临床投资杂志。2001年12月15日;108(12): 1771–1780.
T细胞衍生LIGHT对T细胞稳态和自身免疫的调节
,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,1 ,2 ,2和1
王静(音译)
1美国伊利诺伊州芝加哥芝加哥大学病理学系和免疫学委员会2美国明尼苏达州罗切斯特梅奥诊所免疫科
詹姆斯·C·罗
1美国伊利诺伊州芝加哥市芝加哥大学病理学系和免疫学委员会2美国明尼苏达州罗切斯特梅奥诊所免疫科
艾米·福斯特
1美国伊利诺伊州芝加哥市芝加哥大学病理学系和免疫学委员会2美国明尼苏达州罗切斯特梅奥诊所免疫科
平余(Ping Yu)
1美国伊利诺伊州芝加哥市芝加哥大学病理学系和免疫学委员会2美国明尼苏达州罗切斯特梅奥诊所免疫科
海伦·M·陈
1美国伊利诺伊州芝加哥市芝加哥大学病理学系和免疫学委员会2美国明尼苏达州罗切斯特梅奥诊所免疫科
杨旺(Yang Wang)
1美国伊利诺伊州芝加哥市芝加哥大学病理学系和免疫学委员会2美国明尼苏达州罗切斯特梅奥诊所免疫科
田田浩二
1美国伊利诺伊州芝加哥市芝加哥大学病理学系和免疫学委员会2美国明尼苏达州罗切斯特梅奥诊所免疫科
陈列平
1美国伊利诺伊州芝加哥市芝加哥大学病理学系和免疫学委员会2美国明尼苏达州罗切斯特梅奥诊所免疫科
杨新福
1美国伊利诺伊州芝加哥市芝加哥大学病理学系和免疫学委员会2美国明尼苏达州罗切斯特梅奥诊所免疫科
1美国伊利诺伊州芝加哥市芝加哥大学病理学系和免疫学委员会2美国明尼苏达州罗切斯特梅奥诊所免疫科
收稿日期:2001年7月24日;2001年10月22日接受。
摘要
抗原提呈细胞(APC)上的共刺激分子在T细胞活化和扩增中起着重要作用。然而,对于参与T-T细胞激活和膨胀所需的直接相互作用的表面分子知之甚少。LIGHT是一种新发现的TNF超家族成员(TNFSF14),在活化的T细胞和未成熟的树突状细胞上表达。在这里,我们证明阻断LIGHT活性可以减少纯化T细胞的抗CD3介导的增殖,这表明T细胞与T细胞的相互作用对这种增殖至关重要。为了测试T细胞衍生的LIGHT在免疫稳态和功能中的体内活性,生成了在T细胞谱系中表达LIGHT的转基因(Tg)小鼠。LIGHT Tg小鼠的T细胞室显著增大,外周T细胞群过度活化。LIGHT Tg小鼠自发发生严重的自身免疫性疾病,表现为脾肿大、淋巴结病、肾小球肾炎、自身抗体升高和各种外周组织严重浸润。此外,阻断LIGHT活性可以减轻T细胞介导疾病的严重程度。总之,这些发现确立了这种T细胞衍生共刺激配体在T细胞活化和扩增中的关键作用;此外,T细胞衍生的LIGHT的失调会导致T细胞稳态改变和自身免疫性疾病。
介绍
肿瘤坏死因子/肿瘤坏死因子受体(TNF/TNFR)超家族成员在免疫细胞的激活和稳态中发挥着多重作用。首先,TNF/TNFR成员协调免疫反应所需的淋巴微环境。淋巴毒素(LT)和TNF在次级淋巴组织的发育和组织以及异位淋巴新生中至关重要(1–7). 其次,TNF/TNFR成员参与调节炎症、感染和肿瘤的免疫反应(4,8–10). 第三,TNF/TNFR成员也起到细胞死亡的介质作用。Fas/Fas配体(Fas/FasL)系统可能是直接参与细胞凋亡清除自身反应性淋巴细胞的途径中最引人注目的例子(10–12). 第四,一些TNF/TNFR成员已被证明与抗原受体刺激一起促进不同淋巴细胞亚群的增殖(13–15). 例如,BAFF,一个新发现的TNF家族成员(16)也称为TALL-1(17),谢谢(18)和布莱斯(19)是一种影响B细胞增殖、激活和体内平衡的细胞因子(14,19–22). CD40-CD154介导的B细胞和T细胞之间的接触依赖性信号是产生胸腺依赖性体液免疫反应所必需的(13,23). 因此,TNF家族成员的上调可能提供一种协同刺激机制,在抗原刺激下以自分泌或旁分泌方式增加淋巴细胞的增殖。
最佳T细胞活化的特征良好的共刺激途径涉及T细胞表面分子CD28,它对活化抗原呈递细胞(APC)上表达的共刺激分子B7-1(CD80)和B7-2(CD86)作出反应(24). 先前的研究表明,小鼠B7分子可以与抗CD3单克隆抗体或伴刀豆球蛋白A(ConA)共刺激,诱导T细胞活化(25–27). CD28编号–/–小鼠对ConA的反应性受损,表明B7和CD28的相互作用对APC依赖性T细胞的激活至关重要(28). 细胞毒性T淋巴细胞抗原-4–Ig(CTLA4-Ig)是B7的可溶性受体,可阻断ConA和抗CD3单克隆抗体诱导的脾细胞或淋巴结(LN)细胞增殖(28–30). 然而,副细胞严重缺失的T细胞培养物被发现以非B7依赖的方式增殖(29). 因此,这些实验提出了两种可能性:APC衍生的共刺激信号在某些情况下可能是不必要的,例如TCR的直接交联,或者T细胞可能能够通过T细胞自身表达的配体和受体相互提供共刺激。然而,尚不清楚是否存在这种额外的共刺激分子,以及是否需要T细胞衍生的共刺激配体连接这些分子以进一步激活和/或扩张T细胞。
LIGHT是最近发现的TNF家族成员,在活化的T细胞上上调,在成熟的树突状细胞(DC)上下调(31–33). LIGHT可以结合两种受体:基质细胞和非淋巴样造血细胞上表达的LTβR(2,34)和疱疹病毒进入介质(HVEM),在T、B和其他造血细胞上表达(31,35–37). 重组LIGHT已被证明在体外与抗CD3单克隆抗体联合可协同刺激T细胞增殖(33,38). 在特定情况下,LIGHT可以通过LTβR和HVEM诱导某些肿瘤细胞株凋亡(32,39).
本研究探讨了T细胞衍生的LIGHT在T细胞稳态和T细胞相关疾病中的潜在作用。我们的数据表明,T细胞衍生的LIGHT在体外激活和扩增T细胞中发挥着重要作用。在T细胞系特异性启动子和增强子的控制下表达LIGHT的LIGHT转基因(Tg)小鼠自发发展为由T淋巴细胞过度活动引起的致命性自身免疫性疾病。此外,阻断LIGHT活性可以减轻T细胞介导疾病的严重程度,包括自发性自身免疫性糖尿病。这些发现表明,T细胞完全扩张需要通过LIGHT与T细胞相互作用,LIGHT活性的失调会导致T细胞内环境平衡的紊乱,最终导致外周耐受性的破坏。
方法
转基因小鼠。
首先通过RT-PCR将LIGHT cDNA克隆到pCDNA3.1中,然后插入plck的AscI位点。E2(芝加哥大学T.Hettmann慷慨赠送),其中包含lck公司启动子、人类生长激素基因(多聚腺苷化位点)和来自人类CD2基因的位点控制区域元件。NotI切除了一个8-kb片段,并用于芝加哥大学癌症研究中心转基因小鼠设施随后的微量注射。将小鼠的PstI消化尾DNA与一个放射性标记的0.7 kb光特异性探针杂交。通过Southern blot检测,产生了四个阳性创始者,拷贝数约为19、5、16和6,其中两个在C57BL/6(B6)背景中,另两个在C3H背景中。从四个创始人中产生了四个独立的品系,表型的程度与转基因的拷贝数相关。本研究中使用的所有小鼠都是B6背景,所示的代表性图片来自拷贝数较高的B6创始人。用流式细胞术结合LTβR-Ig检测Tg小鼠胸腺细胞、脾细胞和LN细胞中LIGHT蛋白的表达(40)和抗LIGHT抗体(33).
抗体和流式细胞仪分析。
使用以下抗体进行双色或三色染色:抗CD3-PE、抗CD3-FITC、抗CD19-PE、抗B220-FITC、抗CD62L-PE、抗CD44-Cyc、抗CD69-FITC、抗CD8-FITC、反CD8-PE、抗CD4-FITC、防CD4-Cyc、抗CD11b-生物素和抗Gr-1-生物素(美国加利福尼亚州圣地亚哥PharMingen)。脾细胞和LN细胞的单细胞悬浮液在PBS加0.1%NaN中洗涤三,并在FACScan和Cell Quest软件上进行分析(均来自美国加利福尼亚州山景城Becton Dickinson Immunocytometry Systems)。对于细胞内细胞因子染色,用50 ng/ml PMA和500 ng/ml离子霉素在37°C和20μg/ml布雷费尔丁A的存在下刺激LNs的单细胞悬浮液4小时。在4%甲醛中固定后,细胞内进行IFN-γ或IL-4染色(PharMinen)在0.5%皂苷存在下进行细胞渗透,然后对表面标记CD3进行染色。
ELISPOT公司。
ELISA斑点板(Cellular Technology,Cleveland,Ohio,USA)涂有大鼠抗小鼠IFN-γ抗体(2μg/ml)(BD PharMingen,San Diego,California,USA)。用PBS/0.1%BSA封闭平板并用PBS冲洗。添加不同浓度(0,2×10)的野生型(WT)和Tg小鼠脾细胞5, 5 × 105、和1×106并在37°C下培养16小时。添加检测抗体(生物素结合的大鼠抗鼠IFN-γ;BD-PharMinen),并在室温下孵育2小时,然后与抗生物素-碱性磷酸酶(抗生物素-AP)孵育。使用硝基蓝四氮唑基质溶液进行显色(美国密苏里州圣路易斯市西格玛化学公司)。
融合蛋白和体外增殖试验。
通过RT-PCR扩增编码小鼠脾细胞HVEM胞外结构域的cDNA(正义引物5′-ACGCGAATTTCTTGATCAAAAATGGAACCTCTCTC-3′,反义引物5’-GTAGATCTTGGAGGAGTGTGTTCTGT-3′),获得小鼠HVEM-Ig融合蛋白。将PCR片段插入包含巨细胞病毒启动子、小鼠IgG2a的Fc部分和二氢叶酸还原酶选择标记的pMIgV载体。将构建物转染中国仓鼠卵巢细胞。然后将转染体用于生成由国家细胞培养中心(美国明尼苏达州明尼阿波利斯)生产的融合蛋白。本研究中使用的LTβR-Ig已在前面描述过(40). 简言之,将编码小鼠LTβR胞外区的cDNA与人IgG1的Fc部分融合,然后转染到BHK/VP16细胞。CTLA4-Ig由与小鼠IgG2a-Fc部分融合的小鼠CTLA4细胞外结构域组成(来自美国佐治亚州亚特兰大埃默里大学Ken Newell的慷慨礼物)。本研究中使用的对照Ig为鼠IgG和人IgG(西格玛化学公司)。两种对照Ig在增殖试验中的表现相似,来自小鼠IgG组的数据如图所示抗CD3单克隆抗体是仓鼠单克隆抗体145-2C11(美国加利福尼亚州旧金山市加利福尼亚大学杰夫·布鲁斯通慷慨赠送)。来自WT B6小鼠的LN细胞或脾细胞(2×105在浓度为10、30或100μg/ml的对照Ig、HVEM-Ig、LTβR-Ig或CTLA4-Ig存在的情况下,用ConA(1.5μg/ml;Sigma Chemical Co.)刺激48小时,用1μCi的[3H]胸苷脉冲16小时,然后采集用于液体闪烁计数。对于纯化的T细胞增殖试验,将脾细胞和LN细胞混合并通过尼龙毛柱(美国宾夕法尼亚州沃灵顿Polysciences Inc.)。用免疫磁柱通过负耗尽法(加拿大不列颠哥伦比亚省温哥华市干细胞技术公司)进一步富集尼龙-羊毛柱洗脱的细胞(~80%T细胞)。经抗CD3-FITC抗体染色后,浓缩T细胞的纯度始终达到99%以上。纯化的T细胞(2×105在存在对照Ig、CTLA4-Ig或HVEM-Ig(30或100μg/ml)的情况下,用固定化抗CD3 mAb(1μg/ml。对于GM-CSF应答器增殖试验,脾细胞(2×105用GM-CSF(R&D Systems Inc.,明尼苏达州明尼阿波利斯市,美国)以2、10或50 U/ml的浓度培养WT窝友或Tg小鼠48小时,脉冲处理,并如上所述收获。
T细胞衍生的LIGHT以依赖T细胞的方式作为共刺激配体发挥作用。(一)从WT B6小鼠(5-6周龄)中收集脾细胞,并在ConA(1.5μg/ml)存在下与不同浓度的CTLA4-Ig、LTβR-Ig、HVEM Ig或对照Ig一起培养。(b条)将脾细胞和LN细胞混合,纯化T细胞并用抗CD3-FITC染色。显示CD3阳性细胞的百分比。(c(c))在HVEM-Ig、CTLA4-Ig或对照Ig存在下,用固定化抗CD3单克隆抗体(1μg/ml)刺激高纯度T细胞。扩散的测量方法是[三H] 胸腺嘧啶掺入。结果代表了三个实验。
组织学、免疫组织化学和免疫荧光染色。
显示的组织用10%福尔马林固定并包埋在石蜡中。用标准方法用苏木精-伊红(H-E)或周期性酸-希夫(PAS)对切片进行染色。如前所述进行免疫组织化学染色(41). 对于Ig沉积的免疫荧光研究,将肾脏包埋在OCT化合物中(美国印第安纳州埃尔克哈特Miles Inc.),并在-70°C下冷冻snap。将4-5微米切片气干并用丙酮固定,然后用山羊血清预处理,并用FITC-结合的山羊抗鼠IgG(H+L)(Caltag Laboratories Inc.,Burlingame,California,USA)或FITC-接合的山羊抗小鼠Ig轻链(Sigma Chemical Co.)染色。
检测自身抗体和类风湿因子。
为了检测抗DNA自身抗体,ELISA板(Dynex Technologies,Chantilly,Virginia,USA)涂有鲱鱼精子的DNA(250μg/ml)(Sigma Chemical Co.)。用PBS/0.05%吐温-20清洗板,用PBS/0.1%牛血清白蛋白封闭。以不同浓度稀释血清样品,并用AP结合的山羊抗鼠IgG检测结合抗体(美国阿拉巴马州伯明翰市南方生物技术协会)。使用分光光度计(美国加利福尼亚州门罗公园的分子器件)在405 nm处测量OD。为了检测总IgG,对山羊抗鼠Ig(H+L)(南方生物技术协会)进行包被,并使用相同的检测抗体,即羊抗鼠IgG-AP。为了检测类风湿因子,使用一组纯化的小鼠IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3包被,并使用AP-结合的山羊抗鼠IgM作为检测抗体(南方生物技术协会)。
体内治疗方案。
对于胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)模型,5-6周龄雌性NOD小鼠每周腹腔注射100μg HVEM-Ig或对照Ig(小鼠IgG;Sigma Chemical Co.),持续3周。每周使用SureStep试纸(美国加利福尼亚州米尔皮塔斯强生公司)测量从尾静脉获得的血液中的葡萄糖浓度。连续两次测量≥250 mg/dl后,动物被视为糖尿病动物。
结果
T细胞衍生的LIGHT作为T细胞扩增的共刺激分子发挥作用。
ConA被广泛用作T细胞特异性有丝分裂原,用于研究T细胞活化,T细胞活化通过APC依赖机制诱导T细胞活化(42,43). 为了测试LIGHT及其受体之间的相互作用是否需要激活/扩增T细胞,将WT小鼠的脾细胞或LN细胞与ConA在HVEM-Ig、LTβR-Ig、CTLA4-Ig或对照Ig的存在下培养。有趣的是,与对照Ig相比,将HVEM-Ig或LTβR-Ig纳入培养系统显著抑制了T细胞对ConA刺激的反应(图a) ●●●●。与之前的研究一致(28,30),CTLA4-Ig深度阻断ConA诱导的T细胞增殖(图a) ●●●●。此外,HVEM-Ig和LTβR-Ig也显著抑制了T细胞对抗CD3单克隆抗体的反应(数据未显示)。这些结果表明,LIGHT是最佳T细胞反应所必需的。
抗CD3单克隆抗体可以直接交联T细胞受体(TCR)复合体,并以APC依赖的方式刺激T细胞增殖。为了直接评估T细胞衍生的LIGHT在调节T细胞反应中的作用,使用APC严重缺失的WT T细胞来测试其对最佳剂量的抗CD3抗体的反应能力(图b) ●●●●。有趣的是,即使在强烈的TCR刺激下,HVEM-Ig对LIGHT的阻断也显著降低了无APC系统中T细胞的增殖(图c) ●●●●。除了纯化的T细胞外,使用胸腺细胞也获得了类似的结果(数据未显示)。这些数据表明,T细胞衍生的LIGHT在T细胞的激活和随后的扩张中起着重要作用,这可能涉及通过LIGHT及其受体与T细胞的相互作用。相反,在我们的无APC系统中,CTLA4-Ig对T细胞的增殖没有显示出抑制作用(图c) 之前的一项研究也表明了这一点(29). 综上所述,我们的结果与T细胞的LIGHT是通过T-T细胞依赖性相互作用激活/扩增T细胞所必需的概念一致,而APC的B7-1和B7-2对于通过APC-T细胞相互作用诱导T细胞反应更为重要。
T细胞谱系中LIGHT Tg小鼠的产生。
LIGHT在未成熟DC或活化T细胞上选择性表达(31,38). 很难区分未成熟DC衍生或T细胞衍生LIGHT对体内T细胞稳态和反应的贡献,因为这两种细胞类型都表达协同刺激分子。为了研究T细胞衍生的LIGHT在体内T细胞扩增中的作用,我们制造了在近端控制下组成性表达LIGHT蛋白的Tg小鼠lck公司启动子和CD2增强子,产生T细胞谱系特异性LIGHT表达(44,45). 当使用LTβR-Ig和抗LIGHT抗体进行流式细胞术研究时,与WT小鼠相比,Tg小鼠的脾细胞和LN细胞中观察到较高的LIGHT蛋白表达(数据未显示)。选择B6背景的第24行和第27行进行进一步调查。在这两个品系中观察到相似的表型,因此这里描述的结果在它们之间没有区别。
T细胞衍生的LIGHT足以促进体内T细胞的扩张,导致次级淋巴组织的严重扩张。
在5-6个月大的LIGHT Tg小鼠中观察到显著的表型,这些小鼠自发发展为淋巴增生性疾病,表现为脾肿大和淋巴结病(图a) ●●●●。LIGHT Tg小鼠的脾脏增大(WT小鼠为88.5±17.9 mg,Tg小鼠为339.6±82.4 mg,n个= 7,P(P)<0.001),并且在Tg LN中发现类似的表型。脾细胞总数也增加(78.5×106± 13.5 × 106重量比151.6×106± 27.7 × 106在Tg小鼠中,P(P)<0.01),并且在LNs中观察到更显著的细胞数量增加(与WT小鼠相比,Tg增加了7倍)(图b) ●●●●。与BAFF转基因小鼠相比,BAFF是另一个TNF家族成员,它的次级淋巴组织因B细胞室扩大而增大(14,16,46),LIGHT Tg小鼠的T细胞室扩张最多。LIGHT Tg小鼠脾脏和LNs中的T细胞与B细胞的比率异常增加,表明Tg小鼠的T细胞室显著增大(图c) ●●●●。用T和B细胞特异性标记物进行免疫组织化学分析表明,Tg小鼠淋巴结中的T细胞区显著增加(图d) ●●●●。因此,LIGHT Tg小鼠明显表现出外周T细胞室扩大的迹象,表明T细胞衍生的LIGHT足以导致体内外周T淋巴细胞的扩张。
T细胞衍生的LIGHT足以引起体内外周T细胞的扩张。(一)在5-8个月龄的LIGHT Tg小鼠中观察到脾肿大和淋巴结病。显示脾脏和腋下淋巴结。图片(×4)代表每组分析的七只小鼠。(b条)脾脏中的总细胞数增加(左侧面板*P(P)<0.01)和外围LN(右侧面板**P(P)<0.001)。每组分析的7只小鼠的结果具有代表性。(c(c))T(CD3)比值的FACS分析+)至B细胞(CD19+)在WT(菱形)和Tg(方形)小鼠的脾脏(左侧面板)和LN(右侧面板)中(n个= 5). (d日)LIGHT Tg LNs中T细胞区的扩大。用抗Thy1.2-Bio对T细胞(蓝色)和抗B220-FITC对B细胞(棕色)进行免疫组织化学染色。图中显示了具有代表性的图片(×10)。PLN,外围LN。
T细胞衍生的LIGHT介导的T淋巴细胞过度活化。
与WT淋巴细胞相比,从Tg小鼠分离的淋巴细胞显示出整体的成胚激活,这表明这些细胞的前向光散射特性增加。为了研究T细胞系中LIGHT的过度表达是否会影响外周T细胞的激活状态,我们使用T细胞激活标记物通过流式细胞术检测了Tg小鼠的外周T淋巴细胞。CD69和CD25(IL-2Rα)被认为是T细胞的早期激活标志物。CD62L(L-选择素)在原始T淋巴细胞上高水平表达,其在活化T细胞上的表达降低,而CD44在活化细胞上上调(47). 因此,CD62L低的CD44细胞高的T细胞被认为是激活的效应细胞。使用针对这些激活标记物的抗体和针对T细胞标记物(如CD3或CD4/CD8)的抗体进行双重和三重染色。在LIGHT Tg T细胞中CD69和CD25的表达显著上调,这表明Tg T淋巴细胞一直处于激活状态(图a和数据未显示)。此外,CD62L显著增加低的CD44细胞高的在LIGHT Tg小鼠中观察到T细胞(Tg组69.27%,WT组19.25%)(图b) ●●●●。综上所述,这些结果表明,LIGHT在T细胞上的组成性表达足以激活和扩增体内外周T细胞。
T细胞衍生的LIGHT介导的T淋巴细胞过度活化。(一)用CD3和CD69抗体对WT和Tg小鼠的脾细胞或LN细胞进行染色。数字表示CD3的百分比+CD69型+细胞。(b条)用CD3、CD62L和CD44抗体对WT和Tg小鼠的脾细胞进行染色。点图表示CD3上的门控单元+人口。结果代表了五个实验。使用5-8个月龄的WT和Tg小鼠。MLN,肠系膜LN。
在LIGHT Tg小鼠中增加细胞因子的产生和颗粒吞噬细胞谱系的扩展。
活化T淋巴细胞的主要反应之一是产生细胞因子。为了评估T细胞衍生的LIGHT对体内T细胞功能的影响,我们通过细胞内染色分析了Tg T细胞的细胞因子产生。用PMA和离子霉素体外刺激LN细胞4小时,用IFN-γ或IL-4特异性抗体染色,并用流式细胞术进行分析。与WT对照组相比,在Tg小鼠中检测到产生IFN-γ的T细胞增加了五倍以上(图a) ●●●●。用ELISPOT检测IFN-γ产生细胞的频率。Tg脾细胞群中有更多的IFN-γ产生细胞(73±6/10)6单位Tg vs.14±3/106WT中)。流式细胞术分析显示,Tg小鼠比WT小鼠产生更多IL-4的T细胞(Tg为1.35%,WT为0.19%)。
在LIGHT Tg小鼠中增强细胞因子的产生并扩大巨噬细胞和粒细胞群。(一)用PMA(50 ng/ml)和离子霉素(500 ng/ml。数字表示产生IFN-γ-的T细胞(CD3)的百分比+). 数据代表了三个实验。(b条)在Tg小鼠中,GM-CSF反应前体物增加。用不同浓度的GM-CSF培养WT和Tg小鼠脾细胞;增殖的测量方法是[三H] 胸腺嘧啶掺入。(c(c))Tg小鼠巨噬细胞和粒细胞群的FACS分析。用CD11b或Gr-1抗体对WT和Tg小鼠的脾细胞(spl)进行染色。CD11b的百分比+和Gr-1+显示单元格。(d日)Tg小鼠巨噬细胞和粒细胞数量增加。从WT和Tg小鼠分离脾细胞并测定细胞数,然后用CD11b-Bio或Gr-1-Bio抗体对细胞进行染色。计算绝对细胞数。这些结果代表了三个实验。使用5-8个月大的WT同窝鼠和Tg小鼠。
GM-CSF也可以由活化的T细胞产生。GM-CSF促进造血,导致脾脏增大,GM谱系优先增加,成熟巨噬细胞和粒细胞活化。我们测试了脾细胞培养上清液中GM-CSF的生成,发现Tg小鼠中GM-CSF的生成大约增加了三倍。此外,组织学分析显示,Tg小鼠的GM谱系中有更多祖细胞,其特征是体积较大,细胞核和细胞质偏心,含有许多嗜青颗粒(数据未显示)。与这个概念一致,Tg小鼠的脾细胞对GM-CSF的反应显著高于WT脾细胞(图b) ●●●●。从体外培养中回收脾细胞,并用流式细胞仪分析,以确定GM-CSF扩增的不同细胞群。正如我们所料,恢复的主要人群是巨噬细胞(CD11b+)和粒细胞(Gr-1+)(未显示数据)。同样,Tg小鼠的骨髓(BM)细胞对GM-CSF的反应也比WT小鼠的更为强烈(数据未显示),这表明Tg小鼠BM中的GM-CSF-反应前体增加。我们的结果表明,GM-CSF的产生增加,导致GM谱系中系统性造血增加,这可能是由于Tg小鼠中LIGHT介导的T细胞活化。
与上述观察一致,我们还通过流式细胞术分析确定了Tg脾脏中不同的非T和非B细胞群。对该人群的进一步分析表明,这些细胞中的大多数是CD11b+或Gr-1+,表明Tg小鼠的巨噬细胞和粒细胞扩张(图,c和d)。因此,T细胞衍生的LIGHT足以引起巨噬细胞和粒细胞的膨胀。巨噬细胞和粒细胞是免疫反应的主要效应细胞;在这些细胞的参与下,活化的T细胞可能会破坏周围组织,导致自身免疫。
LIGHT Tg小鼠出现严重的自身免疫表现。
从5个月开始,在LIGHT Tg小鼠中持续观察到显著的表型,表明LIGHT在诱导自身免疫中的潜在作用。有趣的是,对7对5–8个月大的Tg和WT小鼠的检查显示,Tg小鼠的肠壁弥漫性增厚高达0.5厘米,而WT对照的平均厚度为0.1厘米。显微镜检查显示,在固有层和粘膜下层有明显的炎性细胞浸润,以弥漫模式形成显著的生发中心,而对照组小鼠中从未出现过这种现象(图a) ●●●●。浸润主要由淋巴浆细胞构成,偶尔有肥大细胞和中性粒细胞(图a) ●●●●。从5个月大开始,几乎所有的Tg小鼠都观察到了0.3 cm至2 cm的散在斑块样皮肤损伤,以及溃疡和疤痕形成,而相同年龄的对照小鼠从未表现出这种表型;仔细检查了10对Tg和WT小鼠。组织切片显示明显的急性和慢性混合炎症细胞浸润,从表皮延伸到皮下(图b) LIGHT Tg小鼠毛囊异常增殖。在LIGHT Tg小鼠的皮肤病变和人类硬皮病之间没有发现明显的相似之处,硬皮病是一种由血管和免疫系统功能失常导致胶原蛋白过度生成的自身免疫性疾病。这种肠道和皮肤损伤似乎是B6 LIGHT Tg小鼠独有的,因为它们从未在B6中观察到-液化石油气/液化石油气小鼠,通常在这个年龄开始发展为淋巴增生性疾病。炎症细胞浸润在肠道和皮肤中最为明显,但也存在于骨骼肌、肺间质和肝门区(数据未显示)。
T细胞衍生的LIGHT诱导自身免疫。肠组织学(一)和皮肤(b条)来自5-8个月大的WT和Tg小鼠。(一)用H-E对WT和Tg小鼠的结肠切片进行染色。与对照窝鼠相比,Tg小鼠肠壁厚度显著增加了几倍,并且出现了密集的炎性细胞浸润。(b条)在Tg小鼠的皮肤病变中,LIGHT Tg小鼠可观察到明显的急慢性混合炎症细胞浸润,从表皮延伸至皮下,伴有皮肤附属物破坏和毛囊异常增殖。显示了具有代表性的图片。原始放大倍数:×10。
在Tg小鼠中,肾脏病理分析揭示了更多有趣的表型,这些小鼠自发发展为弥漫性全球增生性肾小球肾炎,涉及80%以上的肾小球(图、a和b)。受累肾小球弥漫性增大,显示系膜突起、毛细血管内和毛细血管外增生,毛细血管管腔闭塞(图b) ●●●●。坏死的局灶性区域含有碎裂的细胞核(苏木精体),同时伴有白细胞浸润和节段性硬化。PAS染色显示Tg小鼠基底膜显著增厚(图,c和d)。光镜下的特征性弥漫性增生与系统性红斑狼疮(SLE)患者的IV型狼疮肾炎非常相似。与此观察结果一致,免疫荧光染色显示Tg小鼠中弥漫性IgG沉积在粗颗粒模式中(图e和f),类似于IV型狼疮患者经常观察到的情况。针对总Ig轻链的免疫荧光染色显示类似于IgG的模式的可比阳性染色(图、g和h)。电子显微镜下观察到的内皮下和系膜下沉积物进一步证实了Tg小鼠肾脏的这些发现(数据未显示),这是狼疮肾炎的病理学表现。在LIGHT Tg小鼠中观察到的表型与MRL相似-液化石油气/液化石油气小鼠,一种已建立的狼疮小鼠模型。
LIGHT-Tg小鼠肾脏病理分析和自身抗体和类风湿因子水平升高。WT的代表性图片(一,c(c),电子、和克)和Tg(b条,d日,(f)、和小时)显示了5-8个月大的小鼠。(一和b条)H-E染色;(c(c)和d日)PAS染色;(电子–小时)免疫荧光染色。原始放大倍数如下:一–d日, ×40;电子–小时, ×63. 5-8个月龄Tg小鼠的肾小球增大,分叶状,细胞增多,炎症细胞浸润(b条). 在Tg小鼠的毛细血管壁和系膜中观察到PAS阳性物质的沉积(d日). 用FITC-偶联山羊抗鼠IgG或总Ig对WT和Tg小鼠肾脏切片进行染色。在Tg小鼠的肾小球中观察到强烈的Ig沉积((f)和小时). 血清抗DNA自身抗体水平(我,底部面板)和总IgG(我用相同的WT(开环)和Tg(填充方形)小鼠通过ELISA平行测定(n个= 5). WT和Tg小鼠血清类风湿因子水平(n个=7)通过ELISA测定(j个). 显示血清稀释度,数据为平均值±SD。
自身抗体的升高既是自身免疫性疾病临床诊断的标准,也是MRL的特征-液化石油气/液化石油气老鼠(48). 因此,我们用ELISA检测了LIGHT Tg小鼠和对照同窝小鼠的血清中的自身抗体。LIGHT Tg小鼠的抗DNA自身抗体水平比对照同窝鼠高出八倍,而Tg小鼠中的总IgG水平仅比对照同床鼠的水平略有增加(图i) ●●●●。Tg小鼠还表现出类风湿因子水平升高,这是慢性炎症和自身免疫性疾病中另一种常见的自身抗体(图j) ●●●●。类狼疮性肾小球肾炎和多器官炎性细胞浸润增加,以及血清自身抗体升高,表明LIGHT Tg小鼠建立了自身免疫。因此,T细胞衍生的LIGHT介导的T细胞过度增殖和过度激活导致B细胞耐受性的破坏,支持LIGHT表达失调可能是诱导T和B细胞自身免疫和自身免疫疾病发病机制中的关键因素的观点。
LIGHT在T细胞相关疾病中的参与。
为了研究LIGHT是否参与T细胞介导疾病的发展,我们选择了自发性自身免疫性糖尿病作为我们的模型。IDDM是一种T细胞介导的自身免疫性疾病,其中胰岛素分泌β细胞被自身反应性T细胞选择性破坏,而非糖尿病(NOD)小鼠是研究IDDM的成熟模型(49,50). 为了研究LIGHT在IDDM中的潜在作用,5-6周龄雌性NOD小鼠每周接受HVEM-Ig(每只小鼠100μg)短期治疗(3周),并从8-9周龄开始监测血糖水平。HVEM是LIGHT的受体,不与LT膜结合(31). 在6-7周龄时,NOD小鼠的许多胰岛已经被自身反应性T细胞浸润,此时用HVEM Ig治疗可以显著防止IDDM的发展。对照组80%以上的小鼠出现IDDM,而治疗组只有25%的小鼠出现该病(图). 这些结果表明,阻断LIGHT可以预防IDDM的发病,LIGHT可能在T细胞相关疾病的发展中发挥关键作用。
阻断LIGHT活性可减轻自发性自身免疫性糖尿病的严重程度。LIGHT的可溶性受体阻止了IDDM的发展。NOD雌性小鼠(5-6周龄)每周接受HVEM-Ig治疗2周。从9周大开始每周测量血糖水平(n个=8),连续两次测量≥250 mg/dl后,动物被视为糖尿病。
讨论
以往对T细胞活化的研究主要集中于T细胞与APC相互作用介导的共刺激途径,如CD28/B7系统(24,51,52). 然而,对于T细胞克隆性扩增和T细胞介导疾病所需的参与T-T细胞相互作用的表面分子知之甚少。在这里,我们表明,在缺乏APC的情况下,LIGHT的可溶性受体HVEM-Ig阻断LIGHT可显著降低抗CD3介导的T细胞增殖,这表明LIGHT可以作为一种协同刺激分子,以T-T细胞依赖的方式使外周T细胞完全扩张。与阻断LIGHT活性的试剂相比,CTLA4-Ig对我们无APC系统中T细胞的增殖没有任何影响(图c) ●●●●。这些结果与CD28与共刺激配体B7家族的相互作用对于通过APC依赖机制诱导T细胞活化至关重要的概念一致(24,51,52)而LIGHT可能对T-T细胞的相互作用很重要。综上所述,这些结果支持我们的假设,即T细胞的LIGHT是通过T细胞与T细胞的相互作用进行T细胞扩增所必需的,而APC的B7-1/B7-2可能对启动早期T细胞反应更为重要。
检测T细胞衍生共刺激分子在外周T细胞稳态和功能中的体内活性一直是非常困难的。因此,我们在T细胞谱系中生成了LIGHT的Tg小鼠来解决这个问题。我们的结果不仅表明,T细胞衍生的LIGHT足以促进外周T细胞的活化和扩张,从而导致自身免疫性疾病的发展,而且还表明LIGHT可能在T细胞依赖性疾病(如IDDM)中发挥重要作用。我们的LIGHT研究结果提供了一个T细胞衍生共刺激配体的例子,该配体足以诱导下游事件程序,导致T细胞激活、外周耐受性破坏和自身免疫诱导(图). 尽管LIGHT可能结合三种受体(31,53),HVEM可能是负责T-T细胞相互作用的受体,因为在T细胞上没有发现LTβR(2,34)DcR3/TR6是一种缺乏跨膜结构域的诱饵受体(53). 此外,LIGHT可能在T细胞上表达一个未知的受体。由于LIGHT对T细胞激活的上调作用,配体和受体的同时存在可能为外周T细胞以自分泌或旁分泌方式克隆性扩增提供了一种刺激机制,因为LIGHT可以分泌。这些数据表明,T细胞衍生的LIGHT在T细胞的激活和随后的扩增中发挥着重要作用,这需要T细胞可能通过LIGHT/HVEM轴相互作用。
建议的光诱导自免疫模型。问号表示其他未识别的受体。
TNF家族成员在淋巴细胞内环境稳定中发挥着多重关键作用。例如,BAFF转基因小鼠是最近确定的TNF家族成员,其外围B淋巴细胞数量增加,分泌自身抗体,并形成SLE样症状,导致肾小球肾炎和外周耐受性破坏(14,16,46,54). 同样,LIGHT在T细胞内稳态中起着重要作用,因为LIGHT的失调会导致自我耐受能力的崩溃和自身免疫疾病的发展。因此,LIGHT可能是T细胞生物学中BAFF的对应物,在失调时具有明显的打破外周耐受的能力。我们没有排除在Tg小鼠中LIGHT过度表达可能直接或间接导致T细胞和其他免疫细胞中观察到的表型的可能性。
LIGHT可能导致T细胞相关疾病。用HVEM Ig(一种LIGHT的可溶性受体)治疗可显著预防IDDM的发展,这表明LIGHT可能在IDDM的发病机制中发挥关键作用。HVEM不与膜LT结合,已证明与可溶性LTα结合较弱三在体外(31). 静息T细胞中LIGHT的表达较低,但在我们的移植物抗宿主病样(GVHD样)自身免疫模型中可以发现LIGHT表达增加(高达17.5%的T细胞抗LIGHT抗体染色阳性)。事实上,LIGHT在GVHD的发展中起着至关重要的作用(33). 总的来说,这些观察结果表明,T细胞衍生的LIGHT可能参与T细胞介导的疾病,其失调可能触发T细胞的异常激活,导致严重的组织破坏和自身免疫表现。
有趣的是,LIGHT Tg小鼠在包括肠道和皮肤在内的许多器官中都有活跃的单核细胞浸润,这显示出最明显的病理表现,包括皮肤溃疡和疤痕形成以及肠道大量浸润。活化T细胞的广泛扩增可能对宿主无害,但与外部环境接触的组织除外,在这些组织中,T细胞对微生物或环境抗原的过度反应会导致局部病理改变。换句话说,自身免疫性疾病可能表现为对环境抗原的调节失调。
我们的结果表明,LIGHT是一种重要的共刺激分子,以T-T细胞依赖的方式发挥作用,是外周T细胞完全扩张所必需的。LIGHT的失调或过度表达可能在T细胞介导的炎症和自身免疫的发病机制中发挥重要作用。此外,我们的转基因模型表明,LIGHT足以引起外周T细胞的激活和扩增,从而导致外周耐受性的破坏。这种转基因模型为研究各种自身免疫性疾病的发病机制带来了新的见解,并为研究调节T细胞活化、免疫耐受和诱导自身免疫的机制提供了一个有趣的框架。
致谢
我们感谢Hans Schreiber和Lisa Hoffman的批评性阅读和有益的讨论。我们还感谢国家细胞培养中心利用其生物反应器生成HVEM-Ig和LTβR-Ig。本研究部分得到了Biogen、NIH(HD-37104和DK-58897)、伊利诺伊州和国际青少年糖尿病基金会(1-2000-875)的资助。
工具书类
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