粘蛋白瞬时受体电位通道中的激活突变导致变异摇摆小鼠的黑素细胞丢失

摘要

TRPML1是一种假定的细胞内离子通道，与晚期内体/溶酶体标记物共定位(1——三). TRPML2和TRPML3不太为人所知，但也被认为主要是细胞内通道，调节穿过内胚层膜的离子通量(4). TRPML3在变种中突变-摇摇晃晃(弗吉尼亚州和弗吉尼亚州)老鼠(5). 小鼠纯合子或杂合子弗吉尼亚州（A419P）突变为耳聋，表现出环状行为，表明前庭缺陷。杂合子表现出杂色和淡色的皮毛，而纯合子几乎是白色的，生存能力降低(6). TRPML3的第二个突变发生在原始弗吉尼亚州库存（A419P；I362T）导致不太严重(弗吉尼亚州)表型(7).

粘蛋白通道功能尚不清楚，因为来自异源表达的假定TRPML电流的数据相互矛盾。TRPML1被认为是非选择性外整流单价的基础(8)或质子传导(9)电流，但这些结果都没有被其他人复制(1). 在这里，我们表明，假定片段（S）4-S5连接子中的A419P突变导致组成活性的向内整流阳离子通道，可以通过细胞的质膜进行测量。TRPML1中相应氨基酸的突变导致相似的整体电导特性。WT TRPML3在黑素细胞中高度表达，但这些细胞在弗吉尼亚州/弗吉尼亚州通过黑素细胞标记物的消失进行评估。与TRPML3的毒性一致^{弗吉尼亚州}在黑素细胞系中表达，我们假设皮毛颜色的丧失是由功能性黑素细胞的丧失引起的。

结果

耳蜗（尤其是血管纹）中富含TRPML3 mRNA(图1 A类和B类)和出生后第0天（P）0小鼠的毛囊(图1C类). 在毛囊中，我们观察到沿发干和毛球的细胞亚群中有显著染色(图1 C类和D类). TRPML3在P0处的分布与黑素细胞的分布相似，黑素细胞随后迁移至毛囊底部并定位于毛球(10). 免疫组织化学和Western blotting显示，我们产生了对TRPML3特异的抗体[支持信息（SI）图6]. 两者都是纯合的(图1E类)和杂合子弗吉尼亚州小鼠表现出皮毛颜色缺陷。对P4 WT小鼠皮肤切片的TRPML3特异性免疫标记显示，毛囊中的细胞，特别是毛球上部的细胞有特异性细胞质染色(图1F类)与成熟黑素细胞在此发育阶段的位置一致(11). 用黑素细胞特异性标记物对同一皮肤切片进行染色表明，TRPML3阳性细胞是黑素细胞(图1G公司). 我们证实了TRPML3在小鼠黑素细胞系melan-a2中的表达。通过Western blotting在黑色素a2细胞裂解物的免疫沉淀物中检测到与小鼠TRPML3预测大小相对应的A≈59-kDa带(图1H（H）; 请参阅中的控件SI图6).

在单独的窗口中打开

图1。

TRPML3在耳蜗和皮肤毛囊中的黑色素细胞中高度表达。(A–D)现场P0小鼠mTRPML3杂交。(B类和D类)传感探头。(A类)耳蜗血管纹中的TRPML3。（比例尺，100μm）(C类)TRPML3在胡须毛囊中的表达。注意被反义探针染色的单个细胞。（比例尺，100μm）(E类)WT和弗吉尼亚州/弗吉尼亚州6周大的室友。(F类和G公司)TRPML3特异性抗体的免疫组织化学染色(F类)和黑素细胞特异性抗体（HMB45）(G公司)P4-WT小鼠石蜡包埋皮肤切片；抗体染色为棕色，细胞核为蓝色。在毛球上部区域和两侧的细胞细胞质中可见TRPML3特异性染色（箭头所示）。（比例尺，50μm）(G公司)毛球中类似位置的黑色素细胞。（比例尺，50μm）(H（H）)使用抗TRPML3抗体在黑色素a2细胞裂解液中不存在或存在阻断肽（BP）的情况下进行免疫沉淀。TRPML3频带≈59 kDa（箭头）。星号表示ab重链；分子质量标记显示在左边。

这个弗吉尼亚州突变位于假定的S4–S5连接子中(图2A类)对应于研究良好的K中的类似区域_v（v）将S1–S4电压传感器/配体域的运动连接到S5–S6离子导电孔S6栅极中的疏水口袋的通道(12). hNa类似区域中脯氨酸（A863P）取代丙氨酸_V（V）1.7产生神经元超兴奋性和神经病变(13). 我们比较了WT，弗吉尼亚州、和弗吉尼亚州异源表达HEK293T细胞中的TRPML3。对于WT TRPML3(图2B类)，仅测量到较小的非选择性电流（−70±14 pA/pF，−80 mV，n个= 82) (图2G公司). 在TRPML3中可以看到更大的内部整流电流^{弗吉尼亚州}-转染细胞(图2B类); TRPML3号机组^{弗吉尼亚州}-调解的(我_TRPML3-Va型)为−456±40 pA/pF（−80 mV；n个=17），≈6倍于我_{TRPML3号机组}在转染黑色素瘤B16细胞中也获得了类似的结果（数据未显示）。双突变体，我_{TRPML3-VaJ、，}约为4倍我_{TRPML3号机组}电流-电压关系(I–V型)所有三种TRPML3蛋白的逆转电位都相似，这表明弗吉尼亚州突变增加了通道活性，但没有改变其孔隙特性。用碱性氨基酸（KK）取代TRPML3孔区的两个带负电荷的酸性氨基酸（D458和D459^{弗吉尼亚州}（TRPML3-KK、TRPML3^{弗吉尼亚州}-KK、，图2 B类和G公司)表明TRPML的总体架构与其他TRP类似（以及K（K）_V（V）)频道。TRPML3型^{弗吉尼亚州}-表达细胞还显示出强大的内部整流电流，以响应电压阶跃(图2C类).我_TRPML3-Va型没有随着电压或时间的变化而显著失活。此外，我_TRPML3-Va型重复去极化后无累积缓慢失活。因此，TRPML3^{弗吉尼亚州}在静息膜电位下具有组成性活性。

在单独的窗口中打开

图2。

表示的TRPML1和TRPML3中的大组成有源内向整流电流弗吉尼亚州突变体。(A类)TRPML（TRPML1、TRPML2和TRPML3）蛋白序列在弗吉尼亚州基因座。红色星号表示TRPML3中的Ala-419，它是弗吉尼亚州老鼠。TM5，推测的跨膜S5。(B类)转染WT-TRPML3、TRPML3的HEK293T细胞的代表性全细胞电流^{弗吉尼亚州}、TRPLM3^{弗吉尼亚州}和TRPML3^{弗吉尼亚州}–KK结构。在标准细胞外溶液中，电压斜坡（−100至+100 mV，400 ms）以4 s的间隔激发电流（参见材料和方法). 保持电位（HP）=0 mV(C类)TRPML3中电压阶跃（−120 mV至+80 mV，增量20 mV，阶跃持续时间=90 ms）引发的大向内整流全细胞电流^{弗吉尼亚州}-表达细胞。HP=0毫伏。我_TRPML3-Va型在负电位下瞬时激活。(D类)TRPML1-和TRPML1中的代表性全细胞电流^{弗吉尼亚州}-表达HEK293T细胞。(E类)我_TRPML1-Va型由电压阶跃引起。(F类)在转染TRPML2或TRPML2的HEK293T细胞中未检测到明显的电流^{弗吉尼亚州}. (G公司)由电池电容（pF）归一化的−80 mV时TRPML通道的平均内向电流密度。(n个)=单元数。

弗吉尼亚州在TRPML1和TRPML2的同源位置发生突变。我_TRPML1公司为1.2±0.2 pA/pF（−80 mV，n个= 20,图2 D类和G公司)与载体转染的HEK293T细胞的电流密度（0.9±0.1 pA/pF，n个= 9). 相反，我_TRPML1-Va型约为80倍大（−102±8 pA/pF；n个=62）。在电压步进协议中(图2C类),我_TRPML1-Va型在负电位下向内整流，时间依赖性很小(图2E类)，尽管我_TRPML3-Va型整顿比我_TRPML1-Va型。在转染TRPML2或TRPML2的细胞中未检测到明显的电流^{弗吉尼亚州}(图2 F类和G公司).

通过以下方式替换槽阳离子N个-甲基-d日-葡聚糖（NMDG⁺)（pH 7.4）表明TRPML3^{弗吉尼亚州}是阳离子选择性离子通道(图3 A类和B类). 等渗（105 mM）Mg²⁺或Ca²⁺，一个较小的整流电流，在非常正的电位下反向（>+60 mV）(图3 A类和B类). 在没有二价阳离子[无二价（DVF）；<10nM]的情况下，也使用单价阳离子测量内向整流电流(图3 C类和D类). 阳离子取代实验表明，相对单价电导为Na⁺>K（K）⁺>C类⁺WT TRPML3也获得了类似的结果（数据未显示）。因此，我们得出结论：TRPML3/TRPML3^{弗吉尼亚州}是对钠具有渗透性的非选择性阳离子通道⁺，K⁺，加利福尼亚州²⁺、和镁²⁺在TRPML1中^{弗吉尼亚州}-表达细胞，在等渗Ca中测量到大的向内整流电流²⁺和等渗镁²⁺(图3 E类和F类); 与TRPML3相比^{弗吉尼亚州}，镁²⁺电流大于钙²⁺-介导电流。TRPML1的相对单价电导^{弗吉尼亚州}是：Na⁺≈K⁺>C类⁺(图3 G公司和H（H）).

在单独的窗口中打开

图3。

TRPML1和TRPML3通道的渗透特性。(A类)TRPML3号机组^{弗吉尼亚州}对两种钙都有渗透性²⁺和Mg²⁺电流最初记录在外部溶液中，并由重复电压斜坡（−100至+100 mV，400 ms）引发，斜坡之间间隔4 s。根据时间绘制了−80 mV和+80 mV下的数据。NMDG中未发现明显的内向电流⁺（纳⁺-游离钙²⁺-免费）溶液。将镀液切换为等渗（105 mM）Mg²⁺或Ca²⁺解决方案产生了较小但可测量的电流。二价我_TRPML3-Va型重复电压斜坡后电流没有失活。(B类)全细胞I–V型等渗[Ca存在时的关系²⁺]_o（o）和[Mg²⁺]_o（o）注意正反转电位（大于+60 mV）。(C类)单价渗透率我_TRPML3-Va型无二价（DVF，[Ca²⁺]_我<10 nM）溶液。DVF、Na诱发了较大的内向整流电流⁺-包含和DVF，K⁺-含有溶液，在DVF C中较小⁺解决方案。(D类)代表I–V（I–V）单价钠的关系⁺，K⁺、和C⁺DVF条件下的电流。(E类和F类)我_TRPML1-Va型钙²⁺和镁²⁺渗透。等渗二价溶液引发的电流与电压的依赖性弱于我_TRPML1-Va型在外部溶液中。二价我_TRPML1-Va型电流在较长时间内不会失活。(G公司和H（H）)大型内向整流单价我_TRPML1-Va型DVF条件下。在−80 mV时，Na⁺ 我_TRPML1-Va型DVF溶液中的电流是外溶液中电流的9倍以上。(我)从TRPML3中切除的内向外贴片中的单通道电流^{弗吉尼亚州}-表达HEK293T细胞。含有外部溶液的移液管；浴缸是C⁺-基于内部溶液（147 mM Cs-Mes）。电压阶跃【−140 mV至+80 mV；保持电势（HP）=0 mV】施加于内向外贴片，在负电势下引发通道开口。C和O分别是关闭和打开级别。在负电位下，经常观察到亚状态（S）。(J型)单通道TRPML1^{弗吉尼亚州}电流。(K（K）)TRPML3号机组^{弗吉尼亚州}单通道电导（−140 mV至−20 mV）为49±1 pS(n个= 4). TRPML1公司^{弗吉尼亚州}单通道电导为76±4（−140 mV至−100 mV；n个=5）和11±0.4 pS（−80 mV至−40 mV；n个= 5).

TRPML通道的单通道特性在内部-外部补丁记录中进行了测量。与全细胞电流类似，TRPML3^{弗吉尼亚州}和TRPML1^{弗吉尼亚州}-介导的单通道电流向内整流(图3 I–K型和SI图7). 在负电位下记录到振幅较大的通道开口，而在正电位下没有开口。在极负电位（小于−80 mV）下，两个TRPML1^{弗吉尼亚州}和TRPML3^{弗吉尼亚州}渠道通常是开放的(P（P）_打开> 0.7). 对于TRPML3^{弗吉尼亚州}，在−120 mV下的平均打开和关闭时间分别为282±116和2.1±0.9 ms。对于TRPML1^{弗吉尼亚州}，在−120 mV下的平均打开和关闭时间分别为113±41和6.1±2.6 ms。TRPML3的单通道电导^{弗吉尼亚州}（−140 mV至−20 mV）为49±1 pS。单通道TRPML1^{弗吉尼亚州}电导分别为76±4 pS（−140 mV至−100 mV）和11±0.4 pS（–80 mV至–40 mV）。

TRPML通道被认为主要靶向内涵体或溶酶体(三,14). 酸化的内胚体和溶酶体的一个显著特征是囊内pH值低。此外，以前的报告表明TRPML1对质子具有渗透性(9). 我们在低细胞外pH（类似于通道膀胱内表面的管腔pH暴露）下测量了TRPML通道。因为质子还激活了内源性Cl⁻电导在外表上是很强的整流性(15)，葡萄糖酸盐⁻或网格⁻通常用于替换大部分Cl⁻（[剩余Cl⁻]_o（o）=5–10 mM）。在存在可渗透阳离子（低H“Tyrode’s溶液”）的情况下，pH 4.6被抑制我_TRPML3-Va型增加67±2%(n个= 7) (图4 A类和B类). 当NMDG⁺在pH 4.6下替换了镀液中的所有阳离子，表明TRPML3对质子没有明显的渗透性。与…对比我_TRPML3-Va型,我_TRPML1-Va型被酸（pH 4.6）增强(图4 C类和D类)增加2.9±0.2倍(n个=5），但当NMDG时，再次未观察到明显电流⁺替换了低H镀液中的所有阳离子(图4 C类和D类). 在转染TRPML的对照细胞和未转染的对照细胞中均观察到较小的内向电流（<30 pA）(SI图8). 因此，TRPML1是一个由pH调制的非选择性阳离子通道，其质子不导电。这些结果也与之前的一份报告不一致，该报告中的电流可能被误认为是TRPML2，在该电流中，酸抑制了向外的整流电流(16).

在单独的窗口中打开

图4。

TRPML1和TRPML3的pH依赖性和药理阻断。(A类和B类)TRPML3号机组^{弗吉尼亚州}是一种被低细胞外pH值抑制的质子非渗透性阳离子通道(A类)我_TRPML3-Va型当镀液的pH降至4.6时，在外溶液中被抑制约60%。替换渗透性阳离子（Na⁺/钙²⁺/镁²⁺/K（K）⁺)由NMDG提供⁺pH值为4.6时，消除了大部分内向电流。(B类)外部代表性电流，pH 4.6，低H NMDG⁺和pH 7.4 NMDG⁺解决。NMDG的振幅⁺pH值为7.4（蓝色箭头）和pH值为4.6（红色箭头）时的电流相似。(C类和D类)TRPML1公司^{弗吉尼亚州}是一种不渗透质子的阳离子通道，通过低的细胞外pH而得到强烈增强(C类)我_TRPML1-Va型在外溶液中，酸化至pH 4.6，增加了≈3倍。在NMDG中未发现明显的内向电流⁺溶液（pH 7.4和pH 4.6）。(D类)pH 4.6外部低H NMDG下的代表性全细胞电流⁺和pH 7.4 NMDG⁺解决。注意，NMDG⁺-pH7.4（蓝色箭头）和pH4.6（红色箭头）的激发电流几乎无法区分。(E类)TRPML3中的大内向整流全细胞电流^{弗吉尼亚州}-表达细胞（协议，顶部)在外部溶液中。(F类)维拉帕米（1 mM）抑制并减缓负电位电流的激活。

TRP药理学仍处于初级阶段，几乎没有发现特定的阻滞剂。2APB（200微米）、SKF 96365（50微米）、阿米洛利（100微米）、钌红（10微米）或硝苯地平（100μM）均不抑制TRPML1和TRPML3。然而，在高浓度维拉帕米（1 mM）下，TRPML3激活速度从τ=0.1±0.01 ms减慢了10倍(n个=4，−100 mV）至τ=1±0.1 ms(n个= 4;图4 E类和F类). 观察到类似的影响我_TRPML1-Va型.

TRPML3在melan-a2细胞中天然表达（参见图1H（H）). 为了确定TRPML3突变体在运输或定位方面是否存在差异，我们用N-末端GFP标记的TRPML3转染了melan-a2细胞(图5A类)，TRPML3^{弗吉尼亚州}(图5B类)和TRPML3^{弗吉尼亚州}-KK公司(图5C类). TRPML3存在于广泛的水泡隔室中(图5A类)，而TRPML3^{弗吉尼亚州}细胞内出现局部定位错误(图5B类). 更引人注目的是，大多数TRPML3^{弗吉尼亚州}-转染细胞变圆（80±9%），并被溴化乙锭同型二聚体EthD-1染色（71±22%），表明膜完整性丧失(图5G公司和SI图6). 在转染TRPML3的细胞中，圆形细胞和EthD-1阳性细胞的频率显著降低（分别为19±3%和5±7%(图5G公司和SI图6)表明TRPML3的本构活性^{弗吉尼亚州}是有毒的。

在单独的窗口中打开

图5。

升高[Ca²⁺]_我在TRPML3中^{弗吉尼亚州}-表达细胞与黑素细胞死亡。(A–C)用GFP标记的TRPML3转染Melan-a2细胞(A类和A′)，TRPML3^{弗吉尼亚州}(B类和B′)和TRPML3^{弗吉尼亚州}-KK公司(C类和C′)48小时后进行构建和分析。注意TRPML3在melan-a2细胞中的点状分布(A插图). (B类)TRPML3的圆形形态^{弗吉尼亚州}-表达细胞。(C类和C嵌入)表达TRPML3的细胞^{弗吉尼亚州}-KK突变体的附着和传播；荧光信号不是点状的。(A′——C′)细胞经TO-PRO3核染色。(D–F型)用GFP标记的TRPML3转染Melan-a2细胞(D类)，TRPML3^{弗吉尼亚州}-KK公司(E类)和TRPML3^{弗吉尼亚州}(F类)构念；[加利福尼亚州²⁺]_我在休息20小时后测量[Ca²⁺]_我在TRPML3-和TRPML3中^{弗吉尼亚州}-KK转染细胞与未转染细胞相似。相反，[Ca²⁺]_我TRPML3显著升高^{弗吉尼亚州}-2 mM细胞外[Ca转染细胞²⁺]. 代表性数据来自四到八个实验。(G公司)转染指定构建物（TRPML3为80±9%圆形细胞）后圆形细胞与扩散细胞的定量^{弗吉尼亚州}WT TRPML3为19±3%圆形细胞）。KK突变体的水平与WT相似（TRPML3为19±3%圆形细胞，而TRPML3为22±6%圆形细胞^{弗吉尼亚州}-KK转染细胞；n个=3个实验）。(H（H）)在TRPML3中^{弗吉尼亚州}-转染细胞，2 mM[Ca中的Fura-2比率²⁺]_o（o）当[Ca时（1.4±0.06）下降²⁺]_o（o）减少（标称0 mM Ca²⁺，1mM EGTA；0.99 ± 0.07). [加利福尼亚州²⁺]_我去除细胞外钙后没有显著变化²⁺用于TRPML3和TRPML3^{弗吉尼亚州}-KK转染细胞（0.82+0.01和0.75+0.03）。(我,J型,L（左）、和M（M）). 代表性免疫组化染色，使用酪氨酸酶-(我和L（左）)和TRPML3-(J型和M（M）)6周龄WT石蜡包埋皮肤切片的特异性抗体(I–K型)和弗吉尼亚州/弗吉尼亚州(左旋-右旋)老鼠。(K（K）和N个)切片还通过以下方法进行TRPML3染色就地杂交。抗体染色呈棕色；细胞核染成蓝色。这个就地信号可见为蓝色沉淀物，细胞核染成红色。（比例尺，50μm。）(我)WT毛囊的酪氨酸酶染色表明，黑素细胞主要位于毛囊的球中。(J型)用TRPML3特异性抗体染色表明，TRPML3-阳性细胞定位于成年小鼠毛囊中的类似区域。(K（K）)TRPML3特定就地杂交；TRPML3抗体和就地探针染色毛囊泡中的类似区域。(L（左）和M（M）)使用酪氨酸酶和TRPML3特异性抗体，与WT玻片并排进行免疫组织化学染色。酪氨酸酶和TRPML3特异性信号在弗吉尼亚州/弗吉尼亚州老鼠。在WT皮肤切片中，约26%的毛囊被酪氨酸酶抗体（90/347）或TRPML3特异性抗体（66/255）标记。未检测到酪氨酸酶或TRPML3特异性染色弗吉尼亚州/弗吉尼亚州分析小鼠毛囊鳞茎（≈300个毛囊）。(N个)TRPML3不存在于弗吉尼亚州/弗吉尼亚州蒙皮截面(就地杂交）。

为了确定细胞毒性是否由通道介导的阳离子内流引起，用非功能性TRPML3转染melan-a2细胞^{弗吉尼亚州}-KK孔突变体(图5C类). 尽管与WT表达式相比也定位错误(图5 C类与。A类)与TRPML3相比，死亡细胞的数量显著减少^{弗吉尼亚州}-表达细胞(图5G公司). 组成活性TRPML3的毒性可能是由于持续的阳离子内流穿过质膜或通过晚期内体/溶酶体膜的阳离子平衡造成的。TRPML3和TRPML2^{弗吉尼亚州}-KK转染的melan-a2细胞休息[Ca²⁺]水平与未转染细胞相似(图5 D类和E类)，而TRPML3^{弗吉尼亚州}-表达细胞显示出显著较高的[Ca²⁺]_我(图5F类). 去除细胞外钙²⁺还原[Ca²⁺]_我在TRPML3中^{弗吉尼亚州}-表达细胞，但不在TRPML3和TRPML3中^{弗吉尼亚州}-KK转染细胞。我们得出结论，表达的质膜TRPML3的构成活性^{弗吉尼亚州}诱导钙²⁺过载与细胞死亡(图5H（H）).

WT或弗吉尼亚州用TRPML3抗体或酪氨酸酶对纯合子同窝婴儿进行染色，以标记黑素细胞(10). 在WT皮肤切片中，26%的毛囊含有黑素细胞(图5 我和J型). 毛球中存在TRPML3表达细胞，这进一步通过以下方法得到证实就地杂交(图5K（K）). 相反，在纯合子皮肤切片的毛囊中未检测到黑素细胞弗吉尼亚州鼠标(图5 L（左）和M（M）)毛球也没有被TRPML3特异性标记就地探针(图5N个). 我们得出结论，大多数黑素细胞在6周龄的毛囊中消失弗吉尼亚州老鼠，导致皮毛和皮肤颜色变浅(图1E类).

讨论

TRPML离子通道的主要细胞内定位阻碍了粘蛋白电流的直接研究。60多年前发现的varitint–waddler鼠标为了解TRPML家族的工作提供了一个偶然的窗口。基于过去的工作，S4/S5连接节点的突变改变了通道选通(17). TRPML1和TRPML3的类似突变导致跨质膜的大电导，即使在静息膜电位下也是如此。与大多数TRP离子通道一样，TRPML1和TRPML3是阳离子非选择性和钙离子通道²⁺-渗透剂；无H⁺在本研究中检测到了电导。质膜上的组织活性是一种有害的功能丧失，随着时间的推移会杀死黑色素细胞，从而减少头发和皮肤色素沉着。这些结果与观察到的耳蜗黑素细胞丢失相一致弗吉尼亚州/弗吉尼亚州老鼠(18). 耳蜗和前庭装置中突变的TRPML3导致的细胞丢失可能是耳聋和耳蜗旋转行为的基础弗吉尼亚州/弗吉尼亚州老鼠。低生存能力弗吉尼亚州/弗吉尼亚州小鼠需要进一步研究。还有一个尚未回答的更重要的问题是，TRPML3的主要功能是胞膜上的内体/溶酶体，还是两者兼而有之。有趣的是，一些TRP离子通道似乎在细胞内膜和质膜上都起作用，并且在信号分子的作用下可以发生快速移位(19).

材料和方法

补充材料

致谢

缩写

脚注

工具书类