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细胞生物学杂志。2007年4月9日；177(1): 13–20.
数字对象标识：10.1083/jcb.200612140
预防性维修识别码：PMC2064101型
PMID：17403931
报告

新型中心体周期在不对称细胞分裂中的作用

纳赛尔·鲁桑1和马克·佩弗1中，2
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摘要

组织干细胞在组织维持中起着关键作用。黑腹果蝇中枢神经母细胞是干细胞不对称分裂的良好模型。早期的研究表明，它们的有丝分裂纺锤体定向是在纺锤体形成之前建立的。我们研究了这种现象发生的机制，揭示了一种新的中心体循环。在间期，两个中心粒分离，但只有一个中心粒是活跃的，保留着近中心粒物质并形成“优势中心体”。该中心体充当微管组织中心（MTOC）并保持静止，形成未来纺锤体的一极。第二个中心粒是不活动的，在作为中心体/MTOC被激活之前，它会移动到细胞的另一侧。这伴随着Polo激酶的不对称定位，Polo激酶是一种关键的中心体调节因子。中心体的破坏破坏了不对称分裂的高保真性。我们提出了一种两步机制来确保纺锤体的准确定位：新颖的中心体周期产生单个间期MTOC，粗对准纺锤体，纺锤体-皮层相互作用细化这种对准。

介绍

中心体是动物细胞中的关键微管（MT）成核细胞和组织者(Alberts等人，2002年). 中心柄形成中心体核心，并被包含MT成核因子（如γ-微管蛋白（γtub；Delatter和Gonczy，2004年). 中心体在许多过程中起着关键作用，包括组织有丝分裂纺锤体极(Kellogg等人，1994年)。

在动物细胞中，中心体复制是通过一个保守的周期发生的(Alberts等人，2002年). 它始于有丝分裂后期的中心粒脱离(Kuriyama和Borisy，1981年)然后是S相各中心粒壁上的原中心粒组装。到G2时，细胞包含两个母子中心粒对，在有丝分裂前保持接近。两个中心粒对通过招募PCM和充当MT组织中心（MTOCs）形成功能性中心体，在有丝分裂进入前同步成熟；相反，激活第二个酵母MTOC有10分钟的延迟；Shaw等人，1997年). 中心体随后移动到细胞核的相对侧，以组织纺锤杆和紫菀，根据皮层线索定位纺锤。中心体在动物细胞中的重要作用受到质疑，因为缺乏功能性中心体或完全缺乏中心体的苍蝇可以存活到成年(Megraw等人，2001年；Basto等人，2006年). 然而，并不是所有的动物都很好：这些动物在幼虫神经干/祖细胞（中枢脑成神经细胞）的分裂方面存在缺陷。

成人组织干细胞在组织维护/修复中发挥关键作用(Nystul和Spradling，2006年). 在每个分裂中，子代的命运不同：一个保留干细胞特征，另一个分化。黑腹果蝇中枢脑神经干细胞是胚胎后组织干细胞不对称分裂的极好模型(萨沃扬和里德，2002年；Siller等人，2005年). 胚胎和幼虫NB都是极化细胞，表现出严格的分裂模式，对其作为干细胞的作用至关重要。与胚胎NB分裂轴和邻近上皮之间的精确关系不同，幼虫中枢脑NB(图1 A)与整个大脑相比，似乎没有特定的方向(图1 B). 然而，每个NB都创造了一个更简单的微环境(图1 C)：NB及其神经节母细胞（GMC）子代。NB分裂不对称，NB子代保留干细胞特征，而GMC子代继续分化。国家银行根据严格的当地规则进行划分；每个GMC出生于前一个GMC附近(图1 E和视频1，网址为http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200612140/DC1；Akong等人，2002年)，在NB的一侧创建GMC盖(图1、C和D)。

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NB MTOC异步形成。（A） 卡通。（B–E）中枢脑中的NB/GMC（B）、特写（C和E）和卡通（D）。（B和C）黄芩苷。（E） 两个细胞周期的肌动蛋白-GFP；显示连续GMC的位置（彩色）。黄点代表假设的MTOC。（F和G）GFP-G147 NBs。（F） GMC用虚线表示。显示了整个单元的最大密度投影。单一MTOC到期并形成MT篮子（0:00；箭头）。第二个MTOC出现在细胞核的另一侧（1:45；箭头）并成熟（4:35）。小图像显示主要MTOC（顶部）和第二MTOC（底部；星号）。（G） MTOC成熟的结束视图，z堆栈的三个部分。主导MTOC贯穿始终（顶部，箭头）。第二个MTOC出现（7:74；箭头）。虚线表示NB的底部。（H） EB1-GFP。出现第二个形核中心（1:09；箭头）。（一） 第二个MTOC相对于主要MTOC出现的位置。时间显示为h:min（E）和min:s（F–h）。棒材，10μm。

尽管不同的命运分配在干细胞中是至关重要的，但关于如何建立定型的分裂轴，我们还有很多要学习的。NBs必须协调皮层和纺锤体的极性，以便将神经决定因素打包到分化的子代中(Yu等人，2006年). 影响极性或星状MT皮层相互作用的突变导致不对称分裂缺陷(Yu等人，2006年). 由于缺乏中心粒（14%对称分区；Basto等人，2006年)或缺乏PCM的突变株(无星的[asl公司]或中心体蛋白[美国有线电视新闻网])几乎没有星体MT(Giansanti等人，2001年；Megraw等人，2001年). 因此，纺锤体、星体MT和皮层极性线索之间的适当相互作用有助于维持恒定的分裂轴。先前的分析表明，NB纺锤在前期形成时已经大致与最终分裂轴对齐(Siller等人，2006年)但没有定义初始轴的形成方式。

在这里，我们讨论这个模型干细胞如何维持一个持续的分裂轴。D.黑腹果蝇男性生殖系干细胞也有一个持续的分裂轴。有人提出，一个中心体通过MT-粘附连接相互作用在皮质上锚定(Yamashita等人，2003年). 为了测试NB中是否存在类似的机制，我们使用4D或5D旋转圆盘共焦显微镜对没有物理变形的大脑进行了中心体循环分析（图S1 a，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200612140/DC1)保持NB形状以复制正常有丝分裂。

结果和讨论

NBs在有丝分裂进入期间产生第二个活性MTOC

在前期，NB包含两个几乎完全分离并沿NB/GMC轴对齐的MTOC(Siller等人，2006年)，但对固定NB的分析显示，在有丝分裂进入前，单个MTOC位于GMCs对面(Ceron等人，2001年). 因此，我们研究了MTOC在整个细胞周期中的行为，作为一种初步方法来测试这样的假设：通过连续分裂固定一个MTOC的位置有助于确保持续的纺锤取向。我们分析了表达GFP-G147（一种MT相关蛋白）的活NB(Morin等人，2001年)揭示了MTOC活动的显著时间差异。在间期，单个可检测的MTOC持续存在于前一分裂位点的对面；我们将其称为主要的MTOC。当NB接近有丝分裂时，MTOC增加活性（成熟；根据大小和MT荧光强度经验判断），在细胞核周围形成MT篮(图1、F和G，0:00，箭头；以及视频2和3，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200612140/DC1). 我们称之为前期；这一阶段也见于微管蛋白染色的固定样品（图S1 B）。不久之后，在占主导地位的MTOC完全成熟之前，发生了惊人的事情：第二个MTOC似乎与第一个相去甚远(图1 F，1:45，箭头；和视频2）。我们将此称为第二次MTOC，此阶段称为前期发作。第二个MTOC增加活性，在核膜破裂前约10分钟成熟（NEB；图1 F, 1:45–13:24). 使用4D成像，我们排除了第二个MTOC早期出现在另一焦平面的可能性。为了进一步评估这一点，我们想象了在(图1 G和视频3）。很明显，第二个MTOC并不是从占主导地位的MTOC中产生的(图1 G，顶部）或围绕原子核运动(图1 G，中间）。相反，第二个MTOC似乎与占主导地位的MTOC大致相反(图1 G，底部，箭头；与主核132±38°，以核的质心为固定基准；n个= 30;图1 I，前期）。MTOC立即开始分离，通过NEB，它们相距146±20°(n个= 18,图1 I; 这比我们看到的略少Siller等人，2005年[171°]，可能是因为不同的测量方法）。因此，NB形成两个不同的MTOC：一个MTOC持续存在于前一分裂，另一个仅在有丝分裂进入时激活。

NBs中一种新的中心体循环

第二个MTOC的远程激活引发了关于中心体循环的问题。一种可能性是NBs有两个MT成核中心体，但只有一个可以保留MT并在间期充当MTOC，而第二个在有丝分裂进入期间获得MT保留能力，这解释了第二个MTOC的突然出现。这方面有先例：小鼠L929细胞有两个携带γ管的中心体，可以使MT成核，但只有一个含有Ninin，可以保留MT形成MTOC(Piel等人，2000年)。

为了在NB中测试这个假设，我们使用EB1-GFP。这结合了生长的MT+末端，并可靠地确定了MT成核位点(Mimori-Kiyosue等人，2000年；Piehl等人，2004年). 相间和相前只有一个成核位点(图1 H，箭头；0:00; z系列未描述），新的成核位置出现在距离第一个成核位置较远的地方(图1 H，箭头），与时空上不同的第二次MTOC激活一致。因此，NB调节MT成核，而不仅仅是MT保留。

为了研究新的成核中心是如何形成的，我们使用PCM蛋白GFP-Cnn成像中心体(梅格劳等人，2002年). NB在间期包含单个可检测的中心体(图2 A, 0:51–2:36). 当NB重新进入有丝分裂时，第二个Cnn阳性中心体出现在第一个中心体的远处(图2 A，2:36，蓝色箭头），模拟激活第二个MTOC。为了验证这些同时发生，我们对表达mCherry-Tubulin（chTub）和GFP-Cnn的NB进行了成像(图2 B和图S2 B，网址为http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200612140/DC1). 这揭示了第二中心体的出现和第二MTOC的激活之间完美的时间和空间相关性(图2 B，箭头）。我们从未见过两个中心体/MTOC的物理分离(n个> 60). 据我们所知，这是第一个非同步且在物理上距离遥远的中心体成熟的例子，表明NB使用了一个新的中心体外循环。

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NB中心体的分化成熟。（A） 一个细胞周期的GFP-Cnn。显性中心体用红色箭头表示。PCM在有丝分裂退出期间减少，并在前期积累。GMC中心体完全失去PCM（绿色箭头）。第二中心体看起来离主要中心体很远（蓝色箭头）。星号突出显示了第二中心体的外观。（B） GFP-Cnn，chTub公司。箭头表示优势中心体。箭头表示第二中心体。插图显示GFP-Cnn，PCM分裂。时间显示为h:min.Bars，10μm。

高时间/空间分辨率成像显示，在有丝分裂退出过程中两个GFP-Cnn点分离(图2 B，插图；和视频5，网址为http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200612140/DC1). 一个GFP-Cnn斑点作为NB间期中心体持续存在，形成主要的MTOC，而另一个斑点消失。持久性Cnn斑点（中心体）在间期中保持相对稳定（参见显性中心体预测纺锤体排列），这与通过锚定显性中心体来在间期开始粗纺锤体对齐的假设一致(图2 A，0:00–2:48，红色箭头）。

NB子细胞在PCM保留方面存在差异

我们还检测了两个女儿（新NB和GMC）的中心体命运。与哺乳动物细胞相比，它们在PCM保留方面存在显著差异，哺乳动物细胞的两个子细胞的中心体都保留PCM。GMC中心体脱落所有PCM(图2 A，0:27–0:51，绿色箭头；中心粒仍然存在[见不对称中心体调节]；GMCs在再次有丝分裂时重新获得PCM，Ceron等人，2001年). 新的NB中心体（成为主要的MTOC）在整个相间保留PCM(图2 A，0:27–0:51，红色箭头），并在下次有丝分裂期间进一步积累PCM(图2 A，1:39–2:36，红色箭头和图S2 A）。GMCs中PCM的完全脱落似乎是大多数苍蝇细胞中间期中心体的正常行为(Cottam等人，2006年; 而在合胞体早期胚胎中，两个女儿在整个细胞周期中都保留PCM病灶。与这两种细胞类型相比，NB子代表现出不同的PCM保留。

我们的数据表明，NB具有一个新的中心体周期，其中第二中心体在远离主要中心体/MTOC的地方成熟。解释这一现象的一个假设是差异调节的中心粒的远端定位，该中心粒被阻止在间期募集PCM，因此在有丝分裂期间“激活”之前不能形成MTOC。如果这个中心粒总是由GMC遗传，它也可以解释当GMC退出有丝分裂时PCM完全丢失。

差异中心粒运动

我们使用中心粒标记GFP-PACT检测了中心粒的活性来验证这个假设(Martinez Campos等人，2004年)和组蛋白-GFP(图3 A). 晚期母女中心粒脱离(图3 A, 0:24; 和图S1 C），如哺乳动物细胞和苍蝇胚胎(Kuriyama和Borisy，1981年；Piel等人，2000年). 因此，尽管只有一个MTOC，但整个间期仍存在两个NB中心粒。

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NB中心粒在行为和调节上有所不同。NB在A、B、E和F中列出。图像中的蛋白质显示在每个图上。图像以相反的对比度显示。（A） 中心柄分开（每个由箭头或箭头指示；0:24；插图突出显示分隔）。一个相对静止（箭头），另一个移动到原子核的另一侧（箭头）。（A′）该图显示了A的中心粒路径。（B）中心粒在末期分裂；一个与相关的MT（箭头）保持静止，另一个失去MT并围绕原子核移动（箭头）。（C和D）固定NB。显示了DPLP和MT（C）或γ管（D）。（C） 前置酶NB。一个中心粒位于MT aster（箭头）的中心，而另一个没有相关的MT（箭头）。星号显示相邻细胞中的中心粒，通过最大强度投影显示为NB。（D） 只有远离GMC帽的中心粒有γ槽（箭头）。GMC中心粒缺少γ槽（黄色箭头）。（E和E′）有丝分裂进入：前期显性中心粒有Polo（箭头），第二个无（箭头）。（0:04）前期；第二个中心粒开始获得Polo（箭头）。NEB之后，马球移动到动粒（0:21–0:35；红色箭头）。（F） 有丝分裂退出：NB在从末期到间期的显性中心粒上保留Polo（0:00-1:36；黑色箭头）。波罗也处于终末期的中体（蓝色箭头）。时间显示为h:min.Bars，10μm。

然后这两个中心粒表现出不同的行为。其中一个保持相当稳定(图3 A，箭头），而第二个大致移动到细胞核的另一侧（箭头）。脱离与Cnn点的分离密切相关(图2 B)这表明，固定中心粒保留了PCM，形成了主要的MTOC，而移动中心粒则完全脱落了PCM。为了测试这一点，我们对表达chTub和GFP-PACT的NBs进行了成像(图3 B和视频6，网址为http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200612140/DC1). 固定中心粒保留了MT(图3 B箭头），而活动中心粒没有（箭头）。在重新进入有丝分裂后，活动中心粒恢复成核活性，形成第二个MTOC。

这表明组织纺锤体的MTOC的完全分离是双相的。它开始于相间，当一个中心粒保留PCM，保持静止，并形成主导的MTOC，而第二个中心粒脱落PCM并变得可移动。相间第二中心粒远离主MTOC的运动约占70%（132/180°；图1 I)形成纺锤所需的分离。迁移中心粒的机制尚待确定，但它是非随机的，因为在26/30个NB中，第二个MTOC从主要的MTOC中出现≥90°(图1 I). 在第二个MTOC被激活后，这两个模块将最后30%分离，很可能是通过MT滑动力。这可能解释了无脑症1突变体，其中MTOC在NEB仅相隔124°(Siller等人，2005年). 也许相间中心粒运动是正常的，但基于MTOC的分离是有缺陷的。

不对称中心体调节

这些数据表明，NB在同一细胞质内对其两个中心粒的活性进行不同的调节。有趣的是，在受精后有三个中心体的蛤卵中也有类似的观察结果。精子中心体功能失活，而女性中心体组织减数分裂纺锤体(吴和宫殿，1999年)。

接下来我们研究了NB中心体调控。在前期，一个中心粒（以抗DPLP标记；图S1 C）形成了主要的MTOC(图3 C，箭头），而第二个中心粒没有相关的MT，并且是随机定位的(图3 C，箭头），确认我们的实时数据。因此，我们检查了γtub是否被不对称招募。固定期前NB有两个中心粒；只有与GMC相对的地方积累了γ管(图3 D; GMC中心粒均未携带γ管[黄色箭头]，这与相间GMC中的完全Cnn损失一致）。此外，γtub和Cnn均不存在于间期/预期中距离GMC最近的NB中心粒中（图S2 C）。

Polo激酶通过在有丝分裂进入过程中促进γtub募集来促进中心体成熟(格洛弗，2005年). 马球定位/活动的差异可能是NB中心体成熟时间差异的基础。我们检测了表达Polo-GFP和中心粒标记mCherry-DSAS-6的NBs(Dammermann等人，2004年). 只有形成显性中心体的中心粒对在发育前期呈Polo-GFP阳性(图3E，箭头）。随着NB进入有丝分裂期，Polo-GFP在活动中心粒对上积累(图3，E和E′，箭头；和视频7，网址为http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200612140/DC1)，在前期两个中心粒对上增加，然后转移到动粒(Moutinho-Santos等人，1999年). 当我们在退出有丝分裂的细胞中成像Polo-GFP时，我们可以看到它在显性中心体上保持在低水平(图3 F和图S2，D–G）。未来，研究另一个中心体调节器Aurora A的定位将是一件有趣的事情。

与哺乳动物母亲中心粒的远端附件不同，苍蝇母亲和女儿中心粒没有已知的超微结构(Callaini和Riparbelli，1990年)或分子差异。我们的数据表明存在差异。这种差异调节不太可能是位置的结果，因为两个中心粒在分离后最初是相邻的。这种差异可能是由于中心粒年龄或原中心粒成熟状态所致。

优势中心体预测主轴对齐

NB主轴主要由NEB校准(Siller等人，2006年). 基于我们的数据，我们检验了优势中心体有助于在前期定义一个纺锤体极的假设。我们计算了主要中心体/MTOC轴之间的角度(图4 A，顶部）和后期轴（底部），使用核质心作为固定参考。这揭示了定义未来主轴的两个阶段。在前期开始时，主要中心体保持相对稳定，大致与GMC相对(图4 B，粗对齐），与固定图像一致(Ceron等人，2001年)而第二个中心粒移动到远端位置（在46±33°范围内[n个=25]后期轴；图4 B，前期）。这与我们的假设一致。优势中心体可能因aster–cortex相互作用或缺乏主动置换机制而被固定。在第二阶段，在前中期和前中期对排列进行细化（NB中心体和后期轴之间的夹角从31±29°减小到15±12°；n个=15），如所示Siller等人（2006年）。

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主轴对准的两个阶段。（A） 显示测量角度的卡通。（B） 中心体位置相对于分裂轴后期开始。绿色圆圈表示主要中心体，蓝色圆圈表示第二中心体。在1/25个NBs中，前期优势中心体（深绿色）位于细胞核的GMC侧；其第二中心体显示为深蓝色。测量使用Cnn（蓝色；相间和前期）或MT（粉红色）。（C） 示例视频剧照。黄线表示后置轴。（D） 显示中心体/中心粒循环的卡通。时间显示为h:min.Bar，10μm。

为了进一步测试锚定主要中心体是否有助于大致对齐纺锤体，我们成像了asl公司变异NB存活。它们缺乏功能性中心体(Giansanti等人，2001年; 图S3 A，网址：http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200612140/DC1)突变NB缺乏显性的间期中心体，使我们能够评估其在纺锤体定向和不对称细胞分裂中的作用。实时成像显示，染色质介导的MT成核和纺锤体组装能力强，纺锤体形成相当正常(图5 A和视频9）。纺锤极出现在染色体附近一个杂乱无章的MT阵列中，随着纺锤的延长而集中。纺锤体在形成过程中不旋转，总是沿着初始极分离轴形成，但在中期（23±15°；n个=11），表明旋转可以在没有星体MT的情况下发生，或者asl公司突变体具有足够旋转的简化星体阵列(图5 A). 令人惊讶的是asl公司突变体通常产生相邻或近相邻的子代(n个= 5/5;图5 B和视频10），如野生型(图1 E). 然而，在少数情况下，纺锤形结构平行于GMC帽，并且可能平行于极性轴（2/13；～15%）；这些NB对称划分(图5 C). 这表明，主轴对准的第二阶段可以在没有主要中心体的情况下进行，只要不太极端，就可以挽救失准，但偶尔会出现非典型对称分裂。这导致大脑解剖结构缺陷，异位成对，较小的NB，可能是对称分裂的后代（图S3 B）。

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功能性中心体确保了高保真的分裂不对称性。（A–C）GFP-G147英寸asl公司（A）染色体诱导纺锤体组装（0:01–0:09）。缺少初始主轴对齐，但会进行优化（0:09–0:12）。（B） 两轮有丝分裂。GMC出生于彼此相近的地方。箭头表示第一个女儿。（C） 例如，初始主轴对准远离NB-GMC轴，导致对称分割。（D） 主导相间MTOC重要性的力学模型。（E） 假设情况：中心体在典型周期中同步成熟。（F） 没有中心体的分裂。磅符号表示数字来自末期NB的固定分析(Giansanti等人，2001年). 时间显示为h:min.Bars，10μm。

新型中心体循环有助于确保主轴位置的保真度

我们的数据揭示了这种干细胞模型中不对称分裂的两个新方面。首先，细胞可以调节典型中心体周期，以允许新的细胞行为，正如在蛤蜊减数分裂期间观察到的那样(吴和宫殿，1999年). 中枢神经束也会改变这个周期：而不是中心体在同步性和接近性中成熟(图5 E)，两个中心粒对受到不同的调节，不同步地成熟，并且彼此相距遥远(图5D). 一种在整个细胞周期中保持MT成核活性，在间期形成主要的MTOC，而另一种最初不活跃，只在有丝分裂进入时形成功能性中心体和成核MT。一种推测的可能性是，这些是母子中心粒，其中一个优先保留在干细胞中，这一假设现在将得到验证。询问其他干细胞是否使用这种机制也是令人感兴趣的。

其次，我们的数据表明，这种新颖的中心体周期有助于确保高保真的纺锤定位，从而实现不对称分裂(图5D). 我们提出了一个模型，其中NB有丝分裂纺锤体在两个阶段对齐，以确保GMC的子代出生在前一个GMC的旁边。通过将主要的MTOC从上一次分裂限制在相对固定的位置，并将第二个中心粒移动到细胞的另一侧，可以实现大致对齐。当主轴形成时，第二个过程会细化初始对齐。在asl公司突变体，没有中心体，第一个机制是无效的，但第二个机制可以对齐主轴，除非初始对齐严重偏离轴(图5 F). 在泥突变体，中心粒分离必须正常发生，因为前期MTOC几乎完全分离，但纺锤极与皮层极性线索的对齐是有缺陷的(Siller等人，2006年). 正常的两步过程是一个强大的机制，确保成功的不对称分割和可复制的大脑解剖结构。

材料和方法

飞行股票

声母苍蝇是所有免疫染色样本的野生型对照。对于活细胞成像，我们使用了以下菌株：UAS-actin-GFP系统(哈辛托等人，2000年),无人机-GFP-Cnn1(梅格劳等人，2002年),GFP-G147型（GFP标记的MT相关蛋白；Morin等人，2001年),无人机-EB1-GFP（S.Rogers【北卡罗来纳大学教堂山分校】和B.Eaton【德克萨斯大学圣安东尼奥分校】赠送的礼物），GFP-PACT公司(Martinez-Campos等人，2004年)、和Polo-GFP公司(Moutinho-Santos等人，1999年). 我们培育了这种基因型的转基因果蝇UAS-m樱桃-α-微管蛋白和mCherry-SAS-6型通过使用标准的P元素转换(鲁宾和斯普拉德林，1982年). mCherry-α-tubulin（人微管蛋白）是从一个未知表达载体（加利福尼亚州斯坦福大学a.Straight捐赠）中PCR扩增而来，并克隆到pUASg载体中。mCherry-SAS-6（由北卡罗来纳大学教堂山分校G.Rogers产生）在其内源性启动子下表达，并克隆到pCaSpeR4载体中。所有UAS发起人均由Gal4-1407（布卢明顿果蝇库存中心）推动。对于固定样品asl公司突变体，我们鉴定出纯合子asl公司2通过针对塔比上的标记TM6公司平衡器(Giansanti等人，2001年). 用于在asl公司背景，我们产生了基因型的重组体asl公司2，G147/TM6。

完整幼虫脑中NBs的活细胞成像

在施耐德（Schneider）的果蝇培养基（Invitrogen）中用10%FCS解剖爬行三龄幼虫。取出整个大脑，将其前侧朝下（腹侧神经索向上）放置在我们的成像室中（图S1）。大脑被放置在一个玻璃底盘子（MatTek）中的培养基池中央。该介质被卤代烃油700包围，该油支撑着用于密封腔室的玻璃盖玻片。使用安装在显微镜上的横河旋转圆盘共焦仪（PerkinElmer）对样品进行成像（Eclipse TE300；尼康）。它配备了一个行间冷却的电荷耦合器件相机（ORCA-ER；哈马松）、一个z聚焦电机（普瑞尔科学公司）、由Lambda 10-2控制器（萨特仪器）控制的励磁和发射轮以及来自赛姆洛克公司的发射滤波器。使用的目标是100×1.4 NA、60×1.4 NA和40×oil 1.3 NA。使用MetaMorph（Molecular Devices）中的多维采集插件收集4D和5D（x、y、z、时间、波长）视频序列。

NB免疫染色

大脑声母和asl公司2/asl公司2将苍蝇固定在精对苯二甲酸（PTA）中9%甲醛或4%多聚甲醛（PBS+0.1%吐温20+0.2 g/l叠氮化钠）中15 min，封闭在1%正常山羊血清中3 h，并在4°C条件下，用微量离心管将一抗和精对苯甲酸钠中1%正常羊血清染色过夜。在室温下清洗大脑并在二级抗体中孵育2小时。使用以下抗体：E7小鼠抗α-微管蛋白（1:250；发育研究杂交瘤库）、兔抗DPLP（1:1000；Martinez-Campos等人，2004年)、小鼠GTU-88抗γ-微管蛋白（1:500；Sigma-Aldrich）和兔抗GFP（1:750；ab290[Abcam]）。次要抗体为Alexa 488和546（Invitrogen），最终浓度为1:500。

测量中心体和后分离轴之间的角度

对于每个选定的时间点，记录中心体的（x，y，z）坐标。我们还记录了每个时间点的原点坐标，我们将其指定为从间期到NEB的细胞核中心，初中期的染色体质量中心，以及后期开始时略微分离的姐妹染色单体之间距离的一半。在每个时间点，原点被归一化为（0，0，0），中心体坐标被相应地调整。该方法消除了x、y、z台/显微镜漂移的影响。以下方程用于测量两个定义向量（x1，y1，z1）和（x2，y2，z2）之间的角度：点积=（x1×x2）+（y1×y2）+（z1×z2）=L1×L2×cos（θ），其中L，向量长度，等于（x）的平方根2+年2+z（z）2)θ是两个向量之间的夹角。注意，所有测量的角度都与后置向量有关，后置向量总是指定为（x2，y2，z2）向量。

对于相间时间点，我们使用GFP-Cnn(图4 B，蓝色），因为使用MT标记不能总是以高置信度识别间期中心体。我们使用GFP-G147在前期（第二个MTOC的出现）、NEB（荧光涌入细胞核）、初始中期（根据纺锤体形状判断）和后期开始（动粒MT缩短；图4 B，粉红色）。

在线补充材料

视频1显示了野生型NB通过两轮有丝分裂表达actin-GFP。视频2展示了野生型GFP-G147的侧视图——在有丝分裂进入期间表达NB。视频3给出了野生型GFP-G147在有丝分裂进入过程中表达NB的最终视图。视频4显示野生型NB在整个细胞周期中表达GFP-Cnn。视频5显示野生型NB表达的chTub和GFP-Cnn，显示有丝分裂退出时的PCM分裂。视频6显示野生型NB表达的chTub和GFP-PACT。视频7显示野生型NB在有丝分裂进入过程中表达mCherry-SAS-6和Polo-GFP。视频8显示了野生型GFP-G147–在有丝分裂进入和末期表达NB。视频9显示asl公司2，G147纺锤体组装和有丝分裂期间的突变NB。视频10显示asl公司2，G147突变NB通过两轮有丝分裂。图S1提供了样品制备和MT在NB中的分布。图S2显示了CNN和Polo在整个细胞周期中的行为。图S3表明asl公司变异大脑含有多余的中枢神经束。在线补充材料可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200612140/DC1。

补充材料

【补充材料索引】

致谢

我们感谢C.Doe、T.Kaufman、P.Martin、C.Sunkel、M.Gatti和J.Raff提供的试剂；S.Rogers和B.Eaton为未出版的EB1-GFP飞行股票；以及A.Khodjakov、T.Salmon、K.Bloom、S.Rogers和G.Rogers.进行了有益的讨论。

N.M.Rusan由美国癌症协会拨款PF-06-108-CCG支持。这项工作得到了国家卫生研究院拨款GM67236的支持。

在证明中添加注释。在审查这项工作时，发表了两篇相关论文。雷博洛等人（雷博洛，E.，P.Sampaio，J.Januschke，S.Llamazares，H.Varmark和C.Gonzalez），2007年。开发单元。12:467–474）也在果蝇属成神经细胞和Yamashita等人（YamashitaY.M.、A.P.Mahowald、J.R.Perlin和M.T.Fuller，2007）。科学。315:518–521）研究另一个中心体果蝇属干细胞模型，雄性生殖系干细胞。

笔记

本文中使用的缩写：GMC，神经节母细胞；MT，微管；MTOC，MT组织中心；NB，神经母细胞；NEB，核膜破裂；PCM，近心点材料。

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文章来自细胞生物学杂志由以下人员提供洛克菲勒大学出版社