成纤维细胞生长因子（FGFs）2包含22个分子的结构相关家族。根据其序列相似性和功能特性，FGF可分为七个亚家族(1–三). FGF结合四个高亲和力、配体依赖的FGF受体酪氨酸激酶分子（FGFR1-4）。在硫酸乙酰肝素（HS）糖胺聚糖存在下，FGF稳定结合FGFRs并导致形成2:2:2 FGF-FGFR-HS二聚体，使细胞质激酶结构域相互转磷酸化并被激活(4). FGFR的激活导致各种信号转导级联的刺激，这些级联与脊椎动物和无脊椎动物胚胎发育、肿瘤生长、血管生成、伤口愈合和生理学的多个方面有关(2,5–7).
每个FGFR包含一个细胞外配体结合域、一个跨膜域和一个细胞内酪氨酸激酶域。FGFR的细胞外配体结合域包含两个或三个Ig样结构域(8,9). 利用两个独特外显子之一的选择性RNA剪接导致FGFRs 1-3中两个不同版本的Ig样结构域III（称为结构域IIIb和IIIc）。这种选择性剪接是配体结合特异性的重要决定因素(10–14). IIIa（“a”）剪接形式编码一种分泌的细胞外FGF结合蛋白，没有已知的信号传递能力(13). IIIb（“b”）和IIIc（“c”）剪接形式以组织特异的方式进行调节，使得b亚型仅限于上皮谱系，c亚型优先表达于间充质谱系(15–18). 这种组织特异性对FGFR2的功能特别重要。FGFR2的Ig样结构域III中这种主要的选择性剪接调控FGF结合特异性的结构基础已经被阐明(14). 除了组织特异性FGF和FGFR表达外，FGFR激活还受到肝素、硫酸乙酰肝素或其他糖胺聚糖链的调节(19–23). 重要的是，糖胺聚糖结构的组织特异性改变提供了调节FGF信号的机制(24–27). 最近有人推测，FGF信号中的HS选择性是在2:2 FGF-FGFR二聚体的背景下实现的，而不是通过FGF、FGFR甚至1:1 FGF-FGFR-对实现的(28).
FGF-FGFR结合特异性的鉴定对于理解正常发育和发病机制的生物学机制至关重要。这里我们扩展了我们之前的研究(12)半定量比较FGF家族所有信号分子在所有FGFRs的主要剪接形式上的活性。
实验程序
材料
人重组FGF1、FGF7、FGF8、FGF9、FGF10、FGF16、FGF17、FGF18和FGF20来自PeproTech Inc.（新泽西州洛基希尔）。重组人FGF12、FGF14、FGF19、FGF21和FGF23在大肠杆菌并按照前面所述进行纯化(29–31). FGFR cDNA、FGFR表达质粒和FGFR-expressing BaF3细胞系的来源如前所述(12).
BaF3细胞培养和有丝分裂检测
表达特异性FGFRs的BaF3细胞如前所述(12). 细胞保存在补充有10%新生牛血清（Sigma）、0.5 ng/ml小鼠重组白细胞介素-3（Pepro-Tech Inc.）、2 mM L-谷氨酰胺、青霉素-链霉素、50 nMβ-巯基乙醇（BaF3培养基）和G418（600μg/ml）。
对于有丝分裂分析，在含有不同浓度FGF和肝素的BaF3分析培养基中，以30000个细胞/孔的密度将FGFR-expressing BaF3细胞放置在96 well分析板中。将在分析培养基稀释的FGF添加到每个孔中，总体积为200μl/井。然后将细胞培养36–48小时。通过添加1来测定有丝分裂活性μ第Ci页，共页[三H] 胸腺嘧啶50μ1份BaF3分析培养基输送至各井。通过玻璃纤维纸过滤，在4-6小时后收集细胞。公司[三H] 胸苷在瓦拉克上计数β平板闪烁计数器（PerkinElmer Life Sciences）。
FGF22条件培养基的制备
通过逆转录-PCR（正向引物，5′-AATTGCATGCGCAGCCTCTGTGTG-3′；反向引物，5'-AGGCCTCGAGAGAGAGACCAGCG-3′）从小鼠脑mRNA中分离到一个编码小鼠FGF22全长蛋白的cDNA(32). PCR产物（~500 bp）插入APtag5载体（GenHunter Inc.）的NheI-XhoI位点，替换信号序列和碱性磷酸酶序列。将APtag5-mFGF22或APtag5空载体转染到幼仓鼠肾脏（BHK）细胞中（在含有10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺和青霉素/链霉素的Dulbecco改良Eagle's培养基中培养）。转染前一天，将细胞以80-90%的融合率重新接种到90mm的培养皿中，然后用24μg质粒和60μl Lipofectamine 2000于1.5 ml Opti-MEM（Invitrogen）培养基中，按照制造商的说明。48小时后，将细胞以1:20的比例分裂到含有10%胎牛血清、2 mM L-谷氨酰胺、青霉素/链霉素和500μg/ml Zeocin（Invitrogen）。在10–14天后挑选分离的菌落，并在相同的培养基中繁殖。用逆转录-PCR（正向引物5′-GCTCTATGTGGCGATGAATCGCA-3′；反向引物5’-AGACCAACTGGCAGAGATGT-3′）鉴定稳定的克隆细胞系，表达高水平的Aptag5-FGF22（参见).
FGFs 7、10和22激活受体A类FGF22在表达质粒APtag5-FGF22（BHK/ATag5-FGF22）或空载体APtag5（BHK/A Tag5）稳定转染的BHK细胞中表达。选择单个抗Zeocin克隆并通过逆转录-PCR筛选Fgf22表达。车道1，野生型BHK细胞不表达FGF22；车道2，转染APtag5质粒的BHK细胞不表达FGF22；车道3，转染APtag5-FGF22的BHK细胞表达高水平的FGF22。B类c剪接FGFRs的BaF3细胞有丝分裂分析。C类b剪接FGFRs和FGFR4Δ的BaF3细胞有丝分裂测定。厘米，条件培养基。
将在选择培养基中生长的亚流稳定转染细胞系用磷酸盐缓冲盐水冲洗两次，并允许其在含有2μ收集来自对照APtag-5细胞和Aptag5-FGF22细胞的条件培养基，离心去除碎片，并用于随后的BaF3分析。
数据分析
FGF1被用作阳性对照，以使其他FGF的有丝分裂活性正常化。为了减少相对有丝分裂活性比较中的采样误差，每个配体的有丝分裂活动在两种不同浓度（312和1250 pM）下平均（参见)并标准化为在这些浓度下FGF1的活性，或者在FGF19的情况下，-21，-23至5nM FGF1。
表1
| 纤维细胞生长因子受体 | 相对有丝分裂活性±S.D。
|
|---|
| FGF-1型 | FGF7亚家族
| FGF8亚家族
| FGF9亚家族
| FGF19亚家族（×10三)
|
|---|
| FGF7公司 | FGF10公司 | FGF22号机组 | FGF8公司 | 17号楼 | 2018财年末 | FGF9公司 | 16号楼 | FGF20型 | 19楼 | FGF21号机组 | FGF23型 |
|---|
| 1c个 | 100 ± 5 | 14.2 ± 4.1 | 12.5 ± 2.5 | 10.2 ± 1.7 | 57.5 ± 3.2 | 22.7 ± 0.3 | 4.7 ± 0.4 | 12.5 ± 1.4 | 4.3 ± 0.3 | 28.1 ± 4.0 | 123 ± 5.7 | 34 ± 3.0 | 23 ± 2.7 |
| 2厘米 | 100 ± 3 | 10.4 ± 4.0 | 6.1 ± 1.7 | 7.1 ± 1.1 | 91.6 ± 8.9 | 27.1 ± 9.5 | 28.9 ± 4.7 | 57.2 ± 5.4 | 32.5 ± 3.5 | 68.4 ± 2.8 | 238 ± 11.5 | 86 ± 4.7 | 89 ± 10.5 |
| 3厘米 | 100 ± 6 | 3.3 ± 1.4 | 0.8 ± 0.9 | 1.0 ± 0.5 | 209 ± 6 | 111 ± 5 | 77.7 ± 3.4 | 90.4 ± 6.0 | 32.4 ± 6.8 | 89.5 ± 7.3 | 140 ± 11.1 | 23 ± 02.3 | 43 ± 5.5 |
| 1亿 | 100 ± 4 | 8.0 ± 1.5 | 39.4 ± 1.3 | 40.3 ± 1.6 | 5.3 ± 0.4 | 6.0 ± 2.2 | 6.3 ± 1.1 | 7.3 ± 1.0 | 6.5 ± 1.1 | 7.3 ± 0.9 | 12 ± 0.5 | 19 ± 3.4 | 11 ± 2.4 |
| 第2页 | 100 ± 5 | 168 ± 6 | 217 ± 1 | 232 ± 3 | 5.9 ± 1.4 | 6.3 ± 0.6 | 7.8 ± 1.8 | 2.9 ± 0.4 | 1.8 ± 0.5 | 12.3 ± 0.7 | 61 ± 6.9 | 83 ± 5.4 | 66 ± 2.7 |
| 3亿 | 100 ± 4 | 6.7 ± 1.8 | 6.0 ± 0.5 | 5.3 ± 0.7 | 18.6 ± 6.3 | 10.7 ± 2.7 | 12.5 ± 2.0 | 42.7 ± 2.9 | 13 ± 2.6 | 44.3 ± 1.5 | 20 ± 1.7 | 26 ± 1.5 | 21 ± 0.8 |
| 4Δ | 100 ± 4 | 17.8 ± 0.5 | 11.5 ± 0.5 | 12.5 ± 0.9 | 102 ± 0.4 | 85.5 ± 1.1 | 52.8 ± 1.7 | 10.1 ± 0.1 | 9.9 ± 0.3 | 26.6 ± 0.9 | 410 ± 27.7 | 128 ± 9.6 | 222 ± 11.9 |
结果
FGF亚家族的受体结合特异性
小鼠前B细胞系BaF3是一种白细胞介素3依赖性细胞系，通常用于分析受体酪氨酸激酶活性。野生型BaF3细胞不表达FGFRs，当用FGF和肝素刺激时，转染FGFRs的BaF3在没有白细胞介素-3的情况下增殖(19). FGFs 1–9的受体结合特异性先前已有描述(12). 为了直接比较包含新描述成员的FGF亚家族的活性，使用每种FGF在20至5000 pM（FGF 1、7–10、16–18和20）和3至800 nM（FGFs 19、21和23）的浓度范围内对所有七种FGFR-表达BaF3细胞系进行分析。
FGFs 7、10和22在序列上彼此之间的关系比任何其他FGF更密切，并且据预测对FGFRs具有类似的活性。我们和其他人未能生产出活性重组FGF22蛋白。因此，我们开发了一种将FGF22分泌到培养基中的细胞系(). 在FGFR2b-BaF3细胞上测定条件培养液的稀释度。FGF22条件培养基的浓度估计相当于FGF10浓度300–600 pM。对照条件培养基对任何BaF3细胞系均无活性。FGFs 7、10和22均强烈激活FGFR2b。FGF 10和22对FGFR1b表现出较弱的活性，并且这三种FGF都不能激活任何其他表达FGFR的细胞系(;; 和).
显示按亚家族分组的FGF相对活性的图表*，来自Ornitz的数据等。(12); #, 未测试。
FGFs 8、17和18亚家族成员表现出与之前描述的相似的活动(33,34). 这些FGF特异性激活FGFRs 1c、2c和3c以及FGFR4的两种Ig样结构域形式（4Δ）。FGF8亚家族成员对FGFR3c细胞的相对活性较高，而对FGFR1c细胞的活性较低。在表达FGFRb同种型的细胞系上未观察到活性(和和).
FGFs 8、-17和-18激活受体A类c剪接FGFRs的BaF3细胞有丝分裂分析。B类b剪接FGFRs和FGFR4Δ的BaF3细胞有丝分裂测定。
FGF9、16和20个亚家族成员的特征与FGF9相似(12,35). 这些FGF以高活性激活FGFRc亚型和FGFR4，与其他优先激活c剪接形式受体的FGF不同，这些FGF始终表现出对FGFR3b表达细胞的活性。FGF20对FGFR2b细胞有轻微活性，对FGFR1b细胞无活性。FGFs 9和16对FGFR1b或-2b没有活性(和和).
FGFs 9、16和20激活受体A类c剪接FGFRs的BaF3细胞有丝分裂分析。B类b剪接FGFRs和FGFR4Δ的BaF3细胞有丝分裂测定。
FGF19（小鼠FGF15）、FGF21和FGF23亚家族的独特之处在于，这些FGF可以作为分泌激素发挥作用(36–41). 为了获得这些FGF对FGFR-表达的BaF3细胞的显著活性，需要蛋白质浓度在3到800 nM之间，肝素浓度>10μ克/毫升(). 这些参数表明，与FGF家族的其他经典成员相比，其相对活性较低。然而，在这些浓度下，FGFs 19、21和23对FGFR1c、2c、3c和FGFR4表现出一致的活性，但对FGFRlb、2b或3b没有活性(;; 和).
FGFs 19、21和23激活受体A类在FGFR1c表达的BaF3细胞上测量FGFs 19、21和23的肝素剂量反应。随着肝素浓度的增加，活性增加，但在浓度>10时，活性趋于稳定μ克/毫升。B类，用于使FGF19、21和23的活性正常化的FGF1对照活性。C类c剪接FGFRs的BaF3细胞有丝分裂分析。D类b剪接FGFRs和FGFR4Δ的BaF3细胞有丝分裂测定。
FGF11家族对任何FGFR均无已知活动(30,42,43). 重组FGF12和FGF14蛋白在任何FGFR-表达的BaF3细胞系上均无活性，与之前的观察结果一致(30)（未显示数据）。
讨论
FGF家族是最大的生长因子家族之一，由22个成员组成，在哺乳动物中具有13-71%的序列相似性(2). FGF在胚胎发育和成人生理功能中具有广泛的活性。在胚胎中，FGF常常跨越间质-上皮边界发出信号，在那里它们调节器官发生和模式形成(44–47). 在成人中，FGF在调节体内平衡、伤口愈合和组织修复方面发挥着重要作用(48). FGF的不受调控表达可能导致癌症(41,49,50).
FGF受体1、2和3的表达模式是不同的，但在一些组织中是重叠的。对这些受体的选择性剪接模式的分析表明，b或c外显子的利用依赖于细胞谱系。b亚型优先表达于上皮组织，而c亚型则表达于间充质组织(17,51–53). 几个FGF的活动可以沿着这些线进行划分。例如，FGF7亚家族在间充质中表达，并显示出对FGFR2b的最大活性。FGF8亚家族在上皮组织中表达，并激活FGFRs的c剪接形式。因此，FGF和FGFRs之间的结合特异性对于FGF信号的空间调控至关重要。
FGF7亚家族的特异性在体外在BaF3细胞分析中()，密切反映了体内FGF10的功能，一种在间充质组织中表达的分子，向上皮FGFR2b发出信号。FGF10信号的中断对胚胎发育是灾难性的，导致肢体发育和需要分支形态发生的器官（如胰腺、唾液腺和肺）出现严重缺陷(54–60). FGF10和FGFR2b之间的相互作用也是胚胎腭和盲肠发育所必需的(61,62). FGFR2突变改变配体结合特异性也会导致发育性疾病。Apert综合征是一种累及颅缝骨化、并指和智力低下的衰弱性疾病(63–65). Apert综合征的分子病因来自FGF7家族成员对间充质FGFR2c的不当激活(31,66–69).
FGF10与FGFR2b复合物的晶体结构表明，交替拼接残基之间的特定接触βC′–βFGFR2b的E环区域和βFGF10的4链和N末端解释了FGF10-FGFR2b结合的特异性(14). 特别是，FGF10 N端的Asp-76和βC′–βFGFR2b的E环对于FGF10-FGFR2b的特异性是必不可少的。这些氢键参与了FGF7亚家族和FGFR2b之间的特异性，这进一步得到了以下事实的支持：Asp-76是FGF7亚家族特有的，Ser-315位于b剪接异构体特异性中βC′–βE回路(14).
FGF8亚家族成员专门绑定FGFRc拼接形式和FGFR4(). FGF8b与FGFR2c复合物的最新晶体结构为FGF8亚家族成员获得其对FGFRs 1-3和FGFR4的c剪接异构体的特异性/混杂性提供了分子基础(70). 重要的是，对于FGF8亚家族，交替拼接βF和βG股，而不是βC′–βE环含有FGF8亚家族结合特异性的主要受体决定簇。这是因为FGF8亚家族成员的N末端相对于β-三叶芯，与其他FGF相反(70).
FGFs 8、17和18在一些组织中有不同的重叠表达模式，例如发育中的后脑交界处(71–73). 其中一些FGF是中枢神经系统形态发生所必需的(33,70,74–76). 在肢体发育过程中，Fgf8和Fgf17在顶端外胚层嵴表达，早期肢体外胚层中Fgf8的失活导致肢体体积减小，表明顶端外胚叶嵴的Fgf8信号对肢体正常发育至关重要(77). Fgf18在软骨膜中表达，调节软骨生成和成骨(78,79).
FGF9亚家族激活所有FGFRc亚型和FGFR3b(). FGF9在胚胎发育期间广泛表达于上皮样组织和神经元组织，是肺、心脏、内耳、消化系统和睾丸发育所必需的(35,80–88). 在BaF3有丝分裂原检测中，FGF19亚家族成员与FGF1相比活性较弱。然而，在高浓度下，这些FGF激活FGFR1c、-2c、-3c和FGFR4(). 与其他与FGFRs具有高度亲和力并调节细胞增殖、分化和迁移的FGF亚家族相比，这些亚家族成员似乎充当代谢调节器和激素(36,37,40,89–94). 可能需要其他辅因子来实现最佳活性，或者这些FGF与其他类型的受体相互作用并激活其他类型的接收器。最近，Klotho蛋白被发现作为FGF23与FGFR1c、-3c和-4结合的辅受体，在信号分析中，Klothon将FGF23活性提高了10倍以上(95). 此外，肾上皮细胞可能在其基底外侧表面表达FGF23受体，其功能与已知的FGFRs不同(96).
如前所述，FGFs 12和14在BaF3分析中没有显示有丝分裂活性() (30). FGF11-14亚家族，也称为FGF同源因子（FHFs），包含与FGF核心区域的序列同源性(97–100). 事实上，FHF1b（FGF12b）的晶体结构表明，FHF的核心区域与真诚地FGF，如FGF9(30). 结构表明，FHF核心区域的两个FHF不变表面残基Arg-52β4–β5回路和Val-95β9股FHF1b，导致FHF无法结合FGFRs(30). FHF与大多数其他FGF的不同之处在于它们缺少N端信号序列。FHF在发育成熟的神经系统中表达水平最高(100,101)它们对神经生理功能很重要(102–104). 有趣的是，已发现FHF家族成员与细胞质蛋白（如IB2）和电压门控钠通道C末端尾部相互作用(42,43,105–109).
FGF1是通用FGF，可以激活所有FGFRs。FGF1-FGFR1c、FGF1-FGFR2c和FGF1-FGFR3c复合物的晶体结构比较为FGF1独特的FGFR结合混乱提供了关键见解(110). FGF1被用作内部控制，以使其他FGF的相对活性正常化。FGF受体结合特异性的多样性总结于和这些FGF的相对活性可能会受到重组蛋白质量的影响，并可能解释此处显示的数据与之前使用相同分析所描述的数据之间的数量差异(12). Mohammadi正在对所有可能的FGF-FGFR结合相互作用进行定量系统分析等。(4)使用表面等离子体共振（参见参考文献中的表1。4). 总的来说，目前可用的表面等离子体共振数据与这里介绍的基于有丝分裂的分析结果一致。这些数据集之间的差异可能是因为表面等离子共振实验是在没有肝素/HS的情况下进行的，以单独监测1:1的FGF-FGFR结合，而有丝分裂分析是在外源肝素的存在下进行的。
这个体内FGF的特异性也可能与这些不同在体外数据为，体内，许多辅因子可能调节FGF对FGFRs的亲和力。此外，FGF和FGFRs之间形成异二聚体的可能性可能会进一步增加受体与受体相互作用的储备。考虑到这些警告，此处显示的数据，在相同的实验条件下进行分析，应为比较相对FGF活性和特异性提供基线，并应允许预测FGF配体和FGF受体在发育、组织内稳态和疾病中的潜在信号传递。
