位于IFN-γ启动子的核小体的T辅助因子1型特异性Brg1募集和重塑依赖于Stat4

IFN-γ启动子核小体定位阵列

干扰素-γ基因座转录能力的改变必须部分通过其启动子介导，该启动子的有限部分（～600 bp）包含高度保守的序列，足以指导转基因小鼠中Th1特异性基因的表达(42). 我们研究了启动子中是否存在转录不活跃状态的核小体，如果存在，它们是随机定位还是排列在指定位置。来自原始CD4的细胞核⁺用微球菌核酸酶（MNase）对T细胞进行有限消化，并使用启动子两侧的限制性内切酶位点进行间接末端标记法分析(27). 对于三种限制性内切酶（RE）中的每一种，使用与其中两种酶（HincII和EcoRI）的裂解位点邻接的探针，可以明显看出离散带的核小体阶梯，间距为160–200个核苷酸(图2，a–c). 尽管这种低分辨率方法不能精确定位核小体与核苷酸的位置，但结果表明至少有三个核小体位于1到−600 bp之间。

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图2。

CD4 T细胞中位于IFN-γ启动子染色质中的核小体。（a和b）用甲醛交联幼稚CD4 T细胞，并用MNase处理其染色质(5,7.5和10个酶单位）。然后纯化DNA，用指示的RE消化（或保留未消化；0），并使用面板c中指示的探针（直接靠近HincII-cut DNA的RE位点[a]或EcoRI消化物[b]）通过Southern blots进行分析。（c） IFN-γ启动子的RE位点和推断核小体位置示意图。用于Southern印迹的探针片段和用于LM-PCR的引物显示在基因上方；转录起始位点（+1）用箭头表示。（d） IFN-γ启动子核小体边界的LM-PCR定位。从原始或Th1（6-d培养）CD4 T细胞的MNase（2.5和1酶单位）裂解染色质中纯化的DNA通过LM-PCR，使用引物x（核小体1）或y（核小体2）和连接物引物进行分析，并通过Southern blot用内部寡核苷酸（1和2用于核小体2）进行分析。作为对DNA中MNase切割偏好的控制，使用相同的MNase制备、连接物连接和PCR（裸DNA）分析纯细胞DNA。所示为代表五个独立实验的放射自显影。

对MNase处理的基因组DNA进行连接介导PCR（LM-PCR），以更精确地定位位于近端IFN-γ启动子的核小体边界。其中一个定位于相对于转录起始位点（核小体1；图2、c和d；示意图中的Nuc 1）。第二个核小体，核小体2，被定位到核苷酸70和220之间的边界；通过间接末端标记，在启动子区的核苷酸−370和−520之间发现了核小体−2。这些数据表明，IFN-γ启动子被包装在原始CD4 T细胞的核小体定位阵列中。对原始静止CD4 T细胞与Th1极化群体进行的比较分析表明，覆盖启动子保守近端调控元件的核小体1的位置没有差异，Th1与Th2群体的比较也没有差异（未公布的数据）。

Th1分化过程中IFN-γ启动子处核小体DNA可及性增加

为了进一步评估IFN-γ启动子的染色质在细胞激活和分化时是否发生改变，使用了RE可及性（REA）分析。细胞核由活化后转录IFN-γ能力较低的原始CD4 T细胞制备而成(图1; 参考文献三,4). 幼稚细胞也在Th1条件下被激活和生长，之后Th1群体被休息或重新刺激。通过测定RE-裂解的相对效率来测量每组细胞细胞核中IFN-γ启动子DNA的可及性(图3). 与原始细胞相比，在休息的Th1细胞中，IFN-γ启动子最近端部分的核糖体DNA变得更容易获得。在静息Th1细胞的二次刺激后，这些位点的一个子集的染色质进一步改变(图3b). 总之，这些变化揭示了干扰素-γ启动子包装中的精确物理变化发生在T细胞激活后，这与核小体重塑而非移除更为相容。未被激活的Th1细胞在大多数部位表现出与再刺激后观察到的重塑程度相似的重塑程度(图3b)和高活性基因转录的诱导(4,22).

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图3。

IFN-γ启动子处的染色质重塑。（a） 带有核小体位置的IFN-γ启动子图图2在保守IFN-γ启动子区域分析的位点用黑色条表示；核小体的位置由开放的卵圆形表示；转录起始点由箭头指示。线下方，核小体1的扩展视图显示了组成近端保守元件的结合位点的位置(46,47). 下面进一步指出了相关位点的核苷酸序列，用线表示结合基序；识别这些地点的文件(7,45,44)注意到。（b） 直接分析或激活（αCD3+αCD28）的幼稚CD4 T细胞，在Th1条件下分化6天，然后如前所述休息或重新刺激(18). 用MseI消化每个细胞群的细胞核(10,25和50个酶单位）(10,25和50个酶单位），或没有酶（在右车道为0）。然后用HincII将纯化的基因组DNA切割至完全，并使用Southern印迹进行分析。黑点表示上游MseI位点（核苷酸−510）产生的条带位置。箭头指向指示被测限制性内切酶可及性的条带。P、 父母乐队。

IFN-γ启动子处快速进行的Th1亚特异性染色质重塑

接下来，我们确定IFN-γ启动子处的染色质重塑是一个Th1特异性过程，还是仅仅依赖于激活。我们分析了启动子上的一系列RE位点，以比较原始CD4 T细胞与休息或重新激活的Th1和Th2细胞群的染色质。IFN-γ启动子染色质仅在Th1细胞中产生更大的REA，而活化的Th2细胞的切割效率与未活化的CD4细胞没有差异(图4 a). 这一发现既适用于核小体1 MseI位点，也适用于位于高度保守的转录元件内的相邻唯一SnaB1位点，该转录元件结合了复合ATF/AP-1/C/EBP样位点和T盒半位点(图3 a; 参考文献7,43–45). 除了核小体1和2的变化外，在用于锚定这些分析的片段中的第二个MseI位点上还发现了另一个裂解事件。与IFN-γ启动子中包装−500位点的核小体中的一个位点的切割一致，XmnI在其独特位点切割染色质的可及性也以Th1-特异的方式显著增加，并在二次刺激后进一步增加。为了评估这些变化是否代表核小体的重塑，尤其是与同样影响该区域所有染色质的一般变化相比，在幼稚、Th1和Th2人群中检测了PvuII（核小体1和2之间的切割）的切割。定位核小体内的DNA重塑比间隔区中PvuII位点的DNA重塑更为显著，这表明Th1-特异性重塑过程以IFN-γ启动子的核小体DNA为靶点。然而，有趣的是，核小体−2上的两个位点（XmnI和次级MseI位点）在T细胞的二次刺激下优先发生进一步的变化，而较近的核小体1和2上的位点（第一个MseI、SnaBI和HaeIII）相对不受细胞再刺激的影响。

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图4。

IFN-γ启动子处的早期Th1亚特异性染色质重塑。（a） IFN-γ启动子染色质重塑是Th1特异性的。所示CD4 T细胞群的制备如下图3这些细胞和原始CD4 T细胞的细胞核在没有酶（左侧为0）或增加量的情况下培养(10,25然后用HincII（用于MseI、SnaBI、PvuII和HaeIII分析）或EcoRI（用于XmnI可及性）消化纯化的基因组DNA，并使用图3 a结果代表了六个独立实验。箭头将启动子中的图位（左侧启动子区域的垂直图）与代表染色质被指示酶裂解的片段相连。弯曲箭头表示转录起始点的位置。黑点表示上游MseI位点（核苷酸−510）产生的条带位置。（b） 直接分析幼稚CD4 T细胞，或在Th1或Th2条件下活化并分化18或48小时。然后使用指示的RE对样本进行分析，如图a所示。图中所示为一组代表四个独立实验的放射自显影。P、 父母乐队。

我们研究了可及性增加的早期动力学，以确定IFN-γ启动子染色质的Th1-特异性重塑是一个晚期事件还是在分化早期开始。CD4 T细胞在Th1和Th2条件下极化18和48小时，并通过REA分析。IFN-γ启动子核小体在激活后18小时无变化，但在Th1条件下生长期间TCR刺激后48小时明显变化(图4b; 参考46). 总之，这些发现表明，Th1特异性重塑是针对干扰素-γ基因转录相对较低的细胞中的核糖体染色质(22,46). 这种重塑与TCR再刺激后支持高水平转录的位点能力的逐渐增加同时发生(图1).

Brg1对IFN-γ启动子的招募及Swi–SNF在Th1细胞发育中的作用

核小体包裹DNA可及性的改变可以通过Swi–SNF、Mi-2/NuRD或ISWI重塑机器介导，但含有Brg1的Swi–SNF复合体在不移位或滑动核小体的情况下最能增强核酸内切酶敏感性(20,28). 然而，在Th1或Th2细胞因子基因的激活或抑制过程中，对其重构成分的要求、构成或定位一无所知。为了研究核心Swi–SNF组分Brg1在Th1分化（位点激活）或Th2条件下（IFN-γ基因阻遏）是否与IFN-γ启动子相关，我们进行了染色质免疫沉淀（IPs[ChIPs]）。将来自原始细胞的染色质与在Th1和Th2条件下培养的最近激活的CD4 T细胞的样本进行比较。Brg1在Th1细胞发育中与IFN-γ启动子相关，但在Th2细胞中不相关(图5 a)然而在naive、Th1和Th2细胞中表达水平相似(图5 b). 在Th1或Th2条件下活化和培养48小时的幼稚CD4 T细胞的比较中，结合发生在这个早期(图5 c). 招募不是由IFN-γ产生引起的；尽管在存在IL-12的培养物中中和了抗IFN-γ，但仍保持了招募，并且在Th2培养物中添加IFN-γ并没有引起招募(图5 d). 当T细胞群在培养6天时进行测试时，Brg1仍在Th1细胞的IFN-γ启动子处富集(图5 e)表明Brg1的募集稳定地维持在Th1细胞的可接近染色质上。用IFN-γ基因第4外显子特异性引物扩增相同样品，未检测到Brg1的富集(图5 e)表明结合是一个局部过程，而不是与染色质或转录序列的全局关联。

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图5。

IFN-γ启动子的Th1-特异性Brg1招募。（a） 在Th1条件下，T细胞激活导致Brg1与IFN-γ启动子结合。直接分析幼稚CD4 T细胞，或在Th1或Th2条件下分化3 d，然后使用正常兔IgG或抗Brg1抗体进行ChIPs分析。用PCR在沉淀或非分馏样品（输入）中检测IFN-γ启动子DNA，线性范围扩增，并用内部寡核苷酸探针进行Southern杂交。显示了六个独立实验中的一个具有相同结果的放射自显影。（b） CD4 T细胞亚群中Brg1水平。CD4 T细胞的Naive、Th1和Th2群体（星号表示重新刺激）通过Western blotting使用抗Brg1抗体和负荷对照进行分析。（c） 与面板a一样，除了在T细胞激活48小时后分析重复样品。（d） Brg1与IFN-γ启动子关联的IFN-γ独立性。纯化的原始CD4 T细胞在Th1条件下激活并培养，或在Th2条件下培养（±IFN-γ）。然后使用这些细胞进行抗-Brg1 ChIP分析。（e） 稳定的Th1-特异性Brg1与IFN-γ启动子的关联。在极化条件下继续从面板c生长细胞，直到第6天，此时进行Brg1-ChIP。每个样本平均分配，以执行独立的重复IP（a和b）。沉淀用于PCR检测IFN-γ启动子或外显子4的DNA序列，如图所示。所示为一个实验的放射自显影，代表了三个独立实验的结果。

接下来，我们研究了Swi–SNF成分在Th1分化中的功能意义。CD4 T细胞被激活以允许逆转录病毒介导的转导，并在阻止Th1分化的条件下最初生长。然后在感染后将细胞切换到Th1状态，生长2 d，并对用靶向Swi–SNF复合物或对照物的分子转导的细胞中的IFN-γ基因表达进行评分(图6 a). 在使用RNA干扰（RNAi）降低Swi–SNF复合物核心ATP酶组分表达的实验中，在GFP中观察到Th1分化效率的显著且可重复的降低⁺转导表达短发夹RNA的CD4 T细胞与GFP的比较⁻人口（未描述）和GFP⁺包含空矢量的单元格(图6 b). 关于在这种情况下构成控制基因的信息很少，但CD4表达在GFP中均正常⁺这些RNAi实验的样本(图6 b)以及之前对因谱系特异性Brg1基因敲除导致胸腺异常分化而导致的成熟T细胞的分析(47). 在Swi–SNF RNAi细胞的流式细胞术分析中，Stat4和T-bet水平也显示正常（图S1，可在http://jem.org.cgi/content/full/jem.20060066/DC1). 尽管事实证明获得足够纯化的原代细胞来分析敲除并不可行，但与对照组相比，用短发夹RNA转导的EL-4 T细胞的免疫印迹显示Brg1大量耗竭(图6 c). 由于Brg1的表达没有完全消除，这些实验中残留的Th1可能部分是由Swi–SNF复合物的不完全消融引起的。Swi–SNF复合物非催化BAF57组分的主要负形式，BAF57ΔN(32)缺少其DNA结合部分。当BAF57ΔN用于转导实验时，我们观察到与对照组相比，表达高水平双顺反子Thy1a标签的细胞中CD4表达正常，但Th1分化显著减少(图6 d). 因此，Th1分化的启动触发了局部Brg1募集和染色质重塑；这些与时间相关的过程都先于二次TCR刺激。此外，尽管含有Brg1的复合物通常与抑制基因表达有关(36–39)，含Brg1的Swi–SNF复合物似乎对正常Th1分化至关重要。在发育中的Th2细胞中，缺乏对IFN-γ启动子的Brg1招募，这表明当细胞从原始状态进入Th2状态时，该蛋白不会影响IFN-γ位点的沉默。

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图6。

Swi–SNF成分在Th1发育中的作用。（a） 使用ThU（αIL-4、αIL-12 p40和αIFN-γ）或Th2条件的实验设计示意图，以推迟Th1分化的开始，直到逆转录病毒转导和随后切换到Th1条件。（b） 用空载体或编码靶向小鼠Brg1（RNAi）的短发夹序列的逆转录病毒转导T细胞，切换到第a组的Th1条件，并在二次刺激（αCD3+αCD28）后进行IFN-γ染色后进行流式细胞术分析。GFP中CD4信号的直方图⁺图中显示了人群以及GFP中细胞的IFN-γ信号⁺，CD4⁺盖茨。控制装置（图S1，可从http://jem.org.cgi/content/full/jem.20060066/DC1; 显示RNAi样本中正常的细胞存活率和CD44、Stat4、P-Stat4和T-bet水平。重新刺激GFP上清液的ELISA⁺细胞证实干扰素-γ的产生显著减少。（c） 用Western blotting法测量用短发夹编码或控制病毒转导的T细胞在指定时期内的Brg1水平。（d） 如图b所示，除了用空的MiT载体（逆转录病毒）或编码显性阴性BAF57ΔN的病毒粒子转导细胞外，在Thy1a中测量IFN-γ信号⁺，CD4⁺大门。对于RNAi和BAF57（ΔN），显示的结果代表了至少四个独立实验中再现的结果。MFI，平均荧光强度；细胞内细胞因子染色；FSC，正向散射。

信号传导Brg1募集与染色质重塑

钙调神经磷酸酶的激活是NFAT转录因子诱导的信号，而NFATc2（NFAT1）在调节Th1分化中的关键作用已通过选择性缺乏该蛋白的小鼠鉴定(48). 此外，IFN-γ启动子包含NFAT的功能位点，NFAT在分化Th1细胞时与IFN-γ染色质结合(43,44,46). 我们通过在存在或不存在环孢菌素A（CsA）的情况下激活原始CD4 T细胞来测试钙调神经磷酸酶活性是否是IFN-γ启动子染色质重塑所必需的。为了绕过诱导IL-2时对NFAT的需求，培养物中加入了IL-2。CsA消除了Th1条件下细胞REA分析中IFN-γ启动子染色质可及性的增加(图7 a). 此外，在相同条件下（Th1条件±CsA）对活化的CD4 T细胞进行ChIP分析表明，Brg1募集被该抑制剂阻断(图7 b).

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图7。

钙调神经磷酸酶激活在Th1细胞Brg1募集和染色质重塑中的重要作用。（a） 环孢菌素a（CsA）可消除IFN-γ启动子染色质重塑。在有或无CsA的Th1条件下（包括补充的IL-2）纯化、激活（或未激活）幼稚CD4 T细胞，并培养48小时。用指示的酶消化细胞核，并按照图2箭头指向指示被测限制性内切酶可及性的条带。P、 父母乐队。（b） CsA阻断了Brg1向IFN-γ启动子的募集。ChIP对a组产生的样品进行了分析，如图6（c和d）在有或无CsA的情况下激活T细胞，在所有培养物中添加IL-2。（c） 流式细胞术测定CD25和CD44阳性CD4细胞的频率（阳性百分比），以及阳性门内这些参数的平均荧光强度。（d） 通过流式细胞术检测CD4细胞中渗透碘化丙啶染色细胞的CD4淋巴细胞的细胞周期进展⁺闸门（左）或激活前加载CFSE的样本（右）。插入数字表示循环中的细胞分数或至少分裂一次的细胞。（e） Brg1和NFAT协会。使用所示抗体沉淀所示细胞的提取物；这些沉淀物通过抗Brg1免疫印迹分析。通道7和8：不含IP的提取物；显示了代表三个独立实验的一个免疫印迹。车道1和车道3的化学发光膜暴露时间比车道2和车道4-9长，所有车道均来自相同过滤器的相同暴露。（f） CsA对IFN-γ表达的抑制。来自激活和分化细胞的RNA的Northern blot分析，如图a所示。

这种对钙调磷酸酶活性的需求可能是因为T细胞没有接收到任何激活信号，或者因为很少有细胞可以进入S期(49). 或者，由于TCR/CD28信号传导的CsA不敏感成分的协同作用，这些功能可能仍然是可诱导的。对添加IL-2的CD4淋巴细胞培养物的分析表明，在有或无CsA的情况下受刺激的CD4细胞可充分诱导多种T细胞活化标记物(图7 c)与对照组相比，CD4细胞进入S期并完成至少一次分裂的效率为～50%(图7 d). 这些发现表明，尽管在我们的实验条件下观察到其他基因的诱导和TCR信号下游的细胞周期进展，但钙调神经磷酸酶依赖性途径对于Brg1向IFN-γ启动子的募集和重塑是必需的。与NFAT在启动Swi–SNF复合物招募中的潜在作用一致，Brg1和NFAT共同从T细胞的核提取物中免疫沉淀(图7 e). 正如预期的那样，IFN-γ基因的表达没有被诱导(图7 f)当细胞在Th1条件下用CsA和补充的IL-2培养48小时。这些数据表明，钙信号通路是Brg1募集和核小体重塑的关键介体，表明NFAT通过这些机制调节Th1分化(48).

细胞制备、培养和T细胞分化。

抗体和细胞因子试剂从BD Biosciences获得，除非另有说明。幼稚CD4⁺用磁珠（Miltyeni Biotec）从幼年小鼠的淋巴器官中纯化T细胞，首先用阴性（抗CD8和MHC II磁珠），然后用CD4阳性选择⁺CD62L型^你好CD62L结合珠的细胞。典型的细胞纯度≥90%CD4⁺CD44细胞^洛如前所述，用2μg/ml抗CD3ɛ和1μg/ml抗CD28刺激幼稚T细胞(61,62). 对于Th1分化，在存在10 ng/ml重组小鼠IL-12（Leinco）和1μg/ml纯化抗IL-4（11B11）的情况下刺激细胞。对于Th2分化，细胞在5 ng/ml小鼠IL-4、0.5μg/ml抗IFN-γ和1μg/ml反IL-12中培养。阻止各种形式的分化（Th_无效的条件），细胞在IL-2、抗IL-4、抗IL-12 p40和抗IFN-γ中培养。2-6天后，细胞未受刺激或用抗CD3+抗CD28或PMA+离子霉素重新刺激6小时(14,22). 对于细胞周期分析，CD4细胞被激活并在上述Th1条件下生长（±0.5μg/ml CsA），进行CD4染色，渗透，并用碘化丙啶染色。为了测量分裂，细胞首先用CFSE（Invitrogen）染色，然后在Th1条件下激活并生长（±CsA）。

原代T细胞的逆转录病毒转导。

如前所述进行逆转录病毒载体转染和感染(61,62). 简言之，幼稚的CD4⁺通过磁激活细胞分选纯化T细胞，然后用抗CD3/CD28激活细胞并在Th_无效的或Th2条件。发展Th_无效的或Th2细胞用空载体（RVGP或MiT；参考63)与RVGP中短发夹cDNA的比较（加利福尼亚大学洛杉矶分校S.Smale的礼物，加利福尼亚州洛杉矶；参考64)或MiT-BAF57ΔN活化后18 h，在相同条件下再培养30 h。然后将感染人群切换到Th1条件下，培养3d，再刺激（抗CD3+抗CD28），并通过细胞内IFN-γ染色进行分析。用RVGP或短发夹载体转导EL4 T细胞，与原代CD4 T细胞一样，但感染后24 h开始选择3μg/ml嘌呤霉素，并用流式细胞仪监测GFP表达。在这些选定的EL4细胞（>95%GFP）的提取物上进行Brg1的蛋白质印迹⁺).

细胞核和染色质的制备和消化。

CD4细胞⁺T细胞在0.1 M NaCl、1 mM EGTA和50 mM Hepes（pH 8.0）（1%体积/体积最终浓度）中用十分之一体积的11%甲醛溶液进行交联（冰上20分钟）。然后添加甘氨酸（最终浓度为0.125 M；10 min）。用冰镇PBS冲洗细胞三次，再悬浮在裂解缓冲液中（10 mM Tris，pH 7.4，10 mM NaCl，3 mM MgCl₂，0.5%NP-40，0.15 mM精胺和0.5 mM精脒），并在冰上孵育10分钟。将细胞核造粒，在不含CaCl的MNase消化缓冲液（10 mM Tris，pH 7.4，15 mM NaCl，60 mM KCl，0.15 m M精胺，0.5 mM亚精胺）中洗涤₂，并重悬于含有3mM CaCl的MNase消化缓冲液中₂对于核小体定位，添加MNase（Roche），并通过添加200μl蛋白酶K缓冲液（100 mM Tris-Cl，pH 8.5，5 mM EDTA，200 mM NaCl，0.2%SDS和100μg/ml蛋白酶K）终止反应（20°C下200μl中5分钟）。样品在56°C下培养过夜，然后通过异丙醇沉淀纯化DNA。

REA分析。

用1×PBS清洗细胞一次，再悬浮在裂解缓冲液中（10 mM Tris，pH 7.4，10 mM NaCl，3 mM MgCl₂，0.5%NP-40，0.15 mM精胺和0.5 mM精脒）在冰上5分钟，并用RE缓冲液（10 mM Tris，pH 7.4，50 mM NaCl，10 mM MgCl）清洗一次₂0.2 mM EDTA、0.2 mM EGTA、0.15 mM精胺和0.5 mM精脒）。将细胞核重悬于100μl推荐的缓冲液（New England Biolabs，Inc.）中，然后加入RE，并通过加入等体积的100 mM Tris、pH 8.5、5 mM EDTA、200 mM NaCl、0.2%SDS和100μg/ml蛋白酶K在56°C下孵育过夜来停止反应（20°C下20分钟）。如MNase实验所述进行DNA纯化。

南部、北部和西部印迹分析。

将15或10μg MNase处理或RE-digested细胞DNA与侧翼RE消化完成。通过琼脂糖凝胶电泳（1.2%用于MNase处理的DNA，1%用于RE-digessed DNA）分离样品，然后转移并与IFN-γ启动子的放射性标记探针杂交（−550至−250）。对于Northern blots，在存在或不存在0.5μg/ml CsA的Th1或Th2分化条件下激活并生长原始CD4 T细胞。总细胞RNA通过变性琼脂糖凝胶电泳进行解析，并用编码IFN-γ、次黄嘌呤磷酸核糖转移酶、IL-12Rβ2或GADPH的cDNA进行探测，如前所述(59). 对于Western blot分析，细胞提取物通过SDS-PAGE进行解析，然后用抗-T-bet（4B10；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）、–p-STAT 4（Y-693 STAT 4；Zymed Laboratories）、-Brg1（Upstate Biochemicals）或–亲环素B进行免疫印迹，如前所述(62).

LM-PCR用于核小体定位。

如前所述进行LM-PCR(65,66)稍作修改。用多核苷酸激酶磷酸化4μg MNase处理的DNA，并用单向连接剂连接。结扎后，添加等量的PCRL缓冲液（10 mM Tris-Cl、pH 8.8、50 mM KCl、0.25%吐温20和0.25%NP-40）。将十分之一的结扎样品用于PCR（22个周期，延长时间从5分钟开始，每增加三个周期增加30秒）。产品在2%琼脂糖凝胶上溶解，并用内部寡核苷酸进行探测。引物和内部寡核苷酸探针的大致位置如所示图2.

IP。

对于ChIP分析，T细胞用甲醛短暂固定，冲洗，然后用MNase进行核小体定位。用MNase部分消化细胞核，然后添加等量的ChIP稀释缓冲液（15 mM Tris、pH 8.0、150 mM NaCl和1%Triton X-100），并对样品进行声波处理，使平均DNA长度为100–600 bp。将剪切的染色质离心成颗粒碎片，将上清液调节为1%Triton X-100、0.1%脱氧胆酸钠和0.1%SDS（IP缓冲液）和0.15 M NaCl。蛋白A珠与正常兔IgG孵育（4°C下30分钟），然后使用珠抗体复合物预处理染色质（4°C下1小时）。然后在4°C下使用2μg正常兔IgG或抗Brg1兔多克隆抗体（Upstate Biochemicals）隔夜进行IP。用DNA-饱和蛋白A收集免疫复合物，用0.3 M NaCl的IP缓冲液洗涤四次，用IP缓冲液清洗两次，用TE缓冲液清洗一次。然后将珠再次悬浮在TE缓冲液中，调节至0.5%十二烷基硫酸钠和200μg/ml蛋白酶K，并在56°C下培养3小时，然后在65°C下过夜，以逆转交联。通过酚-氯仿萃取纯化DNA，在10μg糖原存在下沉淀，并在50μl TE缓冲液中重新悬浮。使用IFN-γ启动子区域内的引物扩增IP产物（正义，5′-CACCTTAGTCACCATTA-3′；反义，5′-GCCAGAGTGTAGCGTTCAT-3′）。对于co-IP，制备Th1细胞并重新刺激6 h（PMA+离子霉素，如细胞制备、培养和T细胞分化中所述），或激活Jurkat T细胞（PMA+离子霉素；4 h）。核提取物（Th1细胞为0.5 mg，Jurkat细胞为1 mg蛋白质）在4℃下用1μg非免疫兔IgG在蛋白A珠存在下预处理2 h。将5μg抗NFAT或1μg抗Brg1抗体（Upstate Biochemicals）添加到预处理的上清液中，在4°C下培养过夜，并恢复免疫复合物以用于ChIP分析。洗脱后的蛋白质通过Western blotting进行分析。

图。

在所有情况下，数字中的Northern、Southern和Western印迹数据表示在单个代表性实验中对膜进行单一分析后获得的图像。这种印迹数据的图形面板内的分界线表示存在用于重新排列车道以实现更大的简单性或清晰度的切割线。除非图例中另有说明，否则所有车道的曝光长度均相等。

我们感谢S.Smale、S.Brandt、M.Xu、T.Aune、E.Oltz及其实验室成员的有益讨论，以及L.Glimcher的抗T-bet抗体、S.Smale的未发表RNAi质粒、A.Rao的抗NFAT和T.Chi的BAF57ΔN cDNA。我们也感谢E.Oltz和T.Aune对手稿的批判性阅读。

这项工作得到了桑德勒家庭基金会和国家过敏和传染病研究所（AI49460拨款）的支持。

作者没有相互冲突的经济利益。