LSD1与组蛋白去甲基化化学

摘要

介绍

确定人类基因组序列的一个惊喜是，我们的DNA编码的基因相对较少（约25000个）[1]. 因此，生物学家比以往任何时候都更加认识到，导致我们复杂性的信息多样性源于转录后机制，包括RNA剪接和蛋白质翻译后修饰。后者允许多种共价蛋白质结构改变，包括磷酸化、乙酰化、泛素化、硫酸化、糖基化、脂质化和甲基化[2]. 蛋白质化学结构的这些变化往往会对细胞中蛋白质的机制和功能产生深远影响。

核心组蛋白高度保守，在调节染色质结构和DNA可接近性以进行复制、修复和转录方面发挥关键作用[三]. 人们对组蛋白翻译后修饰的定位和表征一直很感兴趣，这些修饰引导染色质重塑并解释表观遗传学。在这方面，蛋白质赖氨酸修饰在基因调控史上有着特殊的地位。Allfrey及其同事在20世纪60年代证明，组蛋白赖氨酸乙酰化经常在处于激活状态的染色质中发现[4]. 组蛋白赖氨酸甲基化在结构和功能上与乙酰化相互作用。我们现在知道，赖氨酸乙酰化和甲基化的影响比这些早期概念更加多样化，并且取决于特定的修饰位点以及特定基因的其他因素。组蛋白赖氨酸乙酰化和脱乙酰化关键酶的一系列发现推动了该领域的研究进展[5,6]一方面与甲基化和去甲基化[7,8••]另一方面。

2000年报道了第一批特异性组蛋白赖氨酸甲基转移酶，正如预期的那样，是S-腺苷蛋氨酸依赖酶[7]. 至少有两类组蛋白赖氨酸甲基转移酶，即含有SET结构域的蛋白质家族[9]和DOT1的非SET结构域蛋白类似物[10-12]. 其中一些甲基转移酶对其靶向赖氨酸非常特异，并优先添加一个、两个或三个甲基。多年来，组蛋白上的甲基化标记是否“永久”尚不确定。与大多数涉及水解反应的翻译后修饰的可逆性不同，由于N-Me键的动力学稳定性，以这种方式裂解赖氨酸甲基化的可能性似乎较小。1973年，Paik及其同事证明了N-甲基化小牛胸腺组蛋白的酶去甲基化，尽管他们无法最终确定相应的酶[13].

赖氨酸脱甲基酶

2004年末，有报道称，一种似乎是多胺氧化酶同系物的黄素依赖性胺氧化酶LSD1能够对组蛋白H3的Lys-4进行选择性去甲基化[8••]. 这项研究为赖氨酸甲基化是否是静态表观遗传标记的争论奠定了基础，并为染色质领域开辟了新的篇章。自从LSD1的最初描述以来，在可逆蛋白质甲基化方面的分子生物学研究进展迅速。文献中描述了至少十种其他赖氨酸脱甲基酶，属于铁（II）-α-酮戊二酸依赖性脱甲基酶的Jumonji C或JmjC家族，具有赖氨酸位点和底物甲基化程度的不同特异性[14-24] (表1). 在某种程度上，这些JmjC蛋白的生化分析落后于它们的遗传作用。令人担忧的是，很少有关于JmjC催化反应的动力学研究报道，从公布的数据推断出的估计值表明，它们的周转数可能在0.01分钟的范围内⁻¹组蛋白底物，约为LSD1的300倍[25]. 这些异常缓慢的反应速率可能只是反映了需要使用尚未确定的辅助蛋白来刺激JmjC活性，但存在替代底物的可能性。

相比之下，对LSD1的生物化学研究进展得更快，在这个关键时刻，LSD1是一种真正的组蛋白去甲基化酶，这一点几乎没有疑问。LSD1的结构包含一个经典的胺氧化酶催化结构域，即N末端SWIRM结构域，该结构域被提议参与核小体靶向[26]，和一个N端扩展[8••]. LSD1的催化周转与FAD依赖性胺氧化酶的预期一样进行。同时进行胺氧化和黄素还原后，黄素被一当量的分子氧再次氧化，产生化学计量比的过氧化氢和甲醛作为脱甲基副产物(图1a). 由于过氧化氢和甲醛都具有诱变潜力，并且LSD1在细胞核中产生它们，因此解毒途径和严格控制酶活性的风险一定很大。有人提出，副产品甲醛可以被正式回收，并最终成为S-腺苷甲硫氨酸依赖性组蛋白甲基转移酶的捐赠甲基[27].

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图1

脱甲基酶的催化机理

（a）组蛋白H3的Lys-4的FAD依赖性去甲基化通过亚胺离子的水解进行，随后胺被黄素双电子氧化。R=核糖腺嘌呤二核苷酸（b）三甲基赖氨酸底物的铁（II）依赖性去甲基化通过铁（Ⅱ）、α-酮戊二酸和O进行₂甲基C-H键的衍生羟基自由基氧化。

LSD1反应机理

LSD1是基于序列和最新X射线晶体结构的单胺氧化酶家族成员[8••,28]对于这些酶的详细催化机制，人们进行了大量的研究。FAD辅因子被分子氧氧化，可能是通过单电子机制。LSD1的研究表明，这种黄素氧化很快[29]根据黄素光谱的变化，在静息状态下，经典的FAD吸光度最大值约为460和380 nm，归属于完全氧化的黄素和一种单电子还原的半醌形式[30]. 胺氧化转化为亚胺的确切机制存在争议，可能涉及氢化物转移或单电子机制[31,32]. 最近对黄素依赖性氧化酶色氨酸2-单加氧酶的精细研究可能揭示一般反应类别。通过测量氘和¹⁵N同位素对胺-亚胺反应的影响，作者发现氘效应较大（6.0±0.5），反之亦然¹⁵N同位素对CH键断裂的影响（0.9917±0.0006）[31]. 这被解释为有利于胺氧化的氢化物转移机制而非自由基机制，因为如此大的氘效应与不可逆CH键断裂一致。这是否适用于所有其他相关的胺氧化酶，还需要进一步调查。在亚胺形成后，水合成N，O-半缩醛，随后坍塌成甲醛和胺，被认为是相对快速和自发的反应。很明显，三甲基铵官能团不能作为黄素胺氧化酶的底物，因为不存在氮孤对，而氮孤对是反应的组成部分。相反，铁（II）α-酮戊二酸加氧酶可以直接通过羟基使烷基羟基化，为季铵盐的去甲基化提供了一种化学上合理的途径(图1b)。

LSD1基板特异性

LSD1与多胺氧化酶超家族关系最密切，LSD1最初是以各种小分子多胺作为潜在底物进行测试的，但这些化合物在反应条件下表现出最小或无法检测到的转化[8••]. 然后研究了从组蛋白衍生的各种甲基赖氨酸肽作为可能的底物，包括单二甲基和三甲基Lys-4 H3尾肽、全长Lys-4甲基化组蛋白H3以及H3的二甲基-Lys-9、36和79以及H4的Lys-20肽[8••]. H3的Lys-4具有较高的底物特异性，因为在此期间没有处理其他甲基赖氨酸位点在体外分析[8••]. 福尔纳里等。证明长度大于16个氨基酸的组蛋白H3尾肽对于实现高的去甲基化酶效率是必要的，此外，基于组蛋白H3合成尾肽，LSD1对赖氨酸-4的单甲基或二甲基形式没有强烈的动力学偏好[33•]. 组蛋白H3的Lys-9（甲基化，乙酰化），Ser-10（磷酸化），Lys-14（乙酰化）、Lys-18（乙酰化[29,33•]. 有趣的是，几乎所有这些修饰都导致LSD1的酶脱甲基效率下降，揭示了天然组蛋白尾部序列的高度特异性以及组蛋白和LSD1之间静电相互作用的潜在重要性。与静电相互作用的重要作用一致，脱甲基速率对离子强度非常敏感[33•]. 这种选择性与LSD1的已知功能密切相关，LSD1与CoREST和HDAC1/2一起是一般转录抑制复合物的一部分[34-35]. 由于Lys-4的甲基化是基因激活的标志，因此该位点的甲基去除是基因沉默。有趣的是，有报道称LSD1底物特异性可以被调节体内通过蛋白质相互作用[36,37]，但这一点尚待确认在体外。

LSD1与组蛋白类似自杀抑制剂复合物的结构研究

在单胺氧化酶底物中插入各种官能团，包括环丙基和炔丙基，可将这些化合物转化为基于机械的灭活剂[38,39]. 合成了组蛋白H3肽（包括丙炔胺、氮丙啶和环丙胺）的Lys-4ε位置的取代物，含丙炔胺的肽作为一种经典的基于机理的灭活剂[40•]. 基于质谱、光学和核磁共振光谱的结合，提出了一种失活机制，即丙炔胺首先被氧化为共轭亚胺，然后与黄素辅因子进行Michael加成[24,40•] (图2a). 结果N⁵生成的黄素加合物可形成稳定结合的酶抑制剂复合物。利用这一特性，经N-甲基丙炔胺类似物诱导的失活处理后，LSD1最近获得了2.7Å的晶体结构[41•]. 为了查看肽部分的电子密度，有必要在结晶之前用硼氢化钠处理失活的络合物，这可能导致黄素和肽灭活剂之间的连接物双键减少(图2b). 硼氢化物处理的重要性被合理化，因为它增加了加合物的水解阻力，并消除了与母体加合物相关的双键立体异构体的潜在异质性。

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图2

基于机制的LSD1失活

（a）含有H3肽的N-甲基丙炔胺通过黄素N的共轭加成来灭活LSD1的拟议机制⁵在双电子氧化为亚胺离子后，电泳剂的γ-碳。（b）用NaBH还原FAD活化剂共轭物的三甲烯键₄是晶体研究所必需的。（c）所提出的催化机理是通过自由基重组和随后的脱水，在胺上进行单电子氧化和开环，来实现tranylcypromine对LSD1的失活。R=a-c中的核糖腺嘌呤二核苷酸

在CoREST存在下获得的LSD1-激活剂复合物的结构在几个方面值得注意。首先，只有组蛋白尾肽的1-7残基具有足够强的电子密度，可以进行建模(图3a). H3残基8-21的弱密度可能已检测到向SWIRM域延伸，但不足以准确建模。确定了7以上残基对脱甲基酶作用的重要性[33•]因此，LSD1-激活物结构在详细描述生物重要识别方面可能是不完整的。然而，观察到的H3残基在二级结构中形成了一个非常不寻常的三次伽马旋转序列[41•] (图3b). 伽马转结构涉及蛋白质链中i和i+2残基之间的主链氢键相互作用，从而形成伪7元环[42] (图3c). 基于相关的结构研究，大多数参与翻译后修饰的酶都能识别目标残基附近肽底物的延伸构象。据我们所知，LSD1和H3尾部之间的这种相互作用在特征酶-肽-底物复合物中是独一无二的。

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图3

LSD1激活剂晶体结构揭示的LSD1底物特异性

（a）Asp-556和Ala-1（H3肽的N末端）之间的关键相互作用的活性位点视图，以及Trp-552和Asp-555与H3肽Arg-2之间的关键交互作用。（b）H3肽骨架在Arg-2和Lys-4、Thr-3和Gln-5以及Lys-4和Thr-6之间采用的三个连续伽玛旋转构型的活性位点视图。（c）呈现包含三个连续伽玛旋转的H3肽，以说明由我,我+2主链氢键。

鉴于在LSD1复合物中观察到这种不寻常的构象，质疑其生物学相关性是合适的，特别是因为它是用自杀灭活剂获得的。然而，晶体结构揭示了H3残基侧链和LSD1侧链之间的一系列氢键和范德华相互作用，有效地预测了酶突变体和替代底物的行为[41•]. 例如，LSD1结构表明，H3的自由N-末端氨基与LSD1的Asp-555进行关键的静电相互作用。氨基被甲基取代、电荷被乙酰基掩蔽或Asp-555突变都会导致底物处理过程中的重大损失。类似实验证实了组蛋白H3的Arg-2与LSD1残基Asp-556和Trp-552之间的关键相互作用。总的来说，LSD1失活结构揭示了组蛋白H3的Lys-4高度特异性去甲基化的优雅基础。氨基末端乙酰化降低LSD1处理效率的能力可能对解释组蛋白密码具有生物学意义，因为组蛋白N末端乙酰化可能会可逆发生体内。

体内和核小体靶向

LSD1对染色质去甲基化的结构基础知之甚少体内然而，CoREST似乎在核小体中靶向组蛋白H3去甲基化方面发挥着重要作用[34,35]. CoREST的敲除大大降低了LSD1介导的组蛋白去甲基化的效率体内核小体底物的生化研究证实了这种行为。基于核磁共振和诱变实验，有人提出CoREST可能将LSD1靶向DNA[28].

在单独的实验中，有人提出LSD1可以在不同的生理环境下使组蛋白H3的Lys-9去甲基化[36,37]. 在这个模型中，雄激素受体与LSD1的相互作用被认为决定了这种底物特异性变化。如果正确，这些数据表明LSD1可能具有基因激活功能和沉默作用，这取决于启动子的上下文。这些数据尚未得到支持在体外生化研究，LSD1-H3晶体结构也没有提供如何实现这一目标的线索[41•]. 然而，最近有报道称，美国。蓬贝LSD1的同源物，splsd1和spsld2，可能靶向Lys-9进行去甲基化，为哺乳动物系统中改变的底物特异性增加了合理性[43].

LSD1小分子抑制剂

LSD1作为小分子抑制剂的治疗靶点，与目前临床验证的表观遗传HDAC酶类类似，似乎是合理的。沿着这些路线，建议使用含有环丙胺的单胺氧化酶抑制剂tranylcypromine来抑制LSD1[44•]并进一步表征为基于机械的LSD1灭活剂[45,46]. 值得注意的是，组蛋白H3的环丙胺底物类似物未能诱导LSD1失活，这表明tranylcypromine采用了一组独特的酶相互作用[25]. 最近的动力学和结构研究已经探讨了氨酰环丙烷的失活机理；这两项研究的作者提出了与图2c虽然抗LSD1的效力不如抗单胺氧化酶B，但tranylcypcromine似乎是一种有希望的进一步开发的先导剂。最近，一系列双胍和双胍多胺类似物被测试对LSD1的抑制活性。这个在体外分析表明这些化合物在性质上是非竞争性的[47]. 有趣的是，这些化合物成功地激活了与肿瘤抑制相关的沉默基因的表达，暗示了LSD1抑制在癌症治疗中的治疗潜力[47].

结论和未来挑战

从不到三年前LSD1的首次报告来看，组蛋白去甲基化领域研究的活跃程度是难以夸大的[8••]. 黄素和铁依赖性去甲基化酶似乎在基因调控和细胞生长和分化中起着关键作用。尽管如此，仍有许多剩余的挑战。这些脱甲基酶如何准确地催化反应并识别其底物体内上下文修改和调节这些交互？最近，已报道了与底物类似物结合的含有JmjC的蛋白质JMJD2A的几种晶体结构，这些应该有助于阐明特异性和催化作用的基础[48-50]. 此外，还显示了具有底物模拟物的LSD1-CoREST复合物的第二种结构，引入了多种底物结合构象的可能性[51]. 需要加大结构和酶学研究的力度，将伴侣蛋白和核小体组装考虑在内。识别小分子γ-转角模拟物是否有治疗潜力，或者其他小分子支架是否有更大的前景？在这里，合成化学家将发挥重要作用。哺乳动物基因组中是否潜伏着其他依赖黄素的蛋白质脱甲基酶，组蛋白外是否存在真正的蛋白质底物？涉及基于机制的灭活剂的化学蛋白质组方法可能在这方面发挥有用的作用[25]. 黄素和铁依赖性去甲基化酶的氧化还原化学物质是如何影响细胞核的？在防止DNA损伤方面，哪些保护措施最为关键？人们对环境毒素诱导的氧化损伤在疾病进展中所起的作用越来越感兴趣，似乎还应考虑关注化学反应性物种的内源性来源。是否存在真正的CpG岛DNA脱甲基酶？这类反应的化学挑战甚至比蛋白质去甲基化更困难，但此类DNA靶向酶仍有可能尚未被发现。我们期待着未来几年，以及在氧化脱甲基领域中有更多令人激动的发现和发展的可能性，这将在很大程度上依赖化学生物学家的参与和独创性。

致谢

脚注

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