IFT颗粒在秀丽线虫驱动蛋白II和OSM-3马达协同作用下的纤毛

纯化的驱动蛋白II和OSM-3–驱动蛋白相互作用，在MT滑动分析中产生中等运动率

基于上述结果，我们分析了在野生型OSM-3的45 mM管道和OSM-3–G444E的25 mM管道存在的情况下，由纯驱动蛋白II与OSM-3摩尔比不同的混合物驱动的基于MT的运动速度(图2和表二). 在这些优化条件下，驱动蛋白II仅以～0.5μm/s的速度移动，而OSM-3（野生型或G444E突变型）仅以～1.1μm/s移动(图1 E,图2,表二和视频1；可在获取http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200606003/DC1)与体内驱动蛋白II（0.5μm/s）和OSM-3（1.3μm/s(斯诺等人，2004年;Ou等人，2005年). 此外，这两种马达的混合物显示出中等的运动速率，其速率随摩尔比呈非线性变化，并且在OSM-3摩尔分数介于0.6和0.8之间时复制0.7μm/s的体内速率(图2,表二和视频1）。这表明，运动的中间速度，就像沿着纤毛初始段观察到的速度一样，可以通过驱动蛋白II和OSM-3之间的简单功能性相互作用产生，而不需要额外的纤毛因子，例如运动调节器、作为货物与马达结合的IFT颗粒的存在、，上覆的睫状膜，或纤毛特异性轴突MT双倍体，用作马达的轨道。

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图2。

显示交替作用和机械竞争模型拟合的OSM-3和驱动蛋白II混合物的MT滑移率与摩尔分数的关系。（A和B）竞争性运动分析中的滑动速度直方图，作为野生型OSM-3（A）和OSM-3–G444E突变体（B）与驱动蛋白II的百分比的函数。在0%~100%OSM-3之间，可以观察到滑动速度介于每个电机单独产生的滑动速度之间。（C和D）相对于野生型（WT）OSM-3的摩尔分数绘制的滑翔测定。带有标准偏差（误差条）的实验数据（黑点）最适合交替作用（红线；C）和机械竞争（蓝线；D）模型。参数如下：v（v） _{驱动蛋白II}=0.34μm/s和v（v） _锇-3=1.09μm/s（C）；和,γ=0.98≈1（D）。（E和F）绘制滑动分析速度与OSM-3–G444E摩尔分数的关系图。带有标准偏差的实验数据（黑点）最适合交替作用（红线；E）和机械竞争（蓝线；F）模型。参数如下：v（v） _{驱动蛋白II}=0.46μm/s和v（v） _锇-3=0.99μm/s（E）；和,，γ=0.7（F）。

两个顺行IFT驱动蛋白的功能协调模型

驱动蛋白II和OSM-3协同驱动MT运动的中间速率取决于它们的摩尔比，这一观察结果可以用两种模型来解释，如补充材料中详细描述的那样。在第一个模型，即交替动作模型中，我们建议电机按顺序动作，以便由OSM-3驱动的快速步或几次快速步与驱动蛋白II执行的慢速步或慢速步交替（图S3 a，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200606003/DC1). 两个电机的周期性切换将平均，以产生在体外和沿纤毛观察到的中等运动速度。在第二个模型，即机械竞争模型中，电机以协调一致的方式同时工作，运动较慢的驱动蛋白II对速度较快的OSM-3施加阻力，而速度较快的OSM-3拉动驱动蛋白-II并使其加速（图S3 B）。我们开发了定量交互作用和机械竞争模型，从中我们导出了运动速度与两个电机摩尔分数（补充材料）之间的关系式。我们观察到，通过合理的参数调整，从两个模型导出的方程与MT滑动速度与OSM-3摩尔分数曲线图中的数据点非常吻合(图2，C–F)因此，这两个模型可以解释滑动分析数据和沿野生型纤毛观察到的IFT颗粒转运速率，klp-11型、和锇-3动物（见讨论）。因此，从我们的定量建模中得出的一个重要结论是，交替动作和机械竞争模型都非常合理，但这种分析本身并不能让我们决定交替动作或机械竞争是更可能的运动协调机制。

然而，交替作用和机械竞争模型确实对缺乏BBS蛋白和驱动蛋白II或OSM-3的双突变体中IFT颗粒的转运做出了明确的预测(论坛；klp-11型,论坛；kap-1型，或bbs；锇-3突变体）。让我们考虑一下为什么IFT粒子亚复合物A和B在野生型中以0.7μm/s的速度沿纤毛的初始段一起移动，而在论坛突变体，IFT-A明显被驱动蛋白II以0.5μm/s的速度移动，而IFT-B被OSM-3以~1.1–1.3μm/s移动(Ou等人，2005年). 我们假设BBS蛋白稳定完整的IFT颗粒，因此在论坛功能缺失突变体。虽然这种离解可能是被动的，但我们推断，如果低速电机对快速电机施加阻力，则它可能是一个主动过程，由驱动蛋白-II和OSM-3电机协同作用对IFT粒子施加的应力导致IFT粒子一起移动，反之亦然，如机械竞争模型（补充材料）。这种应力不能像在交替作用模型中那样由电机顺序作用产生，因为在任何时候只有一种类型的电机会移动颗粒（补充材料）。此外，如果在论坛单个突变体需要驱动蛋白II和OSM-3之间的机械竞争，其中一个运动和BBS蛋白功能的丧失，如论坛；驱动蛋白-2双突变体，应防止IFT颗粒离解。基于这些论点，交替动作模型预测论坛；驱动蛋白-2突变体，IFT颗粒将被动分解为IFT-A和-B，其中只有一个沿着纤毛移动(图3 A). 另一方面，机械竞争模型预测，在没有竞争发动机协同作用对IFT颗粒施加张力的情况下，IFT颗粒应保持完整(图3 A).

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图3。

显示BBS蛋白对抗驱动蛋白II和OSM-3之间的机械竞争以维持IFT颗粒完整性的模型。（A） 演示两个模型预测的不同表型bbs-；发动机双突变体。交替动作模型预测bbs-；klp-11型双突变体，IFT-A不能被驱动蛋白II或OSM-3-驱动蛋白移动，也不会进入纤毛，因此IFT-A会在截断纤毛的末端形成聚集体，模仿IFT-A突变体的表型。另一方面，在bbs-；锇-3双突变体IFT-B不能被驱动蛋白II或OSM-3移动，睫状体长度减少。相比之下，机械竞争模型预测bbs-；klp-11型或bbs-；锇-3双突变体，两个马达之间不会有机械竞争，也不会通过IFT颗粒施加阻力，因此即使没有BBS蛋白，IFT颗粒也可以维持在单个复合物中，并且a和B亚复合物将显示相同的运输曲线。（B） 测试预测的运输分析结果摘要(图4). 在野生型（WT）中，BBS蛋白通过对抗驱动蛋白II和OSM-3之间的机械竞争来维持IFT颗粒的完整性。在bbs-7/-8单个突变体，驱动蛋白II和OSM-3之间的机械竞争不能被BBS蛋白抵消，因此IFT颗粒分解为亚复合物A和Bbbs-7/-8；驱动蛋白II或bbs-7/-8；锇-3双突变体，不产生机械竞争，所以IFT颗粒不离解，而是由驱动蛋白II或OSM-3单独移动。

BBS蛋白在IFT颗粒稳定性和运动协调中的作用

在这个模型中，BBS蛋白通过维持驱动蛋白II–IFT-A与OSM-3–IFT-B的结合来协调马达，否则由于两个马达施加的张力（例如论坛突变体）。在滑动分析中，不需要BBS蛋白，因为盖玻片在相邻的驱动蛋白II和OSM-3蛋白之间形成物理连接。我们的模型假设IFT亚复合物A和B通常相互作用形成单个IFT颗粒复合物，该颗粒复合物通过驱动蛋白II和OSM-3沿着野生型纤毛移动（它们可能分别沿着MT A和B亚纤维移动；Ou等人，2005年). 然而，尽管IFT颗粒从莱茵衣藻鞭毛（可能缺乏BBS蛋白）以16-S复合物的形式沉淀，它们也可以通过改变溶液条件来分离，这增加了IFT-a和-B在体内通常作为单独的复合物存在的可能性(科尔等人，1998年;秦等，2004). 例如，我们之前的数据可以解释，如果在野生型中，驱动蛋白II–OSM-3–IFT-A和驱动蛋白II–OSM-3–IFT-B的单独复合物沿着纤毛的初始段以相同的速度移动，需要BBS蛋白将OSM-3连接到驱动蛋白II–IFT-B复合物上，并将驱动蛋白II连接到OSM-3–驱动蛋白II复合物上(Ou等人，2005年). 然而，这预示着论坛；驱动蛋白II和论坛；锇-3双突变体IFT-A和-B根本不会沿着纤毛移动，这与我们的IFT分析不一致。还需要更多的工作来确定IFT-A和-B在体内正常相互作用形成单一转运复合物。

虽然在同时使用驱动蛋白II和OSM-3进行纤毛发生的系统中，BBS蛋白似乎是稳定IFT颗粒所必需的，但在驱动蛋白Ⅱ单独起作用的生物体中（例如，C.莱因哈迪)，缺乏双电机依赖的机械竞争，因此IFT颗粒应在论坛突变体和BBS蛋白可能不需要。事实上，BBS-7/-8蛋白在C.莱因哈迪鞭毛(Pazour等人，2005年)虽然在交配过程中，它们有可能与OSM-3一起进入鞭毛并拉长远端单核细胞(Mesland等人，1980年). 在脊椎动物中，OSM-3同源物KIF17需要靶向纤毛的环核苷酸门控通道(Jenkins等人，2006年). 此外，在秀丽线虫感觉纤毛存在于各种生物中（例如人类[Moran等人，1982年]和青蛙嗅纤毛[里斯，1965年])和环状核苷酸门控通道聚集在后纤毛远端段的一个区域(Flannery等人，2006年). 有趣的是，BBS基因敲除小鼠（BBS-1、-2和-4）特异性地失去了嗅纤毛的远端，从而导致嗅觉障碍(Kulaga等人，2004年;Mykytyn等人，2004年;Nishimura等人，2004年). 因此，BBS蛋白可能对包含纤毛的远端节段的IFT有特殊贡献，其中使用了两个顺行IFT马达。IFT电机之间的BBS蛋白依赖性机械竞争，于秀丽线虫感觉神经元，可能与某些脊椎动物中类似的两区纤毛的组装有关，而这一过程中的缺陷可能是BBS的基础。

与其他运动协调系统的相关性

反极性有丝分裂MT马达之间的拮抗竞争已被广泛讨论(Sharp等人，2000年)，相同极性电机之间的功能交互也有先例。例如，在肌肉中，较慢的自行车跨线桥会对较快的自行车桥产生阻力，从而减缓肌肉缩短的最大速度(Warshaw等人，1990年). 还表明，电机可以通过在电机驱动的MT滑动方向上施加的力来加速(Coppin等人，1997年). 此外，我们提出的机制的生物物理合理性得到了实验的支持，在这些实验中，具有不同速度的正向驱动蛋白马达被证明在运动测定中相互作用以产生中等速度，包括驱动蛋白-1和-5(Crevel等人，2004年)以及混合的Kif3A和Kif3B同二聚体(张和汉考克，2004). 引人注目的研究张和汉考克（2004）阐明了不同的Kif3A和Kif3B运动域如何在加工型驱动蛋白-II全酶中合作，但驱动蛋白-1与驱动蛋白-5之间的竞争以及Kif3A-Kif3B同源二聚体之间的竞争不太可能反映真实的体内相互作用。据我们所知，我们的研究首次揭示了不同的、相同极性的基于MT的细胞内运输运动全酶之间的竞争运动性，这些酶在体内可以协同工作。

该系统不同于存在于黑素小体上的驱动蛋白II和细胞质动力蛋白之间的受控协调(Rogers等人，1997年)和其他货物(Kural等人，2005年)顺行和逆行运动的同时激活和抑制（反之亦然）有助于顺行和顺行方向的交替跑步(Mallik和Gross，2004年). 这里提出的相同极性IFT马达的独特机械竞争可能代表了另一种普遍的方式，即马达被协调和控制，以在真核细胞内产生细胞内运输的相干网络。

水动力分析

如前所述，进行蔗糖密度梯度离心和凝胶过滤色谱(Wedaman等人，1996年). 使用Siegel和Monty方程计算驱动蛋白II复合物的分子量(西格尔和蒙蒂，1966年;科尔等人，1992年;Wedaman等人，1996年).

运动性分析

如前所述，在21°C下进行MT运动试验(科恩等人，1989年). 对每个数据点测量了10–60 MT的速度。

荧光显微镜

如前所述对IFT进行分析(斯诺等人，2004年;Ou等人，2005年). 将GFP转基因蠕虫用10mM左旋咪唑麻醉，安装在琼脂垫上，并保持在21°C。我们使用配备100×NA 1.35物镜和旋转圆盘共焦头（UltraVIEW；PerkinElmer）的显微镜（IX70；Olympus）采集图像，488氩离子激光器以0.3 s/帧的速度激发2–3分钟。所有图像均使用冷却电荷耦合器件相机（ORCA-ER；哈马松）采集，并且使用MetaMorph软件（Universal Imaging Corp.）创建kymographs和视频。

创建和维护论坛和运动突变动物

转基因动物表达che-11｜gfp，che-2｜gfp、和osm-6｜gfp与bbs-7/osm-12（n1606）,bbs-8（nx77）和klp-11（tm324），或渗透压-3（p802）创建双突变体，其基因型通过其染色表型和/或PCR进行确认。

我们感谢W.O.Hancock博士和J.J.Snow博士的有益讨论。

这项工作得到了美国国立卫生研究院（J.M.Scholey和R.D.Vale）和加拿大卫生研究所（M.R.Leroux）的资助。