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细胞生物学杂志。2007年11月19日；179(4): 619–626.
数字对象标识：10.1083/jcb.200708090
预防性维修识别码：项目编号：C2080898
PMID：17998402
报告

全基因组RNAi筛选揭示了caspase激活的多种调节因子

卡罗琳·H·伊,多齐·索加,迈克尔·博伊斯,阿列克谢·德格列夫,达纳·E·克里斯托弗森、和袁均英教授
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补充资料

摘要

细胞凋亡是一种进化上保守的细胞自杀机制，可在各种应激刺激下激活。越来越多的证据表明，凋亡调控依赖于专门的细胞死亡信号通路，并整合来自其他调控电路的各种信号，包括细胞内环境稳定的信号。我们提出了一种全基因组RNA干扰筛选，以系统地识别由DNA损伤诱导的凋亡调控因子黑腹果蝇细胞。我们确定了47个双链RNA，其靶向功能多样的一组基因，包括一些已知具有促进细胞死亡功能的基因。进一步鉴定发现10个影响半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活的基因果蝇属凋亡抑制因子1。此集合包括果蝇属令人惊讶的是，引发剂caspase Dronc和一些代谢调节剂、候选抑癌剂Charlatan和N个-乙酰转移酶，ARD1。重要的是，其中一些基因在调节哺乳动物细胞凋亡方面表现出功能保守性。我们的数据表明，各种细胞过程与caspase依赖性细胞死亡之间存在着以前未被认可的基本联系。

介绍

凋亡是一种进化上保守的细胞死亡途径，调节发育和组织稳态。半胱氨酸蛋白酶是一个半胱氨酸蛋白酶家族，在介导细胞凋亡中起着关键作用。虽然CED-3是细胞程序性死亡所需的唯一半胱天冬酶秀丽隐杆线虫多个半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶介导苍蝇和哺乳动物的凋亡细胞死亡。在这些系统中，上游启动子半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶对促凋亡信号的反应激活导致下游执行子半胱天冬酶的激活。尽管核心凋亡途径已经被广泛研究，但控制细胞凋亡决定的信号网络的许多方面仍然未知。利用全基因组RNAi筛选成功剖析了复杂的生物过程黑腹果蝇细胞。在这项研究中，我们描述了10个基因的分离，包括顶端半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶Dronc，这些基因是在DNA损伤的反应中完全激活半胱氨酸蛋白酶所必需的。令人惊讶的是，我们发现Charlatan（Chn），一种神经元细胞分化的调节因子(Tsuda等人，2006年)和ARD1，以及N个-乙酰转移酶参与细胞命运规范(怀特韦和绍斯塔克，1985年)，调节caspase激活。重要的是，我们发现某些苍蝇基因在哺乳动物系统中作为半胱天冬酶激活的调节剂是功能保守的。我们的筛查表明Chn和ARD1是细胞分化和凋亡之间的分子联系。

结果和讨论

为了确定RNAi方法在识别凋亡调节因子方面的可行性，我们测试了Dcp-1（一种功能类似于哺乳动物caspase-3的下游效应caspase）的敲除是否能够保护细胞免受DNA损伤诱导的凋亡果蝇属胚胎血细胞Kc细胞(Song等人，2000年). 我们使用拓扑异构酶II抑制剂阿霉素（dox）诱导剂量依赖性细胞死亡（图S1 a，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200708090/DC1)可通过z-VAD.fmk处理进行抑制（图S1 B）。正如预期，dcp-1型RNAi部分保护细胞免受dox诱导的凋亡（图S1 C），这与之前的观察结果一致(Xu等人，2006年). 我们的结论是，dox诱导Kc细胞中caspase依赖性细胞死亡，这种死亡可以被特定的双链RNA（dsRNA）抑制，因此，它代表了一个识别凋亡调节剂的合适系统。

一组不同的dsRNAs保护苍蝇细胞免受dox诱导的凋亡

为了鉴定抑制Kc细胞DNA损伤诱导凋亡的dsRNA，我们使用已建立的全基因组进行了高通量筛选果蝇属靶向19470个基因的RNAi库(Boutros等人，2004年). 81个dsRNAs导致z得分>2，这是我们在主屏幕上定义点击的阈值(图1 A). 为了消除直接增强细胞ATP水平的dsRNA，在重新筛选中测量了dsRNA对ATP水平的影响。我们验证了62个dsRNAs特异性保护细胞免受dox诱导的凋亡(图1 B). 为了最小化非靶点效应，我们进一步检测了与非靶点基因具有至少19-核苷酸序列一致性的dsRNA(Echeverri等人，2006年;Ma等人，2006年)通过测试不同于原始靶序列的替代dsRNAs，以防止dox治疗引起的细胞死亡（图S2 A，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200708090/DC1)以及由果蝇属凋亡抑制因子1(尿布1)RNAi治疗如所述图3（图S2 B）。在这两种检测中，任何一种特定基因的dsRNA都不能提供显著保护（P<0.05），因此最终得到47个基因(图1 B和表S1）。

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对DNA损伤诱导的细胞凋亡提供保护的dsRNA的鉴定和确认。（A） 在重复平板中筛选dsRNAs，以防止dox治疗。两块板（蓝色虚线上方）的命中阈值设置为z分数至少为2。该图代表了对多个富集了以下所示基因的平板的z分数分析表一（红色钻石）。（B） 对初级筛选中鉴定的dsRNA进行了单独测试，并显示了在至少两个独立实验中对dox提供统计学显著保护的dsRNA（P<0.05；t吨测试）。该图表示一个由10个样本板组成的池，误差条表示一式三份测试的dsRNA的标准偏差。（C） 该图根据FlyBase（版本FB2006_01）提供的信息描述了B中所示基因的功能分布。

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一组对Diap1上位并对caspase激活至关重要的基因。（A） 如图所示，用dsRNAs转染Kc细胞，然后用RNAi转染尿布1此图代表了三个独立的实验。（B） 测试dsRNAs对由Diap1缺失引起的细胞死亡的保护作用。选择的dsRNAs提供了统计上显著的保护尿布1显示了至少两个独立实验中的RNAi。此图表示由三个样本板组成的池。（C） 测试dsRNAs抑制由Diap1缺失诱导的caspase激活。请注意，与RNAi相比，10/12 dsRNAs对caspase激活的抑制具有统计学意义尿布1只有。该图代表了三个独立的实验。误差条表示一式三份测试的dsRNAs的SD。*，P<0.05；t吨测试。

三种已知的细胞死亡调节因子的鉴定证实了我们的筛选能够揭示促进凋亡所需的基因。Dronc的静音可最大限度地防止dox治疗(图1 B)这与它作为苍蝇细胞凋亡的主要检查点的作用是一致的(Chew等人，2004年;Daish等人，2004年). 此外，蜕皮激素诱导蛋白Eip63F-1的敲除提供了对抗DNA损伤的第四大保护。Eip63F的表达增加在果蝇属蜕皮激素介导的大量自噬细胞死亡前的幼虫(Gorski等人，2003年;Rusten等人，2004年). 最后，我们的屏幕隔离了Jra果蝇属已知促凋亡哺乳动物转录因子c-Jun的同源序列，作为DNA损伤诱导凋亡的介质(Verheij等人，1996年).

在RNAi筛选中鉴定的大约85%的基因是具有已知功能的特征基因或含有保守的功能结构域，这些功能结构域调节广泛的细胞过程，包括信号传导、代谢和转录，而其余15%的基因没有已知的功能结构域(图1 C). 总之，我们的RNAi筛查牵涉到细胞死亡基因（三个）、信号分子（13个）、代谢调节因子（10个）、代谢物转运因子（四个）、参与ER/高尔基体转运的基因（四个，以及介导DNA损伤诱导凋亡的未知功能基因（7个）（表S1）。引人注目的是，20%的基因直接参与细胞代谢过程(图1 C)支持早期的一项建议，即细胞代谢状态严重影响诱导凋亡的阈值(Hammerman等人，2004年). 为了研究这些基因在凋亡途径中的作用，我们在苍蝇和哺乳动物细胞中进行了特异性的酶促和上位性测定。

caspase依赖性细胞死亡相关基因的鉴定

接下来，我们对与caspase依赖性细胞死亡相关的基因进行了分类。我们观察到，在dox治疗8小时后，在可检测到的细胞死亡之前，caspase活性显著诱导（图S1、A和D）。任何抑制这种活性的RNAi都暗示目标基因参与caspase激活的早期调节。除了dcp-1型RNAi，击倒美国国防部长办公室和jra公司在dox存在的情况下显著抑制caspase-3/7样活性（P<0.05），而阴性对照，即针对钙依赖性半胱氨酸蛋白酶calpain A的RNAi，不影响该途径(图2 A). 我们将此分析扩展到初始RNAi筛选中确定的所有基因，并发现20个dsRNAs抑制DNA损伤诱导的caspase激活（表S1）。有趣的是，如所示图2 B，其中12个基因被发现对尿布1，如下一节所述。

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执行器半胱天冬酶上游功能基因的分类。（A） 用dsRNAs转染Kc细胞，并用dox处理诱导caspase活化。这个图表代表了三个独立的实验。RLU，相对光单位。（B） 测试dsRNAs对dox处理诱导的caspase活性的抑制。在至少两个独立的实验中，所选dsRNAs对caspase活性的抑制具有统计学意义（*，P<0.05；t吨测试）。此图显示了一个由六个样本板组成的池。误差条代表测试的dsRNAs的SD，一式三份。

DIAP1上位性基因的鉴定

接下来，我们表演了尿布1上位性分析进一步对基因进行分类。DIAP1是哺乳动物凋亡蛋白抑制剂的直系同源物，是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的直接抑制剂，缺乏DIAP1会导致体内半胱氨酸蛋白酶的快速激活和凋亡(Wang等人，1999年). 因此，DIAP1缺失诱导的凋亡是一种独立于DNA损伤的替代性凋亡检测方法。沉默调控核心凋亡机制激活的基因可能对DNA损伤和DIAP1缺失诱导的凋亡提供保护。RNAi对抗dcp-1型部分抑制Kc细胞中DIAP1缺失诱导的细胞死亡(图3 A). 也，美国国防部长办公室如前所述，RNAi能有效保护细胞免受DIAP1缺陷诱导的凋亡(Meier等人，2000年;Chai等人，2003年). 总的来说，从我们的初步筛选中确认的32个基因对DIAP1沉默诱导的细胞死亡提供了显著的保护（P<0.05）（表S1和图3 B).

有趣的是，12个dsRNAs在dox治疗后抑制caspase-3/7样活性，并保护其免受尿布1RNAi，表明这些基因是多重刺激诱导细胞凋亡所必需的(表一). 为了证实这些基因对caspase的完全激活是必要的，我们确定这些dsRNAs是否可以抑制由尿布1RNAi。我们观察到caspase活性的最大诱导尿布124小时后RNAi，这种作用被dsRNA完全抑制dcp-1型（图S1 E）。重要的是，与尿布1仅RNAi(图3 C).

表一。

RNAi筛选中确定的调控caspase激活的基因摘要
基因ID基因名称已知哺乳动物
直系亲属		基因本体论功能类
CG8090型德龙（Nc）半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶顶半胱天冬酶细胞死亡
CG5410号dMiro公司米罗线粒体GTPase信号
CG11989号dARD1型hARD1型蛋白质乙酰转移酶信号
CG14740号不适用铯柠檬酸合成酶新陈代谢
CG31674型不适用玻璃钢HPR乙醛酸还原酶新陈代谢
CG12170型不适用OXSM公司脂肪酸生物合成新陈代谢
CG10725号不适用不适用多糖代谢新陈代谢
CG9258型nrv1号机组附件1b1纳+/K（K）+ATP酶运输工具
CG8029标准不适用不适用质子偶联ATP合成酶运输工具
CG7438号肌31DFMyo1D公司1型肌球蛋白运输工具
CG11798型Charlatan（中国）NRSF/休息转录抑制因子转录
CG6712号不适用RPF1级核糖体RNA加工RNA加工

不适用。

除了美国国防部长办公室RNAi，dsRNAs靶向中国和dARD1型对自发caspase活性的抑制最强。与我们观察到的RNAi对抗中国哺乳动物直系神经限制性沉默因子（NRSF）/RE1-沉默转录因子（REST）最近被确定为上皮细胞中的候选肿瘤抑制因子(Westbrook等人，2005年). 先前的工作表明，Chn和NRSF/REST作为神经特异性基因的转录阻遏物发挥作用(Chong等人，1995年;Schoenherr和Anderson，1995年;Tsuda等人，2006年)，表明细胞分化可能使细胞对胱天蛋白酶激活和凋亡具有难治性。此外，我们还鉴定了几个代谢基因，CG31674、CG14740和CG12170，它们可能参与半胱氨酸天冬氨酸酶激活的一般调节。最近，Nutt等人（2005）证明由戊糖磷酸途径产生的NADPH调节缺乏营养的caspase-2的激活非洲爪蟾卵母细胞。结合我们的结果，这些观察进一步证明了代谢调节和诱导凋亡之间的密切联系。

新型细胞凋亡调控因子的进化保守性

为了进一步探讨我们的发现的意义，我们研究了沉默从RNAi筛选中鉴定出的苍蝇基因的哺乳动物同源基因是否能够保护哺乳动物细胞免受dox诱导的细胞死亡。我们选择了一组被认为是非冗余的哺乳动物直系亲属。该列表包括dMiro的同源基因，其功能类似Rho的GTPase；dARD1，其功能是N个-乙酰转移酶；CG12170，作为脂肪酸合成酶发挥作用；和Chn，其功能为转录阻遏物（分别为RHOT1、hARD1、OXSM和REST；FlyBase）。此外，我们测试了Polo的哺乳动物同源基因Plk3作为dsRNA靶向马球有效防止dox治疗(图1).

我们评估了靶向感兴趣基因的siRNAs保护HeLa细胞免受DNA损伤的能力。作为阳性对照，细胞被转染以Bax或Bak为靶点的siRNAs，Bax和Bak是哺乳动物细胞死亡的两个中央调节器(Wei等人，2001年;Zong等人，2001年). 事实上，Bax或Bak的沉默对dox诱导的细胞死亡具有显著的保护作用（P<0.05）(图4 A). 我们观察到，plk3 RNAi对dox治疗提供了部分保护，这与之前关于plk3参与应激诱导凋亡的研究一致(谢等人，2001a,b条;Bahassi等人，2002年). 有趣的是，hARD1的敲除显著提高了细胞在dox存在下的存活率，使其达到与Bak类似的水平。这种保护作用在形态学水平上也很明显。在转染非靶向对照siRNA的细胞中，dox处理导致典型的凋亡形态，包括细胞圆形和膜泡状(图4 B). 相反，转染抗hARD1 siRNAs的细胞保持正常健康的形态，并在dox存在下继续增殖。

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hARD1是在哺乳动物细胞中激活半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶以应对DNA损伤所必需的。（A） 如图所示，HeLa细胞转染有四个siRNAs池，然后用1.25μg/ml dox处理20小时。该图代表了三个独立实验。（B） 按照指示用siRNA转染HeLa细胞，并用1.25μg/ml dox处理，然后孵育12小时。细胞通过明场显微镜进行可视化，并显示三份测试样品的代表性图像。（C） 如图所示，用siRNAs转染HeLa细胞，并用5μg/ml dox处理8 h。该图代表了三个独立实验。（D） 如图所示，用靶向hARD1的一组siRNA或单个siRNA转染HeLa细胞，并用1.25μg/ml dox处理20 h。该图代表了三个独立实验。（E） 如图所示，用siRNA转染HeLa细胞，并用5μg/ml dox处理8 h。注意，与非靶向siRNA相比，抗hARD1的RNAi完全抑制了caspase-2、caspase-9和caspase-3的裂解（箭头所示）。这个实验是两个独立实验的代表。（F） 用所示的siRNAs转染HeLa细胞，并用5μg/ml dox处理8 h。星号代表所示抗体识别的非特异性带。这个实验是两个独立实验的代表。（A、C和D）*，P<0.05；t吨测试。误差条代表SD。

为了研究靶向hARD1和plk3的siRNAs提供的保护是否与抑制caspase激活有关，我们测量了用dox处理的这些细胞中的caspase活性。针对plk3的RNAi提供了caspase活性的部分抑制，再次支持了在图4 A有趣的是，在dox存在的情况下，REST的耗竭导致caspase活性受到一些抑制，尽管对细胞死亡的保护在统计学上并不显著(图4C). 与我们的活性测定一致，在转染hARD1 siRNA的细胞中观察到caspase-3/7活性的完全抑制(图4C). 这些结果表明，hARD1是由DNA损伤诱导的胱天蛋白酶依赖性细胞死亡所必需的。此外，我们观察到，所有四个靶向hARD1的siRNA都能够单独提供强大的细胞死亡保护，这强烈表明这些siRNA特异性地靶向hRAD1(图4 D).

由于hARD1的沉默显著抑制了下游半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的激活，我们检测了上游半胱氨酸蛋白酶对dox治疗的反应是否也受到干扰。值得注意的是，hARD1 RNAi抑制了用dox处理的细胞中caspase-2和-9的裂解，而在对照细胞中很容易检测到caspase的裂解(图4 E). 因此，我们认为hARD1在DNA损伤反应本身或上游半胱天冬酶的激活中调节信号转导途径的顶端至凋亡机制。

与caspase-3/7分析结果一致(图4C)hARD1的沉默完全抑制了dox诱导的活化caspase-3的出现(图4 E). 我们将此实验用于hARD1互补实验，以证明hARD1在DNA损伤反应中的促凋亡作用。我们使用了一个新的siRNA库，靶向hARD1（5′si）的5′非翻译区，该区抑制了dox处理诱导的caspase-3裂解(图4 F). 此外，我们在重组hARD1敲除细胞中观察到caspase-3裂解。由于六分之六的抗hARD1的siRNAs对DNA损伤诱导的凋亡和hARD1-致敏细胞对caspase激活的补充提供了强有力的保护，因此我们得出结论，ARD1在dox诱导的凋亡中的功能作用从进化上是保守的果蝇属哺乳动物。

与我们的结果相反，Arnesen等人（2006年）据报道，hARD1是维持细胞存活所必需的。这种差异的一个可能解释是，本研究中使用的siRNA与Arnesen等人使用的siRNAs之间存在固有差异Arnesen等人（2006年）研究结果表明，在没有应激信号的情况下，细胞存活率降低，而测试的siRNAs均未对细胞存活率产生负面影响（图S2 D）。

总之，我们在果蝇属细胞识别参与促进DNA损伤的基因-诱导凋亡。我们分离出47个抑制dox诱导的细胞死亡的dsRNA。这些基因编码已知的凋亡调节因子，例如Dronc果蝇属已知促凋亡转录因子c-Jun和蜕皮激素调节蛋白Eip63F-1的同源性，从而验证了我们的初步筛查。此外，我们的研究还牵涉到一大类以前未被怀疑在调节caspase激活和凋亡中起作用的代谢基因，例如参与脂肪酸生物合成（CG11798）、氨基酸/碳水化合物代谢（CG31674）、柠檬酸代谢（CG14740）、复杂碳水化合物代谢（CP10725）、，和核糖体生物合成（CG6712）。这些结果支持了早期的建议(Hammerman等人，2004年;Nutt等人，2005年)细胞代谢状态调节细胞凋亡激活的阈值，从而在细胞的生存或死亡决策中发挥关键作用。

特别令人感兴趣的是ARD1的识别。我们提供的证据表明，抗ARD1的RNAi可保护细胞免受死亡，并可抑制由飞行细胞和HeLa细胞DNA损伤诱导的caspase激活。此外，dARD1缺陷使苍蝇细胞对自发caspase活性产生抵抗，并导致与Diap1缺失相关的细胞死亡。重要的是，我们提供了大量证据表明，在哺乳动物细胞DNA损伤的情况下，hARD1是caspase激活所必需的。在经dox处理的hARD1 RNAi细胞中，启动子和执行子半胱天冬酶的裂解受到抑制，这表明hART1在半胱氨酸天冬酶激活的上游发挥作用，而hARD1-敲除细胞的互补性恢复了半胱蛋白酶-3的裂解。这些数据表明，ARD1对于苍蝇和哺乳动物的DNA损伤诱导的细胞凋亡是必要的。

ARD1在具有N个-乙酰转移酶催化N的乙酰化α-新合成多肽的末端残基，与异染色质的调节、DNA修复和酵母基因组稳定性的维持有关(Mullen等人，1989年;Aparicio等人，1991年;Ouspenski等人，1999年;威尔逊，2002;Bilton等人，2006年). 这些研究表明，ARD1可能参与调节DNA损伤反应的早期步骤。我们预计，未来的研究将侧重于确定ARD1是否在哺乳动物的类似过程中发挥作用。我们的筛查中发现的基因多样性说明了生存和死亡信号通过多种途径的复杂细胞整合。

材料和方法

组织培养

果蝇属Kc公司167细胞保存在施耐德的果蝇属含有10%FBS的培养基，含有青霉素和链霉素（Invitrogen）。HeLa细胞在含有10%新生小牛血清的DME中，在青霉素和链霉素（Invitrogen）的存在下保存，并传代不超过6周。

RNAi筛选

果蝇属Kc细胞（105/384孔板中的孔）转染预液化dsRNAs（0.5μg/孔），然后进行48小时的培养以允许蛋白质周转。随后，用5μg/ml dox（Sigma-Aldrich）对细胞进行额外的48小时培养。通过测量细胞ATP水平测定细胞活力（CellTiter-Glo发光细胞活力测定；Promega）。该屏幕的阳性点击被定义为dsRNAs使细胞ATP水平增加至少两个单位SD，高于平板的平均水平，z值为两倍。

重新筛选

使用新合成的dsRNA对这些命中进行确认。使用为RNAi优化设计的引物从苍蝇基因组DNA中扩增cDNA（序列由N.Ramadan提供，果蝇属哈佛医学院RNAi筛查中心，马萨诸塞州波士顿）。dsRNA合成是根据制造商推荐的方案（MEGAscript；Ambion）进行的。Kc细胞（2×105/用dsRNAs（1μg/孔）转染，然后用dox处理。每一dsRNA都进行了三次测试，并且至少进行了两次独立的实验。细胞存活率是在dox存在下用特定dsRNA处理的细胞与仅用dsRNA处理过的对照细胞的ATP水平之间的比率。通过比较在dox存在下用RNAi处理的细胞的存活率和单独用dox处理的细胞存活率，确定对dox诱导的细胞死亡具有统计学意义的保护（P<0.05）。对dox的折叠保护被确定为在存在dox的情况下用dsRNA转染的细胞和仅用dox处理的细胞的平均细胞活力之间的比率。

半胱氨酸天冬氨酸酶活化分析

将Kc细胞转染到96个平板中，转染62个dsRNA，这些dsRNA在初筛中得到确认，然后用dox处理8小时，以诱导caspase激活。每一dsRNA都进行了三次测试，并且至少进行了两次独立的实验。使用荧光素标记的DEVD肽底物（Caspase-Glo 3/7分析；Promega）定量Caspase-3/7样活性。折叠caspase-3/7样活性是指在dox存在下转染dsRNA的细胞与仅经dox处理的细胞的平均caspase-3/4样活性之比。

DIAP1上位性研究

将Kc细胞转染到96个靶向62个基因的dsRNAs平板中，这些基因在初始筛选中得到确认。培养24小时后，这些细胞被转染1μg尿布1当细胞活力被量化时，dsRNA用于额外48小时的培养（如重新筛选部分所述）。折叠保护尿布1RNAi被确定为转染有指定dsRNA的细胞的平均细胞存活率与尿布1RNAi与转染细胞的平均细胞活力尿布1仅限RNAi。对于半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶激活试验，Kc细胞转染dsRNA，然后转染dsRNA-尿布1以及额外的24小时培养。

哺乳动物RNAi研究

瞬时转染低通量HeLa细胞（5×105/除非另有说明（50 nM；预先设计的ON-TARGETplus siRNAs；Dharmacon），使用HiPerFect转染试剂（QIAGEN）。培养48小时后，用dox处理细胞（浓度和培养时间如图所示）。在每个独立实验中，对siRNA进行三次测试。如KC细胞所述，对细胞活力和caspase-3/7活性进行量化。图像是使用亮场显微镜获得的。

为了检测caspase裂解，HeLa细胞被转染siRNAs（1.5×105/然后用dox治疗。细胞直接在SDS样品缓冲液中溶解并进行SDS-PAGE分析。使用以下抗体通过免疫印迹检测胱天蛋白酶：胱天蛋白酶-9（研发系统）、胱天蛋白酶-2（Alexis）、胱天蛋白酶-3（细胞信号技术）和裂解的胱天蛋白酶-3（细胞信号技术）。hARD1是使用兔多克隆抗体检测的（由法国尼斯国立科学研究中心尼斯大学M.C.Brahimi-Horn提供）。

在hARD1重建实验中，HeLa细胞在六孔板中转染两个siRNA池，靶向hARD15′非翻译区（序列CUGACUGCCUUCACGAUU和GCUGACUGCUCUCGAUU；Dharmacon），然后培养24小时。随后瞬时转染C末端标记的hARD1-myc公司/他使用TransIT-LT1转染试剂（Mirus）和额外的24小时培养。在dox处理后，用Western blotting对细胞进行裂解和分析。

显微镜

使用显微镜（Eclipse TE300；Nikon）、10×Ph L物镜和相机（ORCA-ER；哈马松）在室温下获得HeLa细胞的图像。使用Openlab 3.1.7采集软件（Improvision）对图像进行分析。

在线补充材料

图S1显示了dox诱导的细胞死亡的特征和RNAi筛选的控制。图S2显示了dsRNAs的半定量分析，以验证RNAi库。表S1提供了在主要筛查中确定的基因的综合列表。在线补充材料可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200708090/DC1.

补充材料

【补充材料索引】

致谢

我们感谢Norbert Perrimon和果蝇属RNAi筛查中心征求意见。M.C.Brahimi-Horn博士提供了hARD1抗体和hARD1-myc公司/他的表达载体。我们感谢安德鲁·斯蒂尔（Andrew Steele）和凡妮莎·朗纳（Vanessa Runner）对手稿的批判性阅读，并感谢袁实验室的评论。

这项工作的部分支持来自美国陆军乳腺癌研究计划的创新者奖（授予DAMD17-02-1-0403），这是美国国家老龄研究所（R37-012859）向国家科学基金会授予D.K.Sogah的研究生奖学金J.Yuan，以及国家神经疾病和中风研究所授予C.H.Yi的Kirchstein国家研究服务奖（1F31NS057872-01）。

笔记

C.H.Yi和D.K.Sogah为本文做出了同等贡献。

本文中使用的缩写：Chn，Charlatan；直径1，果蝇属凋亡抑制因子1；阿霉素；双链RNA；NRSF，神经元限制性消声器因子；REST，RE1-沉默转录因子。

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来自的文章细胞生物学杂志由以下人员提供洛克菲勒大学出版社