比为1:2。在一些实验中，CD4+CRTH2公司+Th2记忆细胞与10μg/ml固定化抗CD3（OKT3）和1μg/ml可溶性抗CD28（L293.1）或20 ng/ml IL-7、10 ng/ml IL-15或100 ng/ml白介素-25（R&D系统）培养。嗜酸性粒细胞–Th2记忆细胞共培养，分类CD4+CRTH2公司+Th2记忆细胞被TSLP-DCs激活并扩增7天105活化CD4+CRTH2公司+收集并清洗Th2记忆细胞，然后与2.5×10共培养5分离嗜酸性粒细胞3天。在一些实验中，新分离的CD4+CRTH2公司+Th2记忆细胞与纯化的嗜酸性粒细胞直接共培养3天。为了检测T细胞的增殖量，使用血细胞仪（Bright-Line/1492；Hausser Scientific）用台盼蓝计数收集的细胞以排除死细胞。在某些分析中使用了以下试剂：1μg/ml抗IL-4或1μg/ml IL-17RB-Fc（研发系统）。
细胞因子产生分析。
在原代DC–T细胞培养中，分选的Th2记忆细胞与自体TSLP-DC在有或无IL-25的情况下共同培养7天。将扩增的T细胞洗涤，并用5μg/ml的固定化抗CD3（OKT3）和1μg/ml可溶性抗CD28（L293.1）重新刺激24小时。收集的上清液通过ELISA评估IL-4、IL-5、，IL-13、GM-CSF、IFN-γ和TNF-α的产生（研发系统）。使用PE标记的IL-4、IL-5和IL-13进行细胞内细胞因子染色；FITC–肿瘤坏死因子-α；和别藻蓝蛋白–IFN-γ（BD Bioscience），如前所述(13). 为了测量分泌的IL-25，通过ELISA（PeproTech）评估从嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞收集的上清液，上清液由细胞因子组合（10 ng/ml IL-5、5 ng/ml GM-CSF和5 ng/ml IL-3）或1μg/ml IgE交联（Sigma-Aldrich）刺激。
细胞表面标记分析。
新隔离或激活的CRTH2+CD4细胞+在存在或不存在IL-25的情况下，与TSLP-DC共同培养7天的Th2记忆细胞被清洗，用FcR阻断试剂（Miltenyi Biotec）阻断，并用PE-标记的抗CRTH2、CCR7、CD62L、CD27和CCR4染色（均来自BD Biosciences），然后用FACSCalibur（BD Biocciences，BD Bios）进行分析。在一些实验中，分类静止T细胞亚群或激活CRTH2+CD4细胞+Th2记忆细胞用生物素化山羊抗人IL-17RB多克隆抗体（R&D系统）染色，并用链霉亲和素-PE显示。
RNA分离和实时定量RT-PCR。
用RNeasy试剂盒（QIAGEN）从分选细胞中分离出总RNA样本。cDNA模板是使用SuperScript II（生命技术）合成的。使用Primer Express（2.0版；Applied Biosystems）选择寡核苷酸引物。使用检测系统（ABI Prism 7900；Applied Biosystems）进行实时定量PCR。实时PCR引物如下：IL-25R，5′-GAGAGCGACCGTTCAATGT-3′和5′-TCACTCTGTGATGGCC-3′；和IL-25，5′-CACAGGTGTTGCATTCTTGG-3′和5′-TGGCTGTAGGTGGTGTCC-3′。用于分析GATA3协议,c-maf公司,T型赌注,NFATc1型,白介素-4，以及白介素-5基因表达、实时PCR探针直接从制造商处购买（Applied Biosystems）。将样品中等量的RNA用作PCR模板，以获得阈值周期（Ct吨)和Ct吨使用已知的C规范化t吨从18S RNA获得ΔCt吨为了检测不同细胞中基因表达的相对水平，ΔΔCt吨使用ΔC计算值t吨与最低表达式级别关联的值作为基线。ΔΔCt吨然后转换为表达式增加2的实际值ΔΔCt为了进行RT-PCR分析，使用以下引物扩增IL-25R转录物：5′-ATGCGCTCGTGCTGCTAAGCCT-3′和5′-TAACTGGTTCTGGGCAGAAGTGCATT-3′，退火温度为65°C。使用以下引物扩增IL-25：5′-CACAGGTGTTGCATTCTTGG-3′和5′-TGGCTGTAGGTTGGGTTCCC-3′，退火温度为62℃。
免疫印迹分析。
排序的CRTH2+CD4细胞+用TSLP-DCs扩增并维持Th2记忆细胞。激活的CRTH2+CD4细胞+收集、洗涤Th2记忆细胞，并在收获前用1μg/ml的固定化抗CD3单克隆抗体再刺激不同时间。根据制造商的说明（皮尔斯化学公司）制备的细胞核裂解物用针对GATA-3、c-MAF、JunB、c-Jun（圣克鲁斯生物技术公司）和组蛋白H3（细胞信号）的抗体进行Western blot分析。
皮肤和支气管活检样本。
在获得患者的知情同意后，从患有特应性皮炎、寻常型银屑病、红斑狼疮（丘疹和盘状）、或橡胶苔藓的患者或正常健康人的病变或非病变皮肤上进行3-6mm穿刺活检。皮肤样品立即在液氮中冷冻并储存在−80°C下。该研究得到了海因里希-海因大学皮肤病学系当地伦理委员会的批准。支气管活检取自特应性哮喘患者和正常人。这些受试者的特征之前已经描述过(16). 这项研究得到了伦敦国王学院医院伦理委员会的批准。
致谢
我们感谢Karen Ramirez、Zhiwei He和Eric Wieder对细胞分类的支持。
Y.-H.Wang获得Tanox，Inc.赞助的博士后奖学金。这项工作得到了国家过敏和传染病研究所U19 AI071130-0（给Y.-J.Liu）的资助，以及Sandler哮喘研究项目（给Y.-J.刘）的资助。
作者没有相互冲突的经济利益。
笔记
缩写词：CCR，CC趋化因子受体；药物-DC、CD11c+介质中的直流电；胸腺基质淋巴细胞生成素；TSLP-DC，由TSLP激活的DC。
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