血管内皮钙粘蛋白控制VEGFR-2内化和细胞内信号传导

内源性VEGFR-2保留信号活性

在缺乏VEC的情况下，内皮细胞对VEGFR-2传递的生长信号的反应更有效。从上述观察结果中，我们得出结论，VEGFR-2在VEC阴性细胞中比在VEC阳性细胞中内化得更快、程度更大。因此，我们询问当受体被隔离在细胞内隔间时，是否保持其信号传递活性。

我们首先通过在碘xanol梯度上进行细胞分馏来测试内化受体是否保留酪氨酸磷酸化(Yeaman等人，2001年). 使用识别磷酸酪氨酸（PY）1214–和PY1054/59–VEGFR-2的抗体。如所示图5在没有VEC的情况下，在细胞内部分检测到较高数量的磷酸化VEGFR-2，而在有VEC的条件下，磷酸化受体优先保留在对应于外周质膜的部分。

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图5。

VEC的表达降低了内部隔室中PY–VEGFR-2的数量。VEGF处理的VEC-null和阳性细胞的提取物按照材料和方法中所述的碘克沙醇梯度进行分馏。通过SDS-PAGE和Western blotting分析代表每个组分总蛋白含量的样品。正如预期的那样，VEC集中在与质膜相对应的低密度组分中，而氯氰菊酯和EEA-1则富集在与内膜相对应、密度较高的组分中(Yeaman等人，2001年). 在用VEGF刺激时，PY1214–VEGFR-2富含与VEC缺失细胞的内膜相对应的部分。图中显示了磷酸化受体与每个组分中存在的总受体之间的比率。为了量化，在每一部分中，我们考虑了在质膜上具有成熟形式受体分子质量的带（～210 kD；见部分1和箭头；高桥和涉谷，1997年). 我们通过假设全长VEGFR-2代表受体的信号形式来选择这一条带。随着密度的增加，VEC-null和阳性细胞（星号）中均出现较亮的带。该条带很可能来源于内部隔间中的VEGFR-2处理（例如，蛋白水解或中间合成产物），并且在外周膜部分中确实不存在。使用PY1054/59–VEGFR-2抗体（未描述）获得了类似结果。

VEGFR-2酪氨酸1175的磷酸化是结合和激活PLC-γ所必需的，PLC-β是VEGF介导的细胞增殖的主要效应器(Takahashi等人，2001年). 通过使用PY1175–VEGFR-2特异性抗体，我们观察到，在缺乏VEC的情况下，在该特异性酪氨酸处磷酸化了更多的内化受体(图6，A和B). 一致地，在稀疏的HUVEC中发现了更多的内化PY1175–VEGFR-2（图S2，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200602080/DC1).

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图6。

内部化的VEGFR-2在酪氨酸1175处磷酸化。（A） VEGF刺激VEC-null和阳性细胞图1固定并处理以用于免疫荧光显微镜。VEGF刺激后，用PY1175–VEGFR-2抗体观察到的囊泡标记模式在VEC-null细胞中明显多于VEC-阳性细胞。DAPI染色后细胞核呈蓝色。棒材，20μm。（B） 图像通过ImageJ进行分析，以量化PY115–VEGFR-2–阳性腔室（见材料和方法）。该图显示了通过ImageJ在五个独立实验中分析的18个随机场的平均值±SD（误差条），并将其归一化为每个场的细胞数。在每个实验中，至少分析了三个随机场。*，通过方差分析和Duncan检验，比较VEGF后VEC缺失和阳性细胞的P≤0.01。

为了进一步证明PLC-γ可以被内化受体激活，我们用针对活性PY783–PLC-β的抗体对细胞进行染色。如所示图7在没有VEC的情况下，活性PLC-γ与内化VEGFR-2的共分布比在有VEC的条件下更有效。

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图7。

内化VEGFR-2和活化PLC-γ的克隆化。（A） 体内用VEGFR-2抗体标记VEC阴性和阳性细胞，并用VEGF刺激图6酸洗、固定并处理以用于免疫荧光显微镜。细胞被双重标记，抗体仅在酪氨酸783磷酸化时识别PLC-γ。VEGFR-2与AlexaFluor488-共轭二级抗体一起被发现，并以绿色显示。用AlexaFluor647结合二级抗体显示的PY783–PLC-γ以红色显示。对于每种细胞类型，右侧底部面板（方框区域的三倍放大）显示VEGFR-2和PY783-PLC-β（粉红色）在VEGFR-2背景上的共定位（灰色）。这是通过ImageJ共定位插件获得的（有关详细信息，请参阅材料和方法）。箭头指向PY783–PLC-γ和VEGFR-2的共同定位。棒材，10μm。（B） 通过ImageJ分析共聚焦图像以计算共定位事件的数量。这些值是根据每个细胞中VEGFR-2阳性细胞的数量进行标准化的，如图所示。VEGF治疗后，VEC-null细胞的共定位率约为VEC-阳性细胞的5倍。图中的值是三个独立实验的平均值±SD（误差线）。在每个实验中，每个点都是从至少五个随机字段中计算出来的。*，通过方差分析和Duncan检验比较VEGF后VEC-null和阳性细胞，P≤0.01。

抑制VEGFR-2内化影响其增殖信号

总的来说，上述数据表明VEC限制了受体的激活和内化。在缺乏这种蛋白的情况下，受体被更有效地内化，并在更长的时间内保持其活性状态，从而导致持续的增殖信号。

为了进一步验证这一假设，我们通过用两种特定的siRNA沉默氯氰菊酯来阻止受体内化(图4,​,8,8和S3），以氯氰菊酯重链信使的独立序列为目标。正如预期的那样，在没有VEC的情况下，VEGF诱导的VEGFR-2磷酸化和p44/42 MAPK的激活高于在有VEC的条件下(图8). 当siRNA网格蛋白应用于VEC-null细胞时，受体和MAPK磷酸化都下降到与VEC-阳性细胞相当的值。相反，在VEC存在的情况下，siRNA网格蛋白的作用要么微弱，要么无法检测到。一贯地，用高渗介质处理细胞也观察到MAPK激活受到抑制，而用filipin处理并没有改变VEC阳性或阴性细胞中对VEGF的MAPK激活（未公布的数据）。总的来说，这些结果有力地表明，内化保护受体免受去磷酸化的影响，从而增加和延长其增殖信号传导。

VEC与VEGFR-2的结合是质膜受体滞留所必需的

然后我们研究了VEC抑制VEGFR-2内化的机制。在之前的研究中，我们发现VEC与VEGFR-2形成复合物，我们分析了VEC参与这一过程的结构域(Lampugani等人，2003年). 缺乏β-catenin-或p120-binding结构域的VEC突变体分别无法或效率较低地协同免疫沉淀VEGFR-2。我们发现这些突变体也不能显著阻止VEGFR-2内化（图S4，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200602080/DC1)表明与VEC结合导致受体内化减少。

类似于E-cadherin（有关审查，请参阅Bryant和Stow，2004年)，VEC可以通过氯氰菊酯涂层的凹坑内化(Xiao等人，2005年). 我们测试了VEC是否与VEGFR-2在细胞内共分布。如中所述图9VEGF激活后，在VEC阳性细胞和HUVEC中未检测到VEC与VEGFR-2阳性囊泡的显著共分布（图S4）。只能观察到接合共定位(图9). 免疫电镜（未发表的数据）证实了内隔间缺乏共分布。总的来说，这些数据表明受体在与VEC分离后内化。

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图9。

VEC不与VEGFR-2在内部隔间内共分布。VEC阳性细胞用VEGF处理10分钟，对VEGFR-2和VEC进行双重染色，并用共焦显微镜进行分析。除交界染色外，VEC未显示任何明显的水泡图案。VEGFR-2和VEC似乎只在细胞-细胞接触处协同分布，而不在细胞内区室中。右侧的底部面板（方框区域的2.6倍放大）显示了VEGFR-2和VEC（黄色）在VEC背景上的共同定位（灰色）。这是通过ImageJ的同位化插件获得的（有关详细信息，请参阅材料和方法）。箭头指向VEGFR-2和VEC的联合共定位。棒材，10μm。

细胞类型和培养条件

内皮细胞的纯合子无突变VEC公司基因（VEC null）和通过逆转录病毒基因转移从其衍生的细胞系，并表达野生型（VEC阳性）或各种VEC突变构建物，并如前所述进行详细描述(Lampugani等人，2003年). 所有实验中，50000个细胞/cm²（在24小时内达到汇合点）接种在完整培养基中，不更换培养基培养72小时。然后用MCDB 131（Life Technologies）清洗细胞一次，并在MCDB 1311（饥饿培养基）中的1%BSA中饥饿18–20小时，然后激活2小时，用MCDB 131洗涤细胞一次，并在新鲜饥饿培养基中进一步孵育。将80 ng/ml VEGF（人重组VEGF 165；PeproTech）置于新鲜饥饿培养基（仅新鲜饥饿培养液用于对照）中，在37°C的指定时间间隔内处理细胞。如果没有其他指示，VEGF治疗10分钟。

如前所述，HUVEC在MCDB 131中与内皮细胞补充剂一起培养(Lampugani等人，2003年). 实验用1800和42000个细胞/厘米²分别接种以获得稀疏和融合培养物。然后按照本节所述对小鼠内皮细胞进行HUVEC治疗，但在用VEGF刺激之前，饥饿减少到6小时。

菲林和高渗治疗

用1μg/ml菲利平（菲利平III菲律宾链霉菌; Sigma-Aldrich）1小时(Schnitzer等人，1994年;Andriopoulou等人，1999年). 如前所述，使用高渗介质（含1%BSA的MCDB 131中的0.45 M蔗糖）抑制氯氰菊酯孔介导的内吞作用30分钟(Heuser和Anderson，1989年;Ehrlich等人，2001年). 然后按照特定部分的指示对细胞进行刺激和分析。

RNA干扰

按照细胞类型和培养条件中的描述接种细胞。20小时后，用OptiMEM（Life Technologies）清洗细胞一次，并按照制造商的说明，用2μl/ml LipofectAMINE 2000（Invitrogen）将40 nM隐形寡核苷酸（Invit罗gen）转染到OptiMEM中。5小时后，去除转染培养基，并添加完整的培养基。在刺激和处理免疫荧光和提取之前，细胞再培养72小时。

隐式寡核苷酸的使用如下：a，5′-GCGUUGUUCUACCAUCUUUUUA-3′（起始核苷酸位于起始密码子下游2118个碱基处）；b、 5′-GAAGAACUCUUUGCCGGAAAUUUA-3′（起始核苷酸为起始密码子下游1284个碱基）靶向小鼠网格蛋白重链；和5′-UCGAGCAGUGAGCAUGUUGGAAA-3′（起始核苷酸为起始密码子下游4023个碱基）靶向小鼠DEP-1/CD148。作为对照，使用了C/G含量等于阳性寡核苷酸的隐形siRNA-阴性对照双链寡核苷酸（Invitrogen）。

内化分析

免疫荧光显微镜

按照细胞类型和培养条件的描述，在直径为35mm的培养皿中培养细胞。在特定部分所示的处理后，去除培养基，并在室温下将细胞固定在含有0.1%Triton X-100和0.1%NP-40的2.5 mM三乙醇胺（pH 7.5）中的1%PFA中25分钟(Lallemand等人，2003年). 染色前，在RT时将0.5%Triton X-100加入PBS中10分钟。在一些实验中，在细胞固定后使用Avas12α1抗体对VEGFR-2进行免疫荧光显微镜检查（体外染色）。应用的固定/渗透方法(Lallemand等人，2003年)允许通过体外染色（细胞固定后的一级抗体）在内部隔间内对VEGFR-2进行最佳观察。通过体内（见内化测定）和体外染色获得的数据可叠加VEC对VEGFR-2囊泡标记的影响以及VEGFR-2与特定区室标记物（如EEA-1和caveolin-1）的共分布。体内染色后（固定前进行酸洗和不进行酸洗）VEGFR-2囊泡分布的比较如图S5所示。

在一些实验中（尤其是用于检测氯氰菊酯），固定在1%的PFA中，渗透性使用0.02%的皂苷进行，在所有染色过程中都保持这种渗透性。驴体内产生的荧光标记二级抗体对除目标物种（Invitrogen）以外的其他物种具有最小的交叉反应性。用AlexaFluor488-共轭二级抗体（抗鼠抗鼠血管内皮生长因子受体-2和抗兔抗人血管内皮生长激素受体-2）显示抗血管内皮生长素受体-2。在双标记实验中，分别使用AlexaFluo488-和-647荧光色素对两种抗原进行染色。

使用63×和100×透镜在荧光显微镜（DMR；徕卡）下观察样品。在通过Adobe Photoshop for MacIntosh进行处理之前，使用电荷耦合相机（型号3；滨松）拍摄图像。使用ImageJ程序（10.2版）对囊泡标记进行量化。为了进行比较，在恒定采集设置下采集相同抗原的不同样本图像。使用阈值工具确定消除大部分信号背景的最合适的较低阈值，并通过目视检查和单像素维粒子计数进行确认。在某些情况下，对同一样本在不同的阈值下进行分析，以确定最佳拟合。上限始终设置为255。对最小大小为五个像素的粒子进行计数。对于共定位分析，使用共聚焦显微镜（TCS SP2 AOBS；徕卡）采集图像，共聚焦显微镜具有63倍物镜和3倍变焦。使用ImageJ的共定位插件对共定位进行量化。通道比率始终设置为90%。对于这两个通道，使用阈值工具（如上所述）确定最适合去除大多数背景信号的较低阈值。

相对长度单位

对于免疫金标记，将PBS中的4%PFA/0.4%戊二醛以1:1的比例添加到培养基中。RT 2小时后，丢弃固定剂，在PBS中的1%PFA中刮取细胞，收集在Eppendorf管中，并按照前面所述进行超薄冷冻切片处理(Confalonieri等人，2000年). 如前所述进行双重免疫金标记(Slot等人，1991年).

细胞分离、提取和蛋白质印迹

如前所述，在碘克沙醇梯度上进行亚细胞分离(Yeaman等人，2001年). 细胞在150厘米内培养²试管类型和培养条件中描述的烧瓶。每个梯度使用三个烧瓶。经过指定的处理后，将培养物放在冰上，并用冰镇PBS清洗两次。在1.2 ml冰镇等渗缓冲液/烧瓶中刮取细胞（20 mM Hepes-KOH，pH 7.5，0.25 M蔗糖，90 mM KO-乙酸酯，2 mM Mg-醋酸酯，0.5 mM Na-钒酸钠，1 mM NaF，10 mM焦磷酸盐，3 mMβ-磷酸甘油酯，1 mM-pefabloc，40 U/ml抑肽酶，10μg/ml亮氨酸肽和10μg/ml胃蛋白酶抑制素），并用Dounce均质器均质。在1400℃通过离心将细胞核和残留的完整细胞制成颗粒克在4°C下保持5分钟。将上清液分为三等分，并与碘xanol（OptiPrep；Axis-Shield）和均质缓冲液混合，以生成30%、20%和10%碘xanool溶液。然后将其装入11.2-ml OptiSeal试管（Beckman Coulter）中，并在353000下超速离心克在转子中保持3小时（VT 65.1；Beckman Coulter）。从梯度顶部收集600-μl组分，并测定蛋白质浓度（双辛酸试剂；Pierce Chemical Co.）和密度（OptiPrep制造商指示的244nm处的OD）。然后在还原莱姆利样品缓冲液中煮沸馏分。用SDS-PAGE和Western blotting对含有相同数量蛋白质的不同细胞类型的每个组分样品进行比较，并代表每个组分的总蛋白质含量。

对于总细胞提取物，将细胞在PBS中洗涤两次，在含有100mM DTT的2×沸腾laemmli样品缓冲液（对于35mm培养皿为200μl）中提取，刮除，并再煮沸10分钟。在不含DTT的情况下提取平行样品，并通过二辛可宁酸分析测定蛋白质浓度。在每条通道中装载总共15μg蛋白质，并用SDS-PAGE分离，转移到硝化纤维素上，并用指示的抗体进行免疫印迹。

使用HRP偶联的马抗鼠、羊抗兔（细胞信号）和兔抗羊（DakoCytomation）二级抗体和ECL化学发光试剂（GE Healthcare）进行检测。使用未校准OD函数上的ImageJ设置扫描胶片并量化条带。使用Adobe Photoshop 7.0、Excel X for MacIntosh和Adobe Illustrator 11 for PC生成所示的图形。

我们非常感谢Kendra Swirsding编辑手稿。

这项工作得到了欧洲共同体意大利协会（QLRT-2001-02059，综合项目合同LSHG-CT-2004-503573，NoE MAIN 502935和NoE EVGN 503254）、意大利卫生部的支持，Ministro dell’Universityáe della Ricerca/Fondo degli Investimenti della Ricersca di Base（授予RBNE01MWA_009和RBNE01F8LT_007）和Cariplo基金会。C.Tacchetti获得了Telethon基金会的资助（GTF03001）。