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《实验医学杂志》。2007年8月6日；204(8): 1849–1861.
数字对象标识：10.1084/jem.20070663
预防性维修识别码：项目经理2118657
PMID：17635957
第条

人Th17细胞的表型和功能特征

弗朗西斯科·安南齐亚托,1 洛伦佐·科斯米,1 维罗妮卡·桑塔拉斯基,1 劳拉·马吉,1 弗朗西斯科·利奥塔,1 贝内德塔·马津吉,1 埃莉亚娜·帕伦特,1 露西娅·菲尔,1 西蒙娜·费里,1 弗朗西丝卡·弗罗萨利,1 弗朗西斯科·朱迪奇,2 保拉·罗马尼尼,1 保拉·帕伦奇,1 弗朗西斯科·托内利,2 恩里科·马吉,1和塞尔吉奥·罗马尼尼1
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

辅助性T细胞（Th）17是一种新型的CD4+T细胞亚群，能够抵抗细胞外微生物，但也会导致小鼠自身免疫性疾病。然而，它们在人类中的特性只有部分已知。我们证明了克罗恩病患者肠道中存在Th17细胞，其中一些细胞同时产生白细胞介素（IL）-17和干扰素（IFN）-γ（Th17/Th1）。Th17和Th17/Th1克隆均表现出IL-23R、CCR6和转录因子RORγt的选择性表达，并表现出类似的功能特征，如帮助B细胞的能力、低细胞毒性和对自身调节性t细胞调节的敏感性差。有趣的是，这些亚群也表达Th1-转录因子T-bet，在IL-12存在下刺激这些细胞可下调RORγT的表达和IL-17的产生，但可诱导IFN-γ。IL-23的存在部分抑制了这些作用。在新获得的产生IL-17的外周血和扁桃体CD4+T细胞中观察到类似的受体表达和功能能力。人类Th17细胞选择性标记物的展示可能有助于我们了解其致病作用。此外，鉴定具有Th1和Th17共同特征的细胞亚群可能是由IL-12对Th17细胞的调节引起的，这可能会引发有关Th17和Th1之间发育和/或功能关系的新问题。

适应性效应器CD4+Th介导的免疫应答是高度异质性的，基于不同亚群的发育，这些亚群具有不同的细胞因子生成特征。最初，在小鼠和人类中都发现了两种极化形式的Th效应器，即1型（Th1）或2型（Th2）(1,2). Th1细胞产生IFN-γ，主要用于抵抗细胞内微生物，而Th2细胞产生IL-4、-5、-9和-13，参与抵抗胃肠道线虫，但也负责过敏性疾病(三,4). 还检测到第三种能够产生Th1和Th2细胞因子的Th，即0型（Th0）(5). 最近，一种新的Th亚群被描述为Th17，它与Th1、Th2和Th0细胞不同(6). Th17细胞起源于与Th1或Th2不同的极化条件下，已发现Th1或Th2分别是在抗原呈递给IL-12或-4的幼稚Th时的早期存在(7). 初步调查结果表明伯氏疏螺旋体，IL-17可以由T细胞产生，而不依赖于Th1或Th2细胞因子的产生(8). 然而，导致Th17谱系发现的主要突破来自小鼠自身免疫模型。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）和胶原蛋白诱导性关节炎（CIA）是两种典型的自身免疫小鼠模型，根据中和抗体（Ab）治疗可消除疾病发展的研究，这两种模型在历史上都与未经检查的Th1反应有关针对IL-12p40或IL-12 p40亚单位缺陷的基因靶向小鼠(9,10). 然而，随着发现一个新的IL-12家族成员IL-23与IL-12共享p40亚单位，但包含另一个亚单位p19，该亚单位不同于IL-12的p35亚单位(11)发现在IL-23缺乏的小鼠中EAE和CIA均被清除，但IL-12不被清除(12,13). 此外，缺乏IL-12R复合物的小鼠也会死于EAE(14)表明IL-23而非IL-12与自身免疫密切相关，至少在这些模型中如此。虽然IL-23似乎是Th17介导的免疫病理学所必需的，但最近的报告表明，IL-23并非Th17承诺所必需的物质，相反，它似乎对扩增和/或稳定Th17表型很重要(15,16). TGF-β和IL-6的伴随活性似乎是启动Th17分化所必需的(17,18). 此外，IL-1β和TNF-α可增强TGF-β和IL-6诱导的Th17反应，但不能替代这两种细胞因子(19). 最后，对产生IL-17的CD4+T细胞的转录因子表达的分析表明，与Th1极化细胞相比，Th17效应器缺乏T-bet和Hlx的表达，与Th2极化人群相比，缺乏GATA-3的表达，支持并扩展了先前的发现，即Th17是不同于Th1和Th2的效应器谱系的产物(20,21). 最近的证明支持了后一项发现，即孤儿核受体RORγt指导小鼠Th17的分化程序(22).

到目前为止，关于Th17的大部分知识都来源于在实验动物模型中进行的研究，而关于Th17在人类中的信息很少。通过原位杂交发现，多发性硬化症患者脑脊液中表达IL-17mRNA的细胞数量高于外周血（PB）中的细胞数量(23). 此外，IL-17和-23p19都存在于大多数类风湿关节炎（RA）患者的血清、滑液和滑膜活检中，而在骨关节炎中两者都不存在(24,25). 在系统性红斑狼疮患者的血清和病变组织中也检测到IL-17(26)，在系统性硬化症中(27)炎症性肠病的血清和结肠活检(28,29)以及镍致接触性皮炎或银屑病患者的受损皮肤(30). 然而，所有这些研究都是通过评估组织中IL-17 mRNA的存在和/或测量生物液中的IL-17来进行的。只有两份报告显示接触性皮炎患者皮肤产生的少量T细胞克隆产生IL-17(30)或RA患者的滑膜和滑液(31)；然而，关于人类IL-17产生T细胞的表型和功能特征，没有提供更多信息。

在本研究中，我们证明克罗恩病（CD）患者肠道中存在显著比例的Th17和产生IFN-γ的Th17（Th17/Th1）。当体外扩增和克隆时，Th17和Th17/Th1克隆显示IL-23R、CCR6和转录因子RORγt的选择性表达。Th17和Th17/Th1克隆均显示出极好的帮助B细胞的能力，低细胞毒潜能，并降低了自身CD4+Foxp3+调节性T（T reg）细胞抑制的敏感性。在从正常肠道获得的产生IL-17的T细胞克隆以及新获得的PB和扁桃体产生IL-17CD4+T细胞中观察到类似的受体表达和功能。有趣的是，Th17和Th17/Th1克隆也表达Th1相关转录因子T-bet，在IL-12存在下培养它们可以下调RORγT和IL-17的表达并上调IFN-γ的产生，这表明，至少在人类中，Th17和Th1之间可能存在发育和/或功能关系。

结果

CD患者体内产生IL-17的CD4+T细胞的体外演示及其体外扩增和克隆

用PMA和离子霉素刺激10名健康人的PB，以及10名CD患者的PB和疾病影响区的CD4+T细胞后，通过流式细胞术评估IL-17产生细胞的存在。作为额外的对照，还对10名因结肠癌而接受结肠切除术的受试者的明显健康肠道区域中的CD4+T细胞进行了评估。健康人PB中Th17的比例始终小于1%，来自结肠癌患者明显健康肠道区域或CD患者PB的CD4+T细胞中Th17比例仅略高，而在同样患有CD的受试者受疾病影响的肠道区域中，Th17比例明显更高(图1 A). 在五名溃疡性结肠炎患者受疾病影响的肠道区域的CD4+T淋巴细胞中，发现IL-17产生细胞的比例相当（未公布数据）。少量但一致的产生IL-17的CD4+T细胞来源于健康受试者的PB或健康肠道区域（未描述），以及CD受试者的PB或受疾病影响的肠道区域(图1、B和C)也显示出产生IFN-γ的能力，而同时产生IL-17和-4的细胞几乎无法检测到。值得注意的是，CD受试者的肠道T细胞中产生IFN-γ的Th17比例高于PB CD4+T细胞(图1、B和C). 发现CD45RO+人群中含有产生IL-17的CD4+T细胞，这些细胞似乎都是TCRαβ+细胞（未公布的数据）。

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人Th17和Th17/Th1的体外鉴定。（A） 采用流式细胞术对来自健康受试者PB、结肠癌受试者健康肠道区域以及CD受试者的PB和疾病影响肠道区域的CD4+T细胞进行细胞内染色，以评估其在PMA和离子霉素刺激后产生IFN-γ（黑色）、IL-4（灰色）或IL-17（白色）的能力。（B） CD4+T细胞中能够产生IFN-γ（黑色）或IL-4（灰色）的IL-17产生细胞在CD4受试者PB或肠道中的比例。A和B列代表每组10名不同受试者的平均值（±SEM）。a对c，P<0.05；b对c，P<0.05；d对e，P<0.05。（C） 一名CD患者PB和肠道的典型流式细胞术分析。

为了更好地研究产生IL-17的CD4+T细胞的表型和功能特征，通过使用抗CD3和-CD28单克隆抗体的混合物在IL-2的存在下刺激7 d，在体外扩增10名CD患者PB或受疾病影响的肠道区域中存在的CD4+T细胞。在这些条件下，来自这两种来源的CD4+T母细胞的显著比例表明，在用PMA和离子霉素刺激后，它们能够产生IL-17，而来自肠道的CD4+T母细胞明显更高(图2 A). 值得注意的是，与上述体外研究结果一致，其中一些细胞同时产生IL-17和IFN-γ。相反，几乎没有观察到CD4+T细胞同时产生IL-17和-4(图2 B). 在有限稀释条件下，从CD受试者受疾病影响的肠道中随机选择的两种培养物中克隆T细胞，并在异基因辐照饲养细胞和IL-2的存在下进行扩增。获得217个CD4+T细胞克隆，并在用PMA加离子霉素刺激后通过流式细胞术评估每个克隆的细胞因子产生（IL-4、IFN-γ和IL-17）。仅产生IL-17的T细胞克隆(n个=11），仅IFN-γ(n个=72），或仅IL-4(n个=7）分别被归类为Th17、Th1和Th2，而那些同时产生IL-4和IFN-γ但不产生IL-17的(n个=66），分类为Th0，那些同时产生IL-17和IFN-γ(n个=50）或IL-17和-4(n个=0）分别归类为Th17/Th1或Th17/Th2。11个克隆明显不产生三种细胞因子中的任何一种(图2、C和D).

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通过体外扩增PB和肠道中的CD4+T细胞和CD患者肠道中的T细胞克隆产生细胞因子。（A） 用抗CD3加抗CD28单克隆抗体和IL-2刺激10名CD患者PB或受疾病影响的肠道区域的CD4+T细胞7天，并评估其产生IFN-γ（黑色）、IL-4（灰色）或IL-17（白色）的能力（参见图1图例）。列表示平均值（±SEM）。a对b，P<0.05。（B） 来自同一CD受试者的扩张PB或肠道CD4+T细胞的代表性流式细胞术分析。（C） 从两名CD患者疾病影响肠道区域的CD4+T细胞中获得217个T细胞克隆（圈），并通过流式细胞术检测PMA和离子霉素刺激后细胞内IFN-γ、IL-4和IL-17的合成。当产生T细胞母细胞的比例大于20%时，每个克隆产生的细胞因子被任意认为是值得注意的。（D） 每种克隆的细胞因子产生的代表性流式细胞术分析。

Th17和Th17/Th1克隆选择性表达IL-23R和CCR6

首次检测了Th17和Th17/Th1克隆中IL-12Rβ2和IL23-R的表达，并与其他类型T细胞克隆中的表达进行了比较。IL-12Rβ2在所有类型的克隆中均有表达(图3 A)而IL-23R似乎由Th17和Th17/Th1克隆选择性表达(图3 B). 然而，该受体显然不参与Th17或Th17/Th1细胞增殖，因为IL-23对这两种类型的克隆（未描述）都没有发挥任何增殖活性，即使在用抗CD3加抗CD28抗体刺激后也是如此(图3 C). 相反，IL-2、IL-12，主要是IL-15的添加，增强了抗CD3/28抗体诱导的Th17和Th17/Th1克隆的增殖(图3 C). 在趋化因子R中，Th17和Th17/Th1克隆的CXCR4和CXCR6的高表达与Th1或Th2克隆相同（未发表数据）。CCR4水平显著提高(图4 A)和CCR5(图4 B)与所有其他类型的克隆相比，在Th17克隆中发现，而Th17和Th17/Th1明显缺乏CXCR3-A、CXCR3-B、CCR3、CCR8和CCR9（未描述）。相反，CCR6通过Th17和Th17/Th1选择性表达，但不通过Th1、Th2或Th0克隆表达(图4C). Th17克隆表达的CCR6具有功能活性，因为其配体CCL20在Th17克隆中诱导了钙内流，但在Th1克隆中没有，而CCR9配体CCL25没有发挥任何作用(图4 D).

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Th17和Th17/Th1克隆的IL-23R和-12Rβ2表达及其在细胞增殖中的作用。在Th0、Th1、Th2、Th17和Th17/Th1克隆中测量IL-12Rβ2（A）和-23R（B）mRNA水平。列表示从每种类型的10个克隆中获得的平均值（±SEM），Th2除外，其中它们代表7个克隆。（A） d对A，P<0.05；d对b，P=ns；d对c，P<0.05；d与e之比，P=ns；e对a，P<0.05；e对b，P=ns；e对c，P<0.05。（B） i对f，P<0.01；i对g，P<0.05；i对h，P<0.05；i对l，P=ns；l对f，P<0.001；l对g，P<0.05；l对h，P<0.05。（C） Th17和Th17/Th1克隆在使用抗CD3+抗CD28抗体刺激4d后的增殖反应，不添加或添加IL-2（黑色）、IL-12（灰色）、IL-15（白色）或IL-23（条纹）。柱代表有丝分裂指数的平均值（±SEM）（在存在抗CD3/28 Ab的情况下获得的cpm与所示细胞因子的比值，以及在仅使用抗CD3/CD28 Ab获得的cpm之间的比值），该值是通过测试每种类型的七个克隆获得的。

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通过Th17和Th17/Th1克隆选择性表达功能活性CCR6。Th0、Th1、Th2、Th17和Th17/Th1克隆中CCR4（A）、CCR5（B）和CCR6（C）mRNA水平。列表示从每种类型的10个克隆中获得的平均值（±SEM），Th2除外，其中它们代表7个克隆。（A） d对A，P<0.005；d对b，P<0.05；d对c，P<0.05；d对e，P<0.005；e与a之比，P=ns；e对b，P=ns；e对c，P=ns。（B） d对a，P<0.001；d对b，P<0.05；d对c，P<0.05；d对e，P<0.01；e对a，P<0.05；e对b，P=ns；e对c，P=ns。（C） d对a，P<0.0001；d对b，P<0.001；d对c，P<0.001；d对e，P=ns；e对a，P<0.05；e对b，P<0.05；e对c，P<0.05。（D） 将来自一个Th17和一个Th1克隆的细胞与Fluo-4一起孵育，并单独用培养基、CCR6配体、CCL20、CCR9配体、CCL25或离子霉素刺激。其他两个Th17和三个Th17/Th1克隆也获得了类似的结果。

Th17和Th17/Th1克隆表现出类似的功能特性

然后评估Th17和Th17/Th1克隆帮助B细胞产生抗体和显示细胞毒活性的能力，以及它们对自体CD4+CD25+Foxp3+T细胞克隆抑制活性的敏感性，并与Th1和Th2克隆评估的相同活性进行比较。Th17和Th17/Th1克隆均能诱导B细胞产生IgM、IgG和IgA，但不产生IgE，后者似乎是Th2克隆的一种选择性特性(图5 A). 就细胞毒性潜力而言，Th17、Th17/Th1和Th2克隆表现出颗粒酶A的表达水平显著低于Th1克隆，而Th17/Th克隆的颗粒酶水平高于Th17和Th2的颗粒酶(图5 B). 此外，Th17和Th17/Th1克隆的细胞毒性明显低于Th1克隆(图5 C). 最后，在自体CD4+CD25+T调节细胞克隆存在的情况下，评估Th17和Th17/Th1克隆在异基因刺激下增殖的能力。该克隆表达Foxp3，对PMA和离子霉素的刺激不产生细胞因子(图6 A)，并显示出抑制自体CD25−T细胞以及Th1或Th2克隆的增殖反应的能力(图6 B). 相比之下，Th17和Th17/Th1对相同自体T reg克隆的抑制活性的敏感性显著降低(图6 B).

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Th17和Th17/Th1克隆的B细胞辅助能力和细胞毒潜能。（A） 用ELISA测定与自体抗CD3抗体刺激的Th1、Th2、Th17或Th17/Th1克隆共培养7天的B细胞上清液中的IgM、IgG、IgA和IgE水平。柱代表每组五个不同克隆的平均值（±SEM）。b条与a、 P<0.05；c与a、 P<0.05；b对c，P=ns。（B） 通过流式细胞术评估不同类型克隆的颗粒酶A表达。柱代表每种类型的七个不同克隆获得的平均值（±SEM）。c对a，P<0.005；c对b，P=ns；c对d，P<0.05；d与a比较，P＜0.01；d对b，P=ns。（C） 通过流式细胞术检测靶细胞P815上的AnnexinV结合来评估不同类型克隆的细胞毒性活性。柱代表每组六个不同克隆获得的平均值（±SEM）。c对a，P<0.01；c对b，P=ns；c对d，P<0.05；d对a，P<0.05；d对b，P=ns。

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Th17和Th17/Th1克隆对自身T调节细胞克隆抑制活性的敏感性低。（A） 流式细胞术检测到T调节细胞克隆（左）表达Foxp3和CD25，以及其对PMA和离子霉素（右）的反应不能产生IL-4和IFN-γ。（B） 通过T调节细胞克隆抑制异体照射PBMC刺激的自体CD4+CD25−T细胞以及自体Th1或Th2（而非Th17或Th17/Th1）克隆的增殖反应。柱代表三次测定中增殖反应抑制百分比的平均值（±SEM）。

IL-12下调Th17克隆中RORγt和IL-17的表达，但上调t-bet和IFN-γ的表达

我们询问了Th17和Th17/Th1之间的关系，因为这两种类型的细胞都是在体外发现的，因此后者不可能是由体外T细胞培养引起的伪影引起的。为此，我们首先评估了T-bet的表达，T-bet是一种转录因子，在小鼠和人类中对Th1都具有选择性(32)和RORγt，这是一种对小鼠Th17具有选择性的转录因子(21). 作为对照，GATA-3的表达是一种对小鼠和人类Th2都有选择性的转录因子(32)，也进行了评估。正如预期的那样，Th2克隆选择性表达GATA-3和Th1克隆选择性表达T-bet。相反，Th17和Th17/Th1克隆均表达RORγT或T-bet(图7，A–C). 然后通过共焦显微镜评估Th17克隆中RORγt和t-bet蛋白的存在。尽管RORγt在Th17中表达，但在Th1中不表达，克隆(图7 D)，T-bet蛋白在Th1和Th17克隆中都能检测到(图7 E).

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Th17和Th17/Th1克隆的T-bet和RORγT表达。在Th0、Th1、Th2、Th17和Th17/Th1克隆中测量RORγt（A）、t-bet（B）和GATA-3（C）mRNA水平。柱代表每种类型10个克隆的平均值（±SEM），Th2除外，其中它们代表7个克隆。（A） d对A，P<0.0001；d对b，P<0.005；d对c，P<0.05；d对e，P=ns；e对a，P<0.001；e对b，P<0.01；e对c，P<0.05。（B） d与a之比，P=ns；d对b，P=ns；d与c比较，P＜0.05；d对e，P=ns；e对a，P=ns；e对b，P=ns；e对c，P=ns；b对c，P<0.05。（C） d对a，P=ns；d对b，P=ns；d对c，P<0.05；e对a，P<0.001；e对b，P=ns；e对c，P<0.001；b对c，P<0.001。通过共焦显微镜评估RORγt（D）和t-bet（E）蛋白表达。报告了一个Th17和一个Th1克隆的数据。在另外两个Th17和两个Th1克隆中获得了类似的图片。棒材，10μm。用TO-PRO-3（红色）对细胞核进行复染。

因此，我们询问在特定环境条件下，Th17/Th1是否可以从单个Th1或Th17亚群中衍生。为了回答这个问题，在没有或存在IL-12的情况下，用抗CD3加抗CD28抗体和IL-2刺激Th1和Th17克隆，并在培养7天后评估这些克隆的RORγt和t-bet的表达以及细胞因子的产生情况。IL-12下调RORγt和上调t-bet mRNA水平(图8 A)，并诱导IFN-γ显著增加和IL-17降低，如测量细胞因子mRNA水平所示(图8 B)ELISA法测定无细胞上清液中细胞因子浓度(图8 C)或用PMA和离子霉素刺激后流式细胞仪测定产生IFN-γ和IL-17细胞的比例(图8、D和E). 最后，我们询问IL-12对Th17细胞因子产生的诱导作用是否会受到IL-23的影响。为此，在存在IL-12、-23或-12加-23的情况下，用抗CD3/28抗体和IL-2刺激三个Th17和三个Th1克隆7天。添加IL-12后，Th17克隆的无细胞上清液中IFN-γ的浓度显著增加，Th1克隆的上清液更是如此(图8 C和9 A)而单独添加IL-23对Th17或Th1克隆产生IFN-γ没有任何影响(图9 A). 然而，IL-23的添加部分减少了IL-12诱导的IFN-γ生成增加(图9 A)获得对IL-12产生IFN-γ的能力的Th17克隆细胞的比例及其增殖程度(图9 B).

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IL-12对RORγt和t-bet表达以及Th17克隆产生IFN-γ和IL-17的影响。（A） 在没有（黑色）或有（灰色）IL-12的情况下，用抗CD3加抗CD28抗体和IL-2刺激7天后，五个Th17克隆的RORγt降低，t-bet mRNA表达增加。a与b比较，P＜0.05；c对d，P<0.05。（B） 在A所述条件下培养的Th17克隆中IL-17降低和IFN-γmRNA增加。柱代表平均值（±SEM）。a对b，P<0.01；c对d，P<0.01。（C） ELISA测定Th17克隆上清液中IL-17水平降低，IFN-γ水平升高。a对b，P<0.05；c对d，P<0.001。（D） Th17克隆对PMA和离子霉素的反应导致产生IL-17的细胞比例降低，产生IFN-γ的细胞比例增加。a对b，P<0.05；c对d，P<0.05。（E） 通过一个具有代表性的Th17克隆对IL-17和IFN-γ产生进行流式细胞术分析。

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IL-23可部分抑制Th17克隆上IFN-γ的产生和IL-12诱导的增殖。（A） 用抗CD3/CD28和IL-2（黑色）、IL-12（灰色）、-23（白色）或-12+-23（条纹）培养7 d的Th17和Th1克隆的无细胞上清液检测IFN-γ。柱表示在三种不同的Th17和三种不同的Th1克隆中获得的平均值（±SEM）。a对b，P<0.05；b对c，P<0.05；d对e，P<0.05；e对f，P<0.05。（B） 流式细胞术分析一个代表性Th17克隆产生的IL-17和IFN-γ，并通过CFDA-SE含量评估其增殖。其他两个Th17克隆也获得了类似的结果。

CD患者Th17克隆的受体表达和功能特性与正常肠道Th17克隆和新鲜Th17细胞相同

由于大多数实验都是在CD患者肠道疾病影响区域的T细胞克隆上进行的，因此我们询问观察到的Th17细胞的表型和功能特征是否是该疾病特有的，或者是否与正常肠道T细胞克隆共享。如所示图10 A在相同实验条件下从正常肠道中获得的Th17和Th17/Th1克隆显示出几乎选择性的CCR6、IL-23R和RORγt表达。尽管表现出IL-23R，但即使这些克隆在没有或存在抗CD3/CD28 Ab的情况下，也不会对IL-23产生反应而增殖（未公布的数据）。此外，他们在IgM、IgG和IgA方面表现出出色的B细胞辅助能力，而在IgE方面则没有表现出这种能力，并且细胞溶解能力降低，因为Th17克隆来自CD患者的病变部位（未发表的数据）。

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来自正常肠道的Th17克隆以及新衍生的产生IL-17的CD4+T细胞表现出与肠道CD-衍生的Th17细胞相似的特征。（A） Th1、Th17和Th17/Th1克隆的CCR6、IL-23R和RORγt mRNA表达来自结肠癌患者结肠切除术后正常肠道。柱表示从每种类型的五个克隆获得的平均值（±SEM）。（B） 通过PB或扁桃体的CCR6缺失和CCR6富集CD4+T细胞群检测IL-17和IFN-γ的产生（顶部）。测量PB（左）或扁桃体（右）CCR6缺失（黑柱）和CCR6富集（红柱）CD4+t细胞中IL-23R和RORγt mRNA水平。柱代表三个不同PB或扁桃体供体的平均值±SEM。

最后，我们询问Th17克隆的表型和功能特征是由克隆程序引入的伪影造成的，还是由新衍生的Th17细胞共享的。除了能够单独产生IL-17的T细胞外，体外还存在能够产生IL-17和IFN-γ的T细胞图1然而，在随后的实验中，我们利用对Th17克隆明显选择性表达CCR6的观察，评估了人PB和扁桃体CD4+T细胞悬浮液中Th17细胞的存在。通过流式细胞术在人PB和扁桃体中观察到少量但始终可检测到的CCR6+CD4+T细胞。然后通过免疫磁性细胞分选分离CCR6+和CCR6−CD4+T细胞，并评估其产生IL-17和IFN-γ的能力，以响应PMA和离子霉素的刺激。细胞分选使CCR6+T细胞富集（始终>90%），而在CCR6缺失的CD4+T细胞群中几乎没有检测到CCR6+细胞（未公布的数据）。值得注意的是，所有产生IL-17或IL-17加IFN-γ以响应PMA加离子霉素的T细胞都包含在CCR6富集人群中，而CCR6缺失的T细胞可以被诱导产生IFN-γ，但不能诱导产生IL-17T细胞(图10 B，顶部）。此外，检测CCR6富集和缺失t细胞中IL-23R和RORγt mRNA的水平。在CCR6富集的PB或扁桃体中，IL-23R和RORγt mRNA的水平均显著高于CCR6缺乏的人群(图10 B，底部）。同样，尽管存在IL-23R，即使是新衍生的产生IL-17的CD4+T细胞，在缺乏或存在抗CD3/CD28单克隆抗体的情况下，也不会因IL-23而增殖（未发表数据）。

讨论

几项研究表明，在实验动物模型中存在一种新的Th效应器亚群，该亚群不同于经典的Th1和Th2，并因其产生IL-17的能力而命名为Th17。这些细胞代表了一个独特的谱系，主要来源于TGF-β和IL-6的存在，需要IL-23的存在来扩张和/或维持。IL-23是IL-12细胞因子家族的成员，与IL-12共享p40亚单位，p19而非p35的表达不同。至少在小鼠中，Th17细胞作为粘膜宿主防御的一部分出现，其主要作用似乎是防止细胞外细菌感染(33–35)，但在某些情况下，它们也可能参与慢性炎症疾病的发病机制，包括一些自身免疫性疾病模型(9–14). 值得注意的是，在这些模型中，Th1细胞产生的IFN-γ（对保护细胞内细菌至关重要）似乎不是致病性的，而是具有保护性的，因为抑制IFN-γ信号传导会增强致病性Th17的发育并加剧自身免疫(20). 即使是Th2产生的IL-4的中和作用在中和IL-17的发展中也至关重要；然而，IFN-γ和IL-4似乎对已经建立的Th17无效(20).

目前，对人类Th17知之甚少。一些研究表明，不同自身免疫性疾病患者的组织或生物液中存在IL-17 mRNA或IL-17蛋白(23–27)或其他慢性炎症疾病(28–30). 本研究结果证明，与PB或明显健康的肠道区域相比，CD患者受疾病影响的肠道区域中产生IL-17的CD4+T细胞数量增加。基于这一发现，对来自CD受试者肠道的产生IL-17的CD4+T细胞进行体外扩增和克隆，以获得适合表型和功能研究的数量。

我们研究得到的第一个信息是，大量产生IL-17的CD4+T细胞具有产生IFN-γ的能力，而同时产生IL-17+-4的CD4+T细胞从未被观察到。产生IL-17和IFN-γ的细胞（我们将其命名为Th17/Th1）不是体外伪影的结果，因为约三分之一的体外衍生IL-17产生CD4+T细胞已经显示出双重IL-17+IFN-γ+表型。在克隆水平上进行检测时，Th17和Th17/Th1与其他类型的克隆具有不同的表型特性，其中一些克隆似乎具有选择性。例如，只有Th17和Th17/Th1克隆表达IL-23R。有趣的是，IL-23R在这些细胞亚群的扩张中显然没有发挥任何作用，因为它们没有对IL-23单独作出反应而增殖，IL-23也没有增强其抗CD3/CD28抗体诱导的增殖。因此，IL-23可能对人类Th17的扩增并不重要，而对其生存和/或维持很重要。相反，在相同条件下，抗CD3/28刺激的Th17和Th17/Th1克隆在IL-2、-12或-15的作用下增殖。IL-2促进人Th17增殖的能力，这一发现也得到了以下观察结果的支持：IL-2是本研究中用于从PB或肠道粘膜扩增Th17并获得Th17克隆的生长因子，与最近的结果明显不同，即IL-2抑制小鼠Th17细胞的生成(36). 这种差异的原因目前尚不清楚。在趋化因子R中，Th17和Th17/Th1克隆明显缺乏CXCR3-A、CXCR3-B、CCR3、CCR8和CCR9，但表现出高水平的CXCR4和CXCR6。Th17克隆表达的CCR4和CCR5水平也显著高于其他类型克隆，并且Th17和Th17/Th1都选择性表达CCR6。CCR4的表达与细胞进入外周组织的能力有关(37). CCR6被发现由B细胞、DC和记忆细胞表达，但不是单纯的T细胞。然而，其配体MIP-3α/CL20对B细胞不具有趋化活性，而仅对记忆T细胞具有趋化活性(38). 然而，有趣的是，记忆性T细胞的CCR6表达在长时间TCR触发后丢失(39). 因此，通过Th17和Th17/Th1选择性表达CCR6，而不是通过Th1、Th2或Th0克隆选择性表达CCR6，这可能意味着Th17和Th17/Th1是唯一的记忆T细胞，即使在延长的抗原激活后仍继续表达CCR6，从而维持了响应MIP-3α/CL20的募集的可能性。这一发现可能对Th17内流的长期维持具有重要意义，支持其在炎症组织中的重要致病作用。

人类Th17和Th17/Th1克隆也具有一些独特的功能特性。我们发现，作为Th1克隆，这两种类型的克隆都能够为B细胞提供IgM、IgG和IgA的生成帮助，而不是IgE、Ab。相比之下，作为Th2克隆，它们的颗粒酶A表达较差，细胞毒能力较低，从而显示了Th1和Th2克隆之间的B细胞辅助和细胞毒活性的中间功能模式。然而，与Th1和Th2克隆相比，Th17和Th17/Th1克隆最令人印象深刻的功能特征是它们对来自循环CD4+CD25highFoxp3+细胞的自体T调节细胞克隆的抑制活性的敏感性较低。虽然Th17和Th17/Th1对T调节细胞的作用具有较高抵抗力的机制尚不清楚，但这一发现可以为IL-17产生细胞在维持自身免疫性疾病炎症过程中的重要作用提供额外支持。

从CD患者肠道受影响区域获得的T细胞克隆中观察到的受体表达和功能能力与他们的病理来源无关，也与克隆过程中的一些体外伪影无关。事实上，在因结肠癌而接受结肠切除术的受试者健康肠道区域的T细胞克隆中发现了类似的受体表达和功能。更重要的是，在来自肠道、PB和扁桃体的新鲜CD4+t细胞中也观察到Th17和Th17/Th1细胞的存在，以及它们对CCR6、IL-23R和RORγt的表达。在这方面，值得注意的是，对CCR6+细胞进行分类可以获得富含IL-17产生细胞的人群，这表明该标记物可能有助于获得大量Th17细胞，因此可能对阐明其在人类中的病理生理作用有很大帮助。值得注意的是，在本文的修订过程中，发表了一项研究(40)也报告了人类PB Th17细胞对CCR6和RORγt的优先表达。

这项研究的另一个重要发现是，在Th17和Th1之间的关系方面，与小鼠报告的一些结果存在明显差异。在首次提出的小鼠模型中，有人认为Th1和Th17与原始CD4+T细胞前体的早期分化是共享的，因此Th1和Th17的分化取决于作用于共同表达IL-12R和-23R的共同“Th1前体”或“前Th1”中间产物的IL-12或-23的选择性可用性(41). 然而，在随后提出的小鼠模型中，该模型基于向Th17的分化取决于TGF-β和IL-6而不是IL-23的证明，表明Th1和Th17亚群不重叠，并代表不同的谱系(19,20). 在这项研究中，我们没有为人类Th17分化的机制提供任何证据，也没有为人类和小鼠Th17和Th1是否代表不同血统的问题提供任何证据。然而，我们不仅证明了CD4+T细胞在体外的存在能够产生IL-17和IFN-γ，而且我们还能够诱导Th17克隆在IL-12存在下培养后除了产生IL-17。Th17克隆不仅表达RORγt，这一发现与小鼠的研究结果一致，也证实了人类Th17和Th1之间可能存在的关系(21)但也有大量的Th1转录因子T-bet，并且T-bet和RORγT的数量在人类Th17和Th17/Th1克隆中具有可比性。

有趣的是，除了与T-bet上调和Th17克隆中RORγT表达和IL-17生成下调相关的IL-17外，IL-12诱导Th17细胞产生IFN-γ的能力。这意味着，在人类中，即使是已建立的Th17克隆，无论它们与Th1是否有独特或共同的起源，都对IL-12有反应，并且仍然具有足够的灵活性以获得产生IFN-γ的能力。这些发现强烈表明，在人类Th17中，RORγt和t-bet都可以发挥重要的调节作用。本研究未直接探讨T细胞克隆产生IFN-γ的可能性，因此尚未得到证实。然而，最近有研究表明，小鼠Th17细胞中异位T-bet表达可以促进IFN-γ分泌并降低IL-17的产生，这表明即使在小鼠中，Th17表型也不稳定，并且可以通过T-bet介导的信号传导在体外产生IFN-γ(42). 在这方面，应该考虑到小鼠的其他最新数据再次提出了Th1和Th17之间发育关系的问题。首先，在小鼠身上进行的研究也报告了IL-17-和IFN-γ产生细胞的双重群体的存在(42,43). 第二，在IL-23存在的情况下，T-bet被发现是最佳IL-17生成所必需的(44). 最后，通过限制自身反应性Th1的分化和通过调节IL-23R抑制致病性Th17，治疗性给予T-bet特异性小干扰RNA显著改善了既定EAE的临床病程(45). 这些发现表明，即使在小鼠模型中，T-bet和RORγT也可能在Th17细胞的发育中发挥不同但互补的作用。在本研究中，IL-23的同时存在部分抑制了Th17克隆产生IL-12诱导的IFN-γ。由于IL-23对IL-12诱导的IFN-γ产生的类似抑制作用也可以在不表达IL-23R的Th1克隆中观察到，因此可以合理地认为，IL-23通过IL-12和-23之间共享的p40链结合IL-23R和IL-12Rβ1的能力介导了这种抑制作用，因此显示出约束竞争。因为IFN-γ是众所周知的IL-12Rβ2诱导剂(46)，它可以强烈影响Th17对IL-12活性的敏感性，从而有利于这些细胞向Th1表型转移。这一发现也可以解释IFN-γ对小鼠Th17发育的抑制活性及其保护作用(47).

总之，我们的数据首次提供了从CD受试者受疾病影响的肠粘膜以及正常组织中分离的人Th17的详细表型和功能特征，表明Th17显示出与Th1或Th2细胞不同的功能特性，并鉴定了IL-23R、CCR6、，和RORγt作为Th17特异性标记物。此外，我们描述了一种新的产生IFN-γ的Th17亚群，它与Th1和Th17具有共同的特征，这在小鼠中以前没有报道过。这种新的亚群存在于人体体内，并且可以通过在IL-12存在下刺激Th17在体外诱导，从而提出了关于Th17与Th1的发育和/或功能关系的新问题。

材料和方法

学科。

小肠标本取自10名因结肠癌接受手术的受试者的表面健康区域、10名CD患者的病变影响区域以及5名溃疡性结肠炎患者的病变作用区域。PB样本取自10名CD患者和13名健康献血者。扁桃体标本取自三名儿童，他们因患有慢性扁桃体炎而接受扁桃体切除术。研究中遵循的程序符合人类实验区域委员会的道德标准。

试剂。

所用培养基为RPMI 1640（血清），添加2 mM L-谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、1%丙酮酸、2×10−5M 2-巯基乙醇（2-ME；全部来自Invitrogen）和10%FCS。从BD Biosciences购买FITC-、PE-、别藻蓝蛋白或卟啉叶绿素蛋白结合抗CD3、CD4、CD8、CD25、CD45RA、CD45RO、TCRαβ、TCRγδ、IFN-γ、IL-4和等型匹配对照单克隆抗体。抗IL-17和Foxp3单克隆抗体来自eBioscience。PMA、离子霉素和brefeldin A购自Sigma-Aldrich。抗-CCR6单克隆抗体来自研发系统。抗-RORγt兔多克隆抗体购自Abcam。抗T-bet兔子多克隆抗体来自圣克鲁斯生物技术公司。

T细胞回收。

为了分离T淋巴细胞，通过补充有1mM EDTA和1mM DTT（Sigma-Aldrich）的不含钙和镁的PBS去除肠上皮层。碎片被MEDI机器（BD Biosciences）机械破坏。然后通过Ficoll-Hypaque梯度离心法从其他细胞中分离MC。PBMC和扁桃体单核细胞悬浮液也通过Ficoll-Hypaque梯度离心获得。

流式细胞术。

如前所述，在单细胞水平进行细胞因子合成分析(48). Foxp3流式细胞术测定是根据制造商的说明（eBioscience）进行的。

共焦显微镜。

使用前面描述的技术，通过共焦显微镜检测Th17和Th1克隆中的RORγt和t-bet蛋白(49).

免疫磁性细胞分选。

如前所述，通过免疫磁性细胞分选从CCR6−PB或扁桃体CD4+T细胞中分离CCR6+(49).

T细胞扩增和克隆。

用5μg/ml抗CD3抗体加上5μg/ml抗CD28单克隆抗体（BD Biosciences）和20 UI/ml IL-2（Eurocetus）刺激肠源性和PB T淋巴细胞10 d，使其扩增。如前所述，在第10天，在有限稀释（0.3个细胞/孔）下克隆T细胞母细胞(50). 从一名CD患者PBMC中获得的CD4+CD25+Foxp3+T淋巴细胞生成T reg克隆。为此，用IL-4和GM-CSF培养5d的CD14+细胞生成DC。通过细胞分选从PBMC中获得CD4+CD25-或CD25high T细胞。CD4+CD25high细胞与自体DC（1:1比例）和100 U/ml IL-2培养10 d，并在极限稀释（0.3个细胞/孔）下克隆。

RNA分离、cDNA合成和实时定量RT-PCR。

使用RNeasy Micro试剂盒（QIAGEN）提取总RNA，并用DNase I处理以消除可能的基因组DNA污染。如其他地方所述，进行了Taq-Man RT-PCR(51). 所用的引物和探针是从Applied Biosystems公司购买的。

增殖测定。

5 × 104在不存在或存在不同细胞因子（rIL-2，50IU/ml；rIL-12,2.5ng/ml；rIL-15，7ng/ml；rIL-23,20ng/ml）的情况下，用2μg/ml抗CD3加2μg/ml抗CD28mAb（BD Biosciences）刺激来自每个克隆的总T细胞母细胞。在T细胞抑制实验中，2×104将Th1、Th2、Th17或Th1/Th17克隆的T细胞母细胞与4×104辐照（9000 rad）T细胞缺失的异基因PBMC，有或没有2×104CD4+CD25的T细胞母细胞高的Foxp3+T克隆。用0.5μCi（0.0185 MBq）的三采集的H-TdR（GE Healthcare）和放射性核素摄取量通过闪烁计数进行测量。在一些实验中，如前所述，用CFDA-SE（Invitrogen）标记细胞(52).

钙内流。

5 × 105来自Th1和Th17克隆的细胞在2.5μM Fluo-4 AM（Invitrogen）存在的完整培养基中在室温黑暗中培养30分钟。加载染料后，在完全培养基中清洗细胞两次，并在37°C和5%CO的存在下培养2在额外的30分钟内，使用Diva软件（Becton Dickinson）通过BD-LSRII流式细胞仪分析细胞。刺激前评估基础荧光强度。在单独存在培养基或存在1μg/ml CCL20、1μg/ml CCL25或1μM离子霉素的情况下获得刺激。

B细胞助手活动。

2 × 105人B细胞，通过免疫磁性细胞分选分离为CD19+细胞(49)，被10刺激5用100 ng/ml抗CD3抗体刺激Th1、Th2、Th17或Th1/Th17细胞。第7天，收集每个细胞培养上清液，并通过ELISA评估IgM、IgG、IgA和IgE含量。

颗粒酶A的流式细胞术检测和细胞毒性评估。

根据制造商的说明（BD生物科学）评估Th1、Th2、Th17或Th17/Th1克隆的Granzyme A表达。如其他地方所述，通过流式细胞术评估AnnexinV结合细胞的百分比，测试Th1、Th2、Th17和Th1/Th17细胞克隆在抗CD3 mAb激活（5μg/ml）后杀伤P815靶细胞的能力(52).

统计。

各组之间的统计比较根据情况采用Mann-Whitney检验或Wilcoxon检验。当P<0.05时，差异被认为具有统计学意义。

致谢

本文中所报告的实验是由意大利南坎卡罗理工大学协会、意大利理工大学、意大利卫生部和FP6欧盟项目INNOCHEM（LSHB-CT 2500-518157）资助进行的。

作者没有相互冲突的经济利益。

笔记

使用的缩写：Ab，抗体；CD、克罗恩病；胶原诱导性关节炎；实验性自身免疫性脑脊髓炎；PB，外周血；类风湿关节炎。

F.Annunziato和L.Cosmi对本文的贡献相同。

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文章来自实验医学杂志由以下人员提供洛克菲勒大学出版社